一种基于磁珠偶联抗体富集并检测样本中miRNA的方法及配套微流控装置与流程

本发明涉及一种富集并检测生物样本中miRNA的方法及配套微流控装置，属于样本中微量或痕量microRNA高灵敏度检测及肿瘤等重大疾病的早期快速诊断技术领域。

背景技术：

MicroRNA (miRNA) 是体内参与转录后基因表达调控的一类非编码RNA，在多种生理和病理过程中发挥着重要的作用。肿瘤细胞和正常组织来源的细胞在miRNA表达谱上具有明显差异，大约50%得到注解的miRNA的基因位于与肿瘤形成相关的脆弱基因位点，这说明miRNA在肿瘤的发生过程中具有十分重要的作用。因此，研究miRNA的种类及含量对我们研究肿瘤的诊断、分类和治疗等都具有十分重要的意义。然而，miRNA的含量很少，仅占总RNA数量的一小部分（约0.01％），而且样本在处理及提取过程中必然会损失一部分miRNA，同时miRNA容易降解，从而给准确定量检测miRNA带来了较大的挑战。鉴于miRNA 易分解且含量较少，因而对miRNA的高效富集对miRNA的精确定量检测就显得尤其重要。目前市面上有多种RNA的抽提试剂盒，能够抽提生物样本内的总RNA，而miRNA的富集提取方法也类似于抽提生物样本的总RNA，但是试剂盒采用的方法常侧重于保留小RNA。近年来研究的通过富集miRNA-蛋白复合物来提取miRNA不失为一种新型方法。

Ago2蛋白是Argonaute蛋白家族的一种，是Argonaute蛋白在进化过程中演变成的一种亚科蛋白，另外几种亚科蛋白为Ago1、Ago3和Ago4。4种Argonaute蛋白可以分别识别不同的小RNA分子并组成RNA诱导沉默复合物（RISC），但目前只有Ago2-miRNA复合物被证明具有对靶标RNA裂解的切割酶活性。根据文献报道，miRNA不止存在于细胞质中，完整的miRNA也可以进入血液和组织液的循环系统内。2011年Jason和其组员发现，血浆中的miRNA多数是与某种蛋白形成复合物而稳定存在，并非如最初所猜测的以囊泡包裹的形式存在。通过进一步研究，他们确定这种与miRNA结合的蛋白就是Argonaute蛋白家族中的Ago2蛋白。并且他们发现用Ago2共沉淀下来的miRNA占血浆总miRNA的大多数，只有很少量的miRNA是被囊泡包裹而存在的。这个结果说明循环miRNA可以以两种形式存在，而Ago2-miRNA复合物形式是血浆中miRNA稳定存在的主要原因。

技术实现要素：

本发明的目的提供一种基于磁珠偶联抗体富集和检测样本中与Ago2结合的miRNA的方法及配套微流控装置。

本发明的具体技术方案是：

一种基于磁珠偶联抗体富集生物样本中miRNA的方法，富集方法包括以下步骤：

（1）将抗Ago2抗体与磁珠连接，得到抗Ago2免疫磁珠。

（2）将抗Ago2免疫磁珠与样品混合，通过抗原抗体免疫反应富集Ago2-miRNA复合物。

进一步的，所述磁珠为具有蛋白亲和力的磁珠。

进一步的，所述抗Ago2抗体为抗Ago2的单克隆抗体或抗Ago2的多克隆抗体。

进一步的，所述步骤（1）所述抗Ago2免疫磁珠制备方式如下：

取所需用量的磁珠，除去原保存溶液；加入PBS缓冲液清洗两次，除去清洗溶液；加入抗Ago2抗体及PBS缓冲液，常温混合孵育一定时间，除去剩余抗体溶液；加入PBST缓冲液清洗两次，除去清洗溶液，重悬所得抗Ago2免疫磁珠并换入新管。

