一种人参浆果果胶及其提取方法与流程

本发明涉及人参浆果提取领域，具体而言，涉及一种人参浆果果胶及其提取方法。

背景技术：

人参浆果(Ginseng fruit)是五加科植物人参(Panax Ginseng)的成熟果实。人参浆果为肾形或扁球形，直径5-9mm，鲜红色，内含2颗乳白色种子。气微，味甘，辛。人参浆果是人参的有效药用部位，主要含有人参皂苷、多糖等活性成分。人参浆果多糖与人参浆果生物活性的发挥密切相关，主要由酸性杂多糖组成，药理活性研究主要集中在人参浆果多糖混合物的降血糖、抗氧化和抗衰老、提高免疫力等方面。人参浆果作为人参产业的副产物，其药用和食用价值还未被充分开发。对人参浆果多糖成分进行研究具有重要的意义。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种人参浆果果胶的提取方法，该方法简单便捷，并且收率高，在0.2％以上。

本发明的第二目的在于提供上述提取方法制备得到的人参浆果果胶，该人参浆果果胶主要由半乳糖醛酸、鼠李糖和半乳糖组成，小鼠体内实验表明人参浆果果胶具有免疫调节活性；作为保健食品、普通食品和饮料等的原料或添加剂使用时，具有增强免疫力的功效。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种人参浆果果胶的提取方法，包括以下步骤：

将去籽人参浆果果肉进行水提，过滤得到提取液；

所述提取液浓缩后经醇沉，得到沉淀；

将所述沉淀溶于水，离心，上清液进行离子交换层析，得到的洗脱液经浓缩、透析、干燥得到所述人参浆果果胶。

本发明提供的人参浆果果胶的提取方法，先将人参浆果果肉热水煮提，果肉中大量的果胶溶出，得到提取液，提取液进行醇提，得到的沉淀主要成分为果胶；沉淀再进行离子交换层析，去除杂质，得到人参浆果果胶。该方法通过逐步提取和纯化，得到人参浆果果胶，该人参浆果果胶具有很好的免疫调节活性。另外，按果肉的重量计，人参浆果果胶收率达到0.2％以上，提取收率高。

本发明中，人参浆果采用揉搓的方式去籽后得到的人参浆果果肉进行水提。

优选地，所述水提为：

所述果浆中加4-6倍体积的水，煮提1.5-2.5小时后用四层100目纱布过滤，得到第一滤液和滤渣；

所述滤渣加水，重复上述步骤煮提1-2次，过滤得到第二滤液；

所述第一滤液与所述第二滤液混合即得所述提取液。

通过多次煮提，使人参浆果的果胶充分溶出，利于后续提取和纯化。

为了便于后续醇沉，优选地，所述提取液浓缩至所述提取液体积的8％-15％。

为了醇提得到的多糖杂质含量少，优选地，所述提取液浓缩后先离心，得到的上清液进行醇沉。

进一步地，所述醇沉条件为：所述上清液加入3-5倍体积的无水乙醇，离心得所述沉淀。

得到的沉淀即为人参浆果总多糖。将得到的沉淀低温冷冻干燥后测定其组分，人参浆果总多糖分子量分布较广，其中中性糖级分分子量较大，酸性糖级分分子量较小，具体地，人参浆果总多糖中人参浆果单糖组成为半乳糖(51.1％±6.2％)、半乳糖醛酸(17.9％±3.2％)、阿拉伯糖(16.8％±2.5％)、鼠李糖(5.2％±0.9％)、葡萄糖(5.4％±0.8％)、甘露糖(2.4％±0.6％)、葡萄糖醛酸(1.3％±0.4％)。并经测定，以人参浆果果肉计，人参浆果总多糖的得率在0.8％-1.2％之间。

优选地，所述离子交换层析所用的填料为DEAE-纤维素或DEAE-Sepharose Fastflow，所用洗脱液为蒸馏水和0～1M NaCl溶液，所述洗脱液的体积均为柱体积的2-4倍。经验证，这两种填料能很好的去除杂质。

为了防止填料对待层析的成分有影响，优选地，所述离子交换层析填料在使用前还经过以下处理：

所述填料为DEAE-纤维素，所述DEAE-纤维素依次采用以下预处理：用蒸馏水充分浸泡后，再用0.48-0.52M氢氧化钠浸泡1小时，蒸馏水洗至中性，0.48-0.52M盐酸浸泡1小时，蒸馏水洗至中性；

所述填料为DEAE-Sepharose Fastflow，所述DEAE-Sepharose Fastflow依次采用以下预处理：凝胶中加入1.8-2.2倍体积蒸馏水，静置分层后倒掉浮胶和碎胶，筛选至无浮胶或碎胶出现；

