本发明属于生物体外诊断技术领域，具体涉及一种治疗小脑萎缩的再生修复细胞的制备方法。
背景技术：
进入新世纪，我国的老龄化问题日见突出，一些老年性疾病开始增多，小脑萎缩就是其中之一，目前的治疗手段主要还是药物治疗，采用干细胞治疗小脑萎缩的案例较少，多数采用的是细胞移植，目前还没有采用纯化细胞直接给病人注射的治疗方法。
技术实现要素：
针对上述技术问题，本发明的目的是提供一种治疗小脑萎缩的再生修复细胞的制备方法。
本发明的技术方案如下：
一种治疗小脑萎缩的再生修复细胞的制备方法，包括如下步骤：
步骤A，制备间充质干细胞：通过选择良好的脐带、剪切、处理组织、消化、分离、培养进行间充质干细胞的制备；
步骤B，细胞的换液：取培养24小时以上的原代细胞按比例加入新的培养液，继续培养；
步骤C，细胞的传代：置显微镜下观察长满单层的细胞，可进行传代，传代之后培养5天，期间换液一次；
步骤D，细胞的扩增：在无菌条件下对步骤C的细胞进行扩增，选出长满致密单层的细胞进行扩增，培养4天收获；
步骤E，收获细胞：在无菌条件下将步骤D扩增后的细胞，消化之后收集到1个离心管中；
步骤F，纯化细胞：在无菌条件下将步骤E收获的细胞，进行离心；
步骤G，分装：在无菌条件下将步骤F离心后的细胞进行分装，制成最终产品。
所述步骤A中的间充质干细胞来源于剖腹产新生儿的脐带，脐带无菌保存于PBS溶液中。
所述步骤B中培养细胞的条件是37℃，5％CO2。
所述步骤C的细胞传代的消化时间是3分钟。
所述步骤F中的纯化细胞是采用高速离心的方法进行细胞纯化。
所述步骤G中的分装细胞按体积分装在EP管中。
本发明的有益效果是按照本发明所述方法制备获得的再生修复细胞的纯度高，杂质少，大大减小了细胞制剂对人体的副作用；从而大大提高了细胞制剂对小脑萎缩病人的疗效，制备方法简单，容易实现，适合小规模治疗，能够通过改变人体内细胞的大环境，提高体内的细胞的质量，使失去活性的细胞获得新的生命。
具体实施方式
下面对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
本发明公开一种治疗小脑萎缩的再生修复细胞的制备方法，包括如下步骤：
步骤A，制备间充质干细胞：通过选择良好的脐带、剪切、处理组织、消化、分离、培养进行间充质干细胞的制备；
步骤B，细胞的换液：取培养24小时以上的原代细胞按比例加入新的培养液，继续培养；
步骤C，细胞的传代：置显微镜下观察长满单层的细胞，可进行传代，传代之后培养5天，期间换液一次；
步骤D，细胞的扩增：在无菌条件下对步骤C的细胞进行扩增，选出长满致密单层的细胞进行扩增，培养4天收获；
步骤E，收获细胞：在无菌条件下将步骤D扩增后的细胞，消化之后收集到1个离心管中；
步骤F，纯化细胞：在无菌条件下将步骤E收获的细胞，进行离心；
步骤G，分装：在无菌条件下将步骤F离心后的细胞进行分装，制成最终产品。
所述步骤A中的间充质干细胞来源于剖腹产新生儿的脐带，脐带无菌保存于PBS溶液中。
所述步骤B中培养细胞的条件是37℃，5％CO2。
所述步骤C的细胞传代的消化时间是3分钟。
所述步骤F中的纯化细胞是采用高速离心的方法进行细胞纯化。
所述步骤G中的分装细胞按体积分装在EP管中。
详细操作方法及步骤如下：