所述步骤（2）所述免疫磁珠富集血清中Ago2-miRNA复合物方法如下：

将步骤（1）所得抗Ago2免疫磁珠与样本混合孵育一定时间；加入PBST缓冲液清洗两次，除去清洗溶液，重悬磁珠并换入新管。

本发明还提供了一种基于磁珠偶联抗体检测样本中miRNA的方法，检测方法包括以下步骤：

（1）将根据权利要求1富集到Ago2-miRNA的免疫磁珠与适量裂解液混合，高温反应一定时间，除去磁珠。

（2）反应完成后将所得的液体进行qPCR检测。

本发明还提供了一种富集样本中miRNA的微流控装置，所述微流控装置制备包括以下步骤：

（1）根据上述磁珠免疫富集方法设计制备微流控芯片模板；

（2）在微流控芯片模板上浇注PDMS聚合物经固化得到PDMS膜；

（3）将PDMS膜与玻璃片进行等离子键合，封装得到所需微流控芯片装置。

上述生物样本包括血液、尿液、唾液、关节滑液或细胞裂解液等。

本发明的优势在于，集合抗原抗体免疫识别与结合的高特异性和高亲和性磁珠分离的简便易操作性以及微流控装置的高效反应和富集等特性，可快速检测生物样本如血液、尿液、唾液、关节滑液以及细胞裂解液等中与疾病特别是肿瘤相关的多种miRNA，对癌症等重大疾病的及早发现和诊断治疗等具有重要意义。

附图说明

图1为富集血清中Ago2-miRNA复合物的Western Blot验证结果。

图2为磁珠富集并qPCR检测血清中与Ago2结合miRNA结果。

图3为微流控装置设计方案及实物图。

图4为微流控富集系统。

图5为微流控系统富集并qPCR检测血清中与Ago2结合的miRNA结果。

具体实施方式

本发明一种基于磁珠偶联抗体富集并检测样本中miRNA的方法，包括以下步骤：

（1）取适量Protein G磁珠，除去原保存溶液，使用PBS缓冲液清洗两次，除去清洗溶液；

（2）使用PBS缓冲液重悬磁珠，并加入适量抗Ago2单克隆抗体，常温孵育一定时间；

（3）在离心管进行富集反应时，使用PBST缓冲液清洗两次，除去多余抗体，并重悬免疫磁珠移入新的离心管；

（4）将免疫磁珠与待测样本混合，常温孵育一定时间；

（5）使用PBST缓冲液清洗两次，除去洗液，并重悬免疫磁珠移入新的离心管；

（6）收集反应后的免疫磁珠，取少量进行洗脱，将洗脱液通过Western Blot实验验证是否富集到Ago2蛋白；余下磁珠经DTT裂解得到miRNA并进行qPCR实验进行定量分析；

（7）根据标准曲线计算裂解液中miRNA的含量，并根据富集样本的体积以及裂解液的体积计算得到样本中miRNA含量。

（8）在利用微流控装置进行富集反应时，结合分离富集方法，设计制备微流控芯片模板；

（9）在微流控芯片模板上浇注PDMS聚合物经固化得到PDMS膜；

（10）将PDMS膜与玻璃片进行等离子键合，封装得到所需微流控芯片装置。

（11）使用PBST缓冲液清洗通道，再使用PBS缓冲液清洗通道，通入封闭液封闭微流控通道表面的活性区域；

（12）将与Ago2蛋白结合的免疫磁珠导入已经使用BSA溶液封闭后的微流控孔道，使用磁铁将磁珠固定于孔道内部；

（13）导入待测样本，使免疫磁珠与样本混合孵育一定时间；

（14）使用PBST缓冲液清洗孔道，再使用PBS缓冲液清洗通道；

（15）除去磁铁，收集免疫磁珠，并使用裂解液进行裂解得到miRNA溶液，后进行qPCR实验；

（16）根据标准曲线计算裂解液中miRNA的含量，并根据富集样本体积以及裂解液体积计算得到样本中miRNA含量。

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不为本发明的限制。在不背离本发明实质的情况下，对本发明步骤或条件有所修改，均属于本发明的范围。

实施例中所用试剂和仪器：抗Ago2小鼠单克隆抗体（ab57113，Abcam，美国）；抗Ago2兔单克隆抗体（ab186733，Abcam，美国）；Protein G磁珠（Invitrogen公司，美国）；Ago2蛋白（北京义翘神州，中国）；有机灌封胶（道康宁，美国），其余试剂均为常规试剂；HulaMixer® Sample Mixer孵育器（Invitrogen公司，美国）。

