本发明涉及胶原蛋白的技术领域，具体而言，涉及一种牦牛胶原蛋白的制备方法。
背景技术：
胶原蛋白是生物高分子，是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白，占蛋白质总量的25％～30％，某些生物体甚至高达80％以上。胶原蛋白因具有良好的生物相容性、可生物降解性以及生物活性，因此在食品、医药、组织工程、化妆品等领域获得广泛的应用。比如中国传统的胶原保健品“阿胶”，主要是以驴皮为原料(其实就是驴皮中所含胶原蛋白)，具有较高的滋补保健作用，有中药三宝之一的美誉。
现有技术中，以牦牛为原料来制取胶原蛋白的方法较为复杂。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明一方面在于提供一种牦牛胶原蛋白的制备方法，该制备方法较为简单。
一种牦牛胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：
(1)将牦牛组织粉碎；
(2)将经步骤(1)的牦牛组织进行酶解，得到组织液；
(3)从所述组织液中分离中胶原蛋白液；
(4)将所述胶原蛋白液层析，得到胶原蛋白固体。
进一步地，所述牦牛组织选自牦牛边皮、牦牛蹄、牦牛头皮和牦牛骨中的一种或至少二种。
进一步地，所述粉碎采用组织粉碎机，组织粉碎机的转速为3000～5000rpm，粉碎的温度为-10～0℃，粉碎的时间为5～15min。
进一步地，所述酶解所采用的蛋白酶选自胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶中的一种或至少二种。
进一步地，所述酶解的温度为-10～0℃。
进一步地，所述从所述组织液中分离中胶原蛋白液的方式为离心。
进一步地，所述离心的转速为11000～13000rpm，离心的时间为1～10min。
进一步地，层析的压力为0.08～0.12MPa，层析的温度为-10～0℃
进一步地，所述层析之后还包括干燥，所述干燥采用冷冻干燥。
进一步地，所述干燥的温度为-70～-60℃。
进一步地，所述层析之后还包括干燥，所述干燥的温度为-70～60℃。
本发明的牦牛胶原蛋白的制备方法，首先将牦牛组织粉碎，接着酶解，再从酶解得到的组织液中分离而后纯化，得到胶原蛋白固体，由此使得本发明的制备方法较为简单。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面合实施例来进一步说明本发明的技术方案。
如本文所用，术语：
“一个”、“一种”和“所述”可交换使用并指一个或多个。
“和/或”用于表示所说明的情况的一者或两者均可能发生，例如，A和/或B包括(A和B)和(A或B)；
另外，本文中由端点表述的范围包括该范围内所包含的所有数值(例如，1至10包括1.4、1.9、2.33、5.75、9.98等)。
另外，本文中“至少一个”的表述包括一个及以上的所有数目(例如，至少2个、至少4个、至少6个、至少8个、至少10个、至少25个、至少50个、至少100个等)。
本发明的牦牛胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：
(1)将牦牛组织粉碎；
(2)将经步骤(1)的牦牛组织进行酶解，得到组织液；
(3)从所述组织液中分离中胶原蛋白液；
(4)将所述胶原蛋白液纯化，得到胶原蛋白固体
上述牦牛组织可以为结缔组织，例如可取自牦牛边皮、牦牛蹄、牦牛头皮和牦牛骨中的一种或其任意组合。