(1)细胞制备：选择良好的脐带：正常剖腹产新生儿脐带一根，放入含有庆大霉素的PBS溶液中备用；剪切：先将脐带取出，用剪刀把脐带剪成几段，用PBS清洗，洗掉血污，反复洗2次，再用眼科剪把脐带切成1～2毫米大小的块，以便于消化；消化：将已剪碎的组织块倒入一个干净的离心管中，其中加入I型胶原酶，胶原酶的体积没过组织块。将其置入37℃摇床中，消化100分钟；离心：消化之后，将含有组织块的离心管放入离心机中，低速(500～1000转/分)离心8分钟。离心之后倒掉上清；培养：用含10％FBS的培养液吹起沉淀，加入到两个T75细胞培养瓶中37℃，5％CO2培养。
(2)细胞换液：培养24小时之后的原代细胞要进行换液，先倒掉培养液，加入新鲜的含有10％FBS的培养液，放37℃，5％CO2培养箱继续培养。
(3)细胞传代：将已培养5天的细胞，从培养箱中取出，将原来的培养液倒掉，加入PBS溶液洗细胞表面，倒掉PBS溶液，加入0.25％的胰酶3ml，消化细胞时间以细胞分裂为准，用PBS液将细胞吹散，放入离心机中1500rpm，5min离心目的去除残留的胰酶，用培养液吹起细胞，制成细胞悬液，吸取一管细胞悬液，放入另一个T75瓶中，就完成一次传代，放37℃，5％CO2培养箱培养。此细胞为P1代细胞。
(4)细胞扩增：取来培养6天的P1代细胞，按照(2)的步骤进行，细胞分装入3-4个T75瓶中，即为P2代细胞，再生修复细胞为P5-P6代细胞，培养方式相同。
(5)细胞收获：当细胞传到P5和P6代的时候就可以收获了；消化：取来细胞倒掉原来的培养液，加入PBS溶液洗细胞表面，倒掉PBS溶液，加入0.25％的胰酶3ml，消化细胞时间大约2-3分钟，待等细胞开始分散就可以吹打了；吹打：吸取PBS溶液，吹打细胞，使细胞分散，制成细胞悬液将细胞悬液放入50ml离心管中备用；离心：将离心管放入离心机中在1500rpm，5min的条件下离心，去除残留的胰酶，弃去上清用PBS溶液吹起细胞，制成细胞悬液。
(6)细胞纯化：先将细胞经过0.22um的晒网过滤，然后进行高速离心，离心转速是2500rpm，10min，纯化后准备分装。
(7)细胞分装：将纯化好的细胞按每2ml一个单位的体积加入到无菌的EP管中，封口贴签。
实施例1
一、细胞制备：
选择良好的脐带：正常剖腹产新生儿脐带一根，放入含有庆大霉素的PBS溶液中备用。剪切：先将脐带取出，用剪刀把脐带剪成几段，用PBS清洗，洗掉血污，反复洗2次，再用眼科剪把脐带切成1～2毫米大小的块，以便于消化。消化：将已剪碎的组织块倒入一个干净的离心管中，其中加入I型胶原酶，胶原酶的体积没过组织块。将其置入37℃摇床中，消化100分钟。离心：消化之后，将含有组织块的离心管放入离心机中，低速(500～1000转/分)离心8分钟。离心之后倒掉上清。培养：用含10％FBS的培养液吹起沉淀，加入到两个T75细胞培养瓶中37℃，5％CO2培养。
二、细胞换液：
培养24小时之后的原代细胞要进行换液，先倒掉培养液，加入新鲜的含有10％FBS的培养液，放37℃，5％CO2培养箱继续培养。
三、细胞传代：
将已培养5天的细胞，从培养箱中取出，将原来的培养液倒掉，加入PBS溶液洗细胞表面，倒掉PBS溶液，加入0.25％的胰酶3ml，消化细胞时间以细胞分裂为准，用PBS液将细胞吹散，放入离心机中1500rpm，5min离心目的去除残留的胰酶，用培养液吹起细胞，制成细胞悬液，吸取一管细胞悬液，放入另一个T75瓶中，就完成一次传代，放37℃，5％CO2培养箱培养。此细胞为P1代细胞。
四、细胞扩增：
取来培养6天的P1代细胞，按照(2)的步骤进行，细胞分装入3-4个T75瓶中，即为P2代细胞，再生修复细胞为P7-P8代细胞，培养方式相同。
五、细胞收获：