将填料装入层析柱中，依次用1.8-2.2倍柱体积水、1.8-2.2倍柱体积1.8-2.2M NaCl、1.8-2.2倍柱体积水洗脱，除去柱中的杂质。

另外，为了达到较好的纯化效果，每克待分离样品所需的层析柱中的填料为70-100g。

为了达到更好的纯化效果，进一步地，所述沉淀溶于水的步骤中，所述沉淀与所述水的比例为1:5-10(g：mL)。

得到的洗脱液还需经过浓缩和透析，通过透析将特定分子量的目标产物进行收集。进一步地，所述透析截留的分子量大小为3500Da以上。即得到的目标产物的分子量大于3500Da。

得到的目标产物干燥后采用高效液相色谱法测得人参浆果果胶的单糖组成为半乳糖醛酸(35.6％±5.0％)、鼠李糖(15.8％±2.8％)、半乳糖(39.6％±3.1％)、阿拉伯糖(9.0％±1.2％)。

本发明还提供了上述提取方法制得的人参浆果果胶。

经试验验证，本发明提供的人参浆果果胶的小鼠体内实验表明人参浆果果胶具有免疫调节活性，能够提高小鼠淋巴细胞增殖能力、巨噬细胞吞噬能力和NO生成能力；可作为保健食品、普通食品和饮料等的原料或添加剂使用，具有增强免疫力的功效。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明提供的人参浆果果胶的提取方法，得到的人参浆果果胶具有很好的免疫调节活性，另外，按果肉的重量计，人参浆果果胶收率达到0.2％以上，提取收率高。

(2)本发明还限定了提取过程的具体参数，以增加提取物成分以及收率的稳定性。

(3)本发明提供的人参浆果果胶经小鼠体内实验表明人参浆果果胶具有免疫调节活性，能够提高小鼠淋巴细胞增殖能力、巨噬细胞吞噬能力和NO生成能力；可作为保健食品、普通食品和饮料等的原料或添加剂使用，具有增强免疫力的功效。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明实施例1中人参浆果总多糖在Sepharose CL-6B分析柱上的峰图；

图2为本发明实施例1中的人参浆果总多糖经离子交换层析柱的洗脱图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

人参浆果果胶的提取方法，包括以下步骤：

1.人参浆果去籽，留果肉，加入5倍体积蒸馏水，煮提2小时后过滤；残渣继续加入蒸馏水，煮提两次；合并过滤后的提取液，浓缩至提取液体积的1/10；

2.浓缩后的提取液离心，弃沉淀，上清加入4倍体积无水乙醇，离心得沉淀，沉淀低温冷冻干燥后得到人参浆果总多糖；

人参浆果总多糖分子量分布较广，其中，中性糖级分分子量较大，酸性糖级分分子量较小，在Sepharose CL-6B分析柱上呈现不均一的峰，具体如图1所示；

高效液相色谱法测得人参浆果总多糖中人参浆果单糖组成，组成为：半乳糖(51.1％)、半乳糖醛酸(17.9％)、阿拉伯糖(16.8％)、鼠李糖(5.2％)、葡萄糖(5.4％)、甘露糖(2.4％)、葡萄糖醛酸(1.3％)；

按人参浆果果肉的重量计，人参浆果总多糖的收率为1.1％；

3.对离子交换层析填料进行以下前处理，步骤如下：

DEAE-Sepharose Fastflow凝胶中加入2倍体积蒸馏水，静置分层后倒掉浮胶和碎胶，筛选至无浮胶或碎胶出现即可；

将填料装入层析柱中，15g待分离样品约需1L左右的层析柱进行纯化，离子交换层析柱装好后，需依次用2倍柱体积水、2倍柱体积2M NaCl、2倍柱体积水洗脱，除去柱中的离子等杂质之后上样；

4.制得的人参浆果总多糖溶于蒸馏水，人参浆果多糖与水的重量比为1:10，离心，得到的上清液上离子交换层析柱；

离子交换层析柱所用洗脱液为蒸馏水和0～1M NaCl溶液，洗脱体积均为柱体积的2倍；

收集NaCl溶液洗脱级分，洗脱图见图2。水洗部分为中性糖，盐洗级分为含有半乳糖醛酸的果胶级分。

收集的洗脱液经浓缩、透析(Mw＝3500Da)、减压干燥，得到人参浆果果胶。

按人参浆果果肉的重量计，人参浆果果胶的收率为0.22％。

实施例2

人参浆果果胶的提取方法，包括以下步骤：

1.人参浆果去籽，留果肉，加入4倍体积蒸馏水，煮提1.5小时后过滤；残渣继续加入蒸馏水，煮提两次；合并过滤后的提取液，浓缩至提取液体积的8％；

2.浓缩后的提取液离心，弃沉淀，上清加入3倍体积无水乙醇，离心得沉淀；

人参浆果总多糖分子量分布较广，其中中性糖级分分子量较大，酸性糖级分分子量较小，在Sepharose CL-6B分析柱上呈现不均一的峰；

高效液相色谱法测得人参浆果总多糖中人参浆果单糖组成，与实施例1基本一致；

按人参浆果果肉的重量计，人参浆果总多糖的收率为0.85％；

3.对离子交换层析填料进行以下前处理，步骤如下：

DEAE-纤维素：蒸馏水充分浸泡后，0.48±0.02M氢氧化钠浸泡50-70min，蒸馏水洗至中性；0.48±0.02M盐酸浸泡50-70min，蒸馏水洗至中性；处理好的DEAE-纤维素待用；