为获得较高的胶原蛋白的纯度，在步骤(1)所述粉碎之前还可以对牦牛组织进行脱脂处理。此处，脱脂处理的作用是为了除去牦牛组织中的脂肪。脱脂的方式可以采用碱液，这里碱液有氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、碳酸氢钠溶液或其任意混合液。采用碱液脱脂可采用浸渍的方式，碱液的用量为牦牛组织质量的2～3倍，例如2倍、2.2倍、2.5倍、2.8倍、2.9倍或3倍。碱液的质量浓度为0.5～10wt％，例如0.5wt％、0.55wt％、0.6wt％、1wt％、2wt％、5wt％、5.5wt％、6wt％、8wt％、9wt％、9.5wt％、9.8wt％或10wt％等。浸渍的温度可在室温左右，较好地为25～35℃，例如25℃、26℃、28℃、30℃、32℃、33℃、34℃或35℃等。浸渍的时间可为12～60h，例如12h、13h、15h、20h、24h、30h、36h、48h、54h、58h或60h等。
脱脂处理，除了可采用碱液浸渍的方式，还可采用采用磷脂酶和脂肪酶进行酶解。酶解的转化率较高。本发明不对脂肪酶和磷脂酶的具体种类做特别限定，例如可采用天津诺奥酶制剂有限公司所生产的。
磷脂酶和脂肪酶的用量不做特别严苛的规定，但较好地，磷脂酶可为占待脱脂的油牡丹粕质量的0.3～3‰，例如0.3‰、0.5‰、1‰、1.5‰、2‰、2.5‰、2.8‰或3‰。脂肪酶可占待脱脂的油牡丹粕质量的0.2～2‰，例如0.2‰、0.5‰、1‰、1.5‰、1.8‰、1.9‰或0.2‰。该两种酶过多，不会带来转化率的显著提高；过少则会影响脂类的转化率。
脱脂的酶解的较好的温度为30～40℃，例如30℃、32℃、35℃、38℃、39℃或40℃。于上述酶用量及酶解的温度前提下，酶解的时间为较佳为0.5～5h，例如0.5h、0.75h、1h、2h、3h、4h、4.5h、5h或5h等。
上述粉碎的方式可采用组织粉碎机。组织粉碎机的具体机型可使用公知的型号，于此不详述。组织粉碎机的转速以3000～5000rpm为佳，例如3000rpm、3100rpm、3500rpm、4000rpm、4500rpm、4800rpm、4900rpm或5000rpm等，优选为3800rpm。
粉碎的温度较好地为-10～0℃，例如-10℃、-9℃、-8℃、-5℃、、-4℃、-3℃、-2℃、-1℃或0℃等。于此温度下，粉碎的时间较好地为5～15min，例如5min、6min、8min、10min、11min、13min、14min、15min等，优选为10min等。
上述酶解在加入蛋白酶的情况下进行。此处，蛋白酶是水解蛋白质肽链的一类酶的总称。酶解蛋白可列举出胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶以及其任意组合。酶解的pH可根据这些酶的具体种类来选择，例如对于胃蛋白酶，酶解的pH可为1～2；对于胰蛋白酶，酶解的pH可为7.5～8.5；对于木瓜蛋白酶，酶解的pH可为6～7；对于中性蛋白酶，酶解的pH可为6.8～7.0。
酶解的温度较佳地为-10～0℃，例如-10℃、-9℃、-8℃、-5℃、、-4℃、-3℃、-2℃、-1℃或0℃等，至于酶解的时间可采用本领域通用的时间，或者根据结合实际作调整。
从所述组织液中分离中胶原蛋白液的方式可列举出离心、膜分离、透析方法，优选为离心。这里，离心即离心沉析或离心分离，是指借助离心机等设备可产生相当高的角速度，使离心力远大于重力，于是溶液中的悬浮物便易于沉淀析出：又由于比重不同的物质所受到的离心力不同，从而沉降速度不同，能使比重不同的物质达到分离。膜分离是指利用膜对大分子的截留作用达到分离。膜分离可采用超滤膜(UF)和反渗透膜(RO)。超滤膜是一种孔径规格一致，额定孔径范围为0.01微米以下的微孔过滤膜。在膜的一侧施以适当压力，就能筛出小于孔径的溶质分子，以分离分子量大于500道尔顿(原子质量单位)、粒径大于10纳米的颗粒。其工作原理为：以膜两侧的压力差为驱动力，以超滤膜为过滤介质，在一定的压力下，当原液流过膜表面时，超滤膜表面密布的许多细小的微孔只允许水及小分子物质通过而成为透过液，而原液中体积大于膜表面微孔径的物质则被截留在膜的进液侧，成为浓缩液，因而实现对原液的净化、分离和浓缩的目的。每米长的超滤膜丝管壁上约有60亿个0.01微米的微孔，其孔径只允许水分子、水中的有益矿物质和微量元素通过，而最小细菌的体积都在0.02微米以上，因此细菌以及比细菌体积大得多的胶体、铁锈、悬浮物、泥沙、大分子有机物等都能被超滤膜截留下来，从而实现了净化过程。超滤膜既可以采用无机膜，也可以采用有机膜，无机膜可列举出陶瓷膜和金属膜；有机膜可列举出醋酸纤维素、芳香族聚酰胺、聚醚砜、聚偏氟乙烯等的具体实例。