当细胞传到P7和P8代的时候就可以收获了。消化：取来细胞倒掉原来的培养液，加入PBS溶液洗细胞表面，倒掉PBS溶液，加入0.25％的胰酶3ml，消化细胞时间大约2-3分钟，待等细胞开始分散就可以吹打了。吹打：吸取PBS溶液，吹打细胞，使细胞分散，制成细胞悬液将细胞悬液放入50ml离心管中备用。离心：将离心管放入离心机中在1500rpm 5min的条件下离心，去除残留的胰酶，弃去上清用PBS溶液吹起细胞，制成细胞悬液。细胞计数：1X106/单位。
六、细胞纯化：
先将细胞经过0.22um的晒网过滤，然后进行高速离心，离心转速是2500rpm，10min，纯化后准备分装。
七、细胞分装：
将纯化好的细胞按每2ml一个单位的体积加入到无菌的针管中。给小脑萎缩病人注射采用腰穿的方法。注射4次之后小脑萎缩患者改善效果一般。
实施例2
一、细胞制备：
选择良好的脐带：正常剖腹产新生儿脐带一根，放入含有庆大霉素的PBS溶液中备用。剪切：先将脐带取出，用剪刀把脐带剪成几段，用PBS清洗，洗掉血污，反复洗2次，再用眼科剪把脐带切成1～2毫米大小的块，以便于消化。消化：将已剪碎的组织块倒入一个干净的离心管中，其中加入I型胶原酶，胶原酶的体积没过组织块。将其置入37℃摇床中，消化100分钟。离心：消化之后，将含有组织块的离心管放入离心机中，低速(500～1000转/分)离心8分钟。离心之后倒掉上清。培养：用含10％FBS的培养液吹起沉淀，加入到两个T75细胞培养瓶中37℃，5％CO2培养。
二、细胞换液：
培养24小时之后的原代细胞要进行换液，先倒掉培养液，加入新鲜的含有10％FBS的培养液，放37℃，5％CO2培养箱继续培养。
三、细胞传代：
将已培养5天的细胞，从培养箱中取出，将原来的培养液倒掉，加入PBS溶液洗细胞表面，倒掉PBS溶液，加入0.25％的胰酶3ml，消化细胞时间以细胞分裂为准，用PBS液将细胞吹散，放入离心机中1500rpm，5min离心目的去除残留的胰酶，用培养液吹起细胞，制成细胞悬液，吸取一管细胞悬液，放入另一个T75瓶中，就完成一次传代，放37℃，5％CO2培养箱培养。此细胞为P1代细胞。
四、细胞扩增：
取来培养6天的P1代细胞，按照(2)的步骤进行，细胞分装入3-4个T75瓶中，即为P2代细胞，再生修复细胞为P5-P6代细胞，培养方式相同。
五、细胞收获：
当细胞传到P5和P6代的时候就可以收获了。消化：取来细胞倒掉原来的培养液，加入PBS溶液洗细胞表面，倒掉PBS溶液，加入0.25％的胰酶3ml，消化细胞时间大约2-3分钟，待等细胞开始分散就可以吹打了。吹打：吸取PBS溶液，吹打细胞，使细胞分散，制成细胞悬液将细胞悬液放入50ml离心管中备用。离心：将离心管放入离心机中在1500rpm，5min的条件下离心，去除残留的胰酶，弃去上清用PBS溶液吹起细胞，制成细胞悬液。细胞计数：1X107/单位。
六、细胞纯化：
先将细胞经过0.22um的晒网过滤，然后进行高速离心，离心转速是2500rpm，10min，纯化后准备分装。
七、细胞分装：
将纯化好的细胞按每2ml一个单位的体积加入到无菌的针管中。给小脑萎缩病人注射采用腰穿的方法。注射4次之后小脑萎缩患者改善明显。
按照本发明所述方法制备获得的再生修复细胞的纯度高，杂质少，大大减小了细胞制剂对人体的副作用；从而大大提高了细胞制剂对小脑萎缩病人的疗效，制备方法简单，容易实现，适合小规模治疗，能够通过改变人体内细胞的大环境，提高体内的细胞的质量，使失去活性的细胞获得新的生命。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。