实施例1——富集血清中Ago2-miRNA复合物并检测miRNA

1 免疫磁珠制备：

1.1 取Protein G磁珠1.5 mg置于2 mL离心管中，利用磁性分离器除去原保存溶液，并使用200 μL PBS缓冲液清洗两次，利用磁性分离器除去清洗溶液；

1.2 使用200 μL PBS缓冲液重悬磁珠，加入8μg抗Ago2兔单克隆抗体，于孵育器上常温孵育15 min；

1.3 使用200 μLPBST缓冲液清洗磁珠两次，每次轻轻振荡1 min，防止磁珠凝结，同时除去多余抗体并移入新的离心管，得到抗Ago2免疫磁珠。

2免疫磁珠富集血清中Ago2-miRNA复合物并检测miRNA（未偶联抗体的磁珠作为阴性对照）

2.1 将抗Ago2免疫磁珠加入1 mL血清样本中，于孵育器上常温孵育60 min，利用磁性分离器除去残余血清，再次加入1 mL血清样本，重复上述操作，共4 mL血清样本，通过抗原抗体免疫反应富集血清中Ago2-miRNA复合物；

2.2使用200 μL PBST缓冲液清洗两次，每次轻轻振荡1 min，防止磁珠凝结，同时除去杂质并移入新管，使用200 μL PBS缓冲液重悬备用；

2.3取上一步中100 μL混合物，利用磁性分离器除去重悬液，加入30 μL洗脱液（10% SDS溶液）常温孵育5 min，除去磁珠并取10 μL洗脱液进行Western Blot实验，验证是否成功富集到血清中的Ago2蛋白；

2.4取剩余100 μL混合物，利用磁性分离器除去重悬液，按照DTT（1 M）与PBS缓冲液比例为1:9加入除菌后的DTT溶液，混匀后在95 ^oC反应10 min，利用磁性分离器除去磁珠得到miRNA溶液；

2.5 取miR-122标准样本，按照同样比例加入DTT（1M）溶液，并在95^oC反应10 min，作为阳性对照；

2.6将得到的miRNA溶液及阳性对照进行qPCR定量分析。

3上述实验中，Western Blot实验结果如图1所示，显示为成功富集到血清中的Ago2蛋白；qPCR实验结果如图2所示，显示为成功检测到富集的与Ago2蛋白结合的miRNA。

实施例2——微流控装置富集血清中Ago2-miRNA复合物并检测miRNA

1 免疫磁珠制备同实施例1。

2 微流控装置制备：

2.1 根据上述磁珠免疫富集方法设计制备微流控芯片模板；

2.2 在微流控芯片模板上浇注PDMS聚合物经固化得到PDMS膜；

2.3 将PDMS膜与玻璃片进行等离子键合，封装得到所需微流控芯片装置（图3，图4）。

3免疫磁珠在微流控平台富集血清中Ago2-miRNA复合物并检测miRNA（未偶联抗体磁珠进行实验作为阴性对照）

3.1 通入1 mL浓度为1%的 BSA溶液流经微流控孔道，流速控制为50 μL/min，封闭微流控通道，防止PDMS膜对蛋白的非特异性吸附；

3.2 使用500 μL PBS缓冲液清洗孔道，流速控制为50 μL/min，除去BSA溶液；

3.3将抗Ago2免疫磁珠导入微流控装置的孔道并利用磁铁使磁珠在通道中固定，导入4 mL血清样本，流速控制为30 μL/min，通过抗原抗体免疫反应富集血清中Ago2-miRNA复合物；

3.4使用500μL PBST缓冲液清洗微流控通道，再使用500 μL PBS缓冲液清洗微流控通道，流速控制为30 μL/min，除去反应后的样本；

3.5按照DTT（1 M）与PBS缓冲液比例为1:9加入除菌后的DTT溶液，除去磁铁，将微流控装置在加热板上95 ^oC反应10 min，使用磁铁固定磁珠于微流控通道内，在出口处收集得到的miRNA溶液；

3.6取miR-122标准样本，按照同样比例加入DTT（1M）溶液，并在95^oC反应10 min，作为阳性对照；

3.7反应结束后将得到的miRNA溶液及阳性对照进行qPCR定量分析。

4上述实验中，qPCR实验结果如图5所示，显示为成功检测到富集的与Ago2蛋白结合的miRNA。