反渗透膜又称逆渗透，一种以压力差为推动力，从溶液中分离出溶剂的膜分离操作。对膜一侧的料液施加压力，当压力超过它的渗透压时，溶剂会逆着自然渗透的方向作反向渗透。从而在膜的低压侧得到透过的溶剂，即渗透液；高压侧得到浓缩的溶液，即浓缩液。反渗透膜可以为醋酸纤维素，醋酸纤维素又称乙酰纤维素或纤维素醋酸酯，常以含纤维素的棉花、木材等为原料，经过酯化和水解反应制成醋酸纤维素，再加工成反渗透膜，或者可为聚酰胺包括脂肪族聚酰胺和芳香族聚酰胺，如尼龙—4、尼龙—6、尼龙—66膜、芳香族聚酰胺膜。膜材料为芳香族聚酰胺、芳香族聚酰胺—酰肼以及一些含氮芳香聚合物，芳香族聚酰胺膜适应的pH范围可以宽到2～11，但对水中的游离氯很敏感。或者可为复合膜，其是指以上两种材料制成，它是以很薄的致密层和多孔支撑层复合而成。多孔支撑层又称基膜，起增强机械强度的作用；致密层也称表皮层，起脱盐作用，故又称脱盐层。脱盐层厚度可为为30～50nm。此处，透析是指通过小分子经过半透膜扩散到水(或缓冲液)的原理，将小分子与生物大分子分开的一种分离方式。透析可采用透析袋实施。
上述离心的转速可以为11000～13000rpm，例如11000rpm、11100rpm、11500rpm、12000rpm、12500rpm、12800rpm、13000rpm，优选为12000rpm。于此转速下，离心的时间可为1～10min，例如1min、1.5min、2min、3min、5min、6min、8min、9min、9.5min或10min等，优选为5min。
上述纯化的方式为层析。此处，蛋白质层析是指利用蛋白质物理性质的不同，将多组分混合物进行分离。层析可采用凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等。层析可采用蛋白层析仪。蛋白层析仪可采用常用的型号。
层析的压力以0.08～0.12MPa为宜，例如0.08MPa、0.085MPa、0.09MPa、0.10MPa、0.11MPa、0.115MPa、0.118MPa、0.119MPa或0.12MPa等，优选为0.10MPa。于此沉析的压力下，层析的温度为-10～0℃，例如-10℃、-9℃、-8℃、-5℃、、-4℃、-3℃、-2℃、-1℃或0℃等。
层析之后还包括干燥。干燥的方式可采用冷冻干燥。此处，冷冻干燥又称升华干燥，是指将含水物料冷冻到冰点以下，使水转变为冰，然后在较高真空下将冰转变为蒸气而除去。本发明中冷冻干燥可采用真空冷冻干燥。真空冷冻干燥将湿物料或溶液在较低的温度(-10℃～-50℃)下冻结成固态，然后在真空(1.3～13Pa)下使其中的水分不经液态直接升华成气态，最终使物料脱水。当然，干燥还可采用其它公知的方式，如喷雾干燥等，于此略述。
上述冷冻干燥的温度可为-70～-60℃，例如-70℃、-69℃、-68℃、-65℃、、-64℃、-63℃、-62℃、-61℃或-60℃等。
实施例1
步骤一、将牦牛组织(例如牦牛边皮、牦牛蹄、牦牛头皮、牦牛骨等)洗净后，放入组织粉碎机(转速3000rpm rpm，温度-10℃)中进行组织粉碎，粉碎15min，得组织碎末。
步骤二、将组织碎末置于酶解罐中，加入胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶进行酶解反应，得组织液(温度控制在-10℃)；
步骤三、将组织液置于低温高速离心机(转速11000rpm，温度-10℃)中离心，离心10min，得上清液，滤渣另用。
步骤四、将上清液置于蛋白层析仪中(压力0.08MPa，温度-10℃)，得层析液。
步骤五、将层析液置于冻干机中进行干燥(温度-70℃)，得冻干晶体。
步骤六、将晶体称重，分别装于包装容器中，即得牦牛胶原蛋白成品。
实施例2
步骤一、将牦牛组织(例如牦牛边皮、牦牛蹄、牦牛头皮、牦牛骨等)洗净后，放入组织粉碎机(转速5000rpm rpm，温度0℃)中进行组织粉碎，粉碎5min，得组织碎末。
步骤二、将组织碎末置于酶解罐中，加入胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶进行酶解反应，得组织液(温度控制在0℃)；
步骤三、将组织液置于低温高速离心机(转速13000rpm，温度-10℃)中离心，离心1min，得上清液，滤渣另用。
步骤四、将上清液置于蛋白层析仪中(压力0.08MPa，温度-10℃)，得层析液。
步骤五、将层析液置于冻干机中进行干燥(温度-70℃)，得冻干晶体。
步骤六、将晶体称重，分别装于包装容器中，即得牦牛胶原蛋白成品。
实施例3
步骤一、将牦牛组织(例如牦牛边皮、牦牛蹄、牦牛头皮、牦牛骨等)洗净后，放入组织粉碎机(转速5000rpm rpm，温度-10℃)中进行组织粉碎，粉碎5min，得组织碎末。
步骤二、将组织碎末置于酶解罐中，加入胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶进行酶解反应，得组织液(温度控制在0℃)；
步骤三、将组织液置于低温高速离心机(转速113000rpm，温度0℃)中离心，离心1min，得上清液，滤渣另用。
步骤四、将上清液置于蛋白层析仪中(压力0.12MPa，温度0℃)，得层析液。
步骤五、将层析液置于冻干机中进行干燥(温度-60℃)，得冻干晶体。
步骤六、将晶体称重，分别装于包装容器中，即得牦牛胶原蛋白成品。
实施例4
步骤一、将牦牛组织(例如牦牛边皮、牦牛蹄、牦牛头皮、牦牛骨等)洗净后，放入组织粉碎机(转速4000rpm，温度-5℃)中进行组织粉碎，粉碎5min，得组织碎末。
步骤二、将组织碎末置于酶解罐中，加入胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶进行酶解反应，得组织液(温度控制在0℃)；
步骤三、将组织液置于低温高速离心机(转速12000rpm，温度-5℃)中离心，离心5min，得上清液，滤渣另用。
步骤四、将上清液置于蛋白层析仪中(压力0.010MPa，温度0℃)，得层析液。
步骤五、将层析液置于冻干机中进行干燥(温度-70℃)，得冻干晶体。
步骤六、将晶体称重，分别装于包装容器中，即得牦牛胶原蛋白成品。
实施例5
步骤一、将牦牛组织(例如牦牛边皮、牦牛蹄、牦牛头皮、牦牛骨等)洗净后，放入组织粉碎机(转速4000rpm rpm，温度-5℃)中进行组织粉碎，粉碎10min，得组织碎末。
步骤二、将组织碎末置于酶解罐中，加入胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶进行酶解反应，得组织液(温度控制在-5℃)；
步骤三、将组织液置于低温高速离心机(转速12000rpm，温度-5℃)中离心，离心5min，得上清液，滤渣另用。
步骤四、将上清液置于蛋白层析仪中(压力0.10MPa，温度-5℃)，得层析液。
步骤五、将层析液置于冻干机中进行干燥(温度-65℃)，得冻干晶体。
步骤六、将晶体称重，分别装于包装容器中，即得牦牛胶原蛋白成品。
由于本发明中所涉及的各工艺参数的数值范围在上述实施例中不可能全部体现，但本领域的技术人员完全可以想象到只要落入上述该数值范围内的任何数值均可实施本发明，当然也包括若干项数值范围内具体值的任意组合。此处，出于篇幅的考虑，省略了给出某一项或多项数值范围内具体值的实施例，此不应当视为本发明的技术方案的公开不充分。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式选择等，落在本发明的保护范围内。