将填料装入层析柱中，15g待分离样品约需1L左右的层析柱进行纯化，离子交换层析柱装好后，需依次用1.8倍柱体积水、1.8倍柱体积2M NaCl、1.8倍柱体积水洗脱，除去柱中的离子等杂质之后上样；

4.人参浆果总多糖溶于蒸馏水，人参浆果多糖与水的重量比为1:5，离心，得到的上清液上离子交换层析柱；

离子交换层析柱所用洗脱液为蒸馏水和0～1M NaCl溶液，洗脱体积均为柱体积的1.8倍；

收集NaCl溶液洗脱级分，收集的洗脱液经浓缩、透析(Mw＝3500Da)、减压干燥，得到人参浆果果胶。

按人参浆果肉重量计，人参浆果果胶的收率为0.2％。

实施例3

人参浆果果胶的提取方法，包括以下步骤：

1.人参浆果去籽，留果肉，加入6倍体积蒸馏水，煮提2.5小时后过滤；残渣继续加入蒸馏水，煮提1次；合并过滤后的提取液，浓缩至提取液体积的15％；

2.浓缩后的提取液离心，弃沉淀，上清加入5倍体积无水乙醇，离心得沉淀；

人参浆果总多糖分子量分布较广，其中中性糖级分分子量较大，酸性糖级分分子量较小，在Sepharose CL-6B分析柱上呈现不均一的峰；

高效液相色谱法测得人参浆果总多糖中人参浆果单糖组成，与实施例1基本一致；

按人参浆果果肉的重量计，人参浆果总多糖的收率为1.2％；

3.对离子交换层析填料进行以下前处理，步骤如下：

DEAE-Sepharose Fastflow凝胶中加入2±0.2倍体积蒸馏水，静置分层后倒掉浮胶和碎胶，筛选至无浮胶或碎胶出现即可；

将填料装入层析柱中，15g待分离样品约需1L左右的层析柱进行纯化，离子交换层析柱装好后，需依次用2.2倍柱体积水、2.2倍柱体积2M NaCl、2.2倍柱体积水洗脱，除去柱中的离子等杂质之后上样；

4.人参浆果总多糖溶于蒸馏水，人参浆果多糖与水的重量比为1:8，离心，得到的上清液上离子交换层析柱；

离子交换层析柱所用洗脱液为蒸馏水和0～1M NaCl溶液，洗脱体积均为柱体积的2.2倍；

收集NaCl溶液洗脱级分，收集的洗脱液经浓缩、透析(Mw＝3500Da)、减压干燥，得到人参浆果果胶。

按人参浆果肉重量计，人参浆果果胶的收率为0.24％。

实验例1

将实施例1-3制得的人参浆果总多糖和果胶进行免疫活性检测。

试验动物：

雄性ICR小鼠(20±2g)随机分组。

1、多糖和果胶对脾淋巴细胞增殖的影响

制备脾细胞悬液：小鼠颈椎脱臼处死，消毒，置于超净台中，无菌取出小鼠脾脏，置于含5mL淋巴细胞分离液的培养皿中；

无菌纱布网磨碎脾脏后过滤，得到单细胞悬液，离心，弃上清；

加入D-Hank’s溶液重新悬起细胞，离心后收集单核脾细胞层，重复两次；

10％的NBCS-RPMI-1640完全培养基重悬细胞，计数，调整细胞浓度为5×10⁶个/mL；

多糖实验组和果胶试验组分为高中低三个浓度，分别为10μg/mL、100μg/mL、1000μg/mL，分别加入100μL 10％NBCS-RPMI-1640完全培养基，

丝裂原诱导组分别加入100μL T细胞丝裂原ConA(终浓度5μg/mL)和100μL B细胞丝裂原LPS(终浓度10μg/mL)；

各实验孔终体积均为200μL，设3个复孔；

将细胞培养板置于CO₂(浓度5％)恒温培养箱，37℃条件下培养44h；

每孔加入20μL 5mg/mL MTT溶液，恒温培养4h，弃掉上清，加入DMSO终止反应，静置避光10min，使用酶标仪在波长570nm处检测并记录吸光值。

结果表明，人参果多糖和果胶的高浓度组均能促进脾淋巴细胞增值。

2.多糖和果胶对巨噬细胞吞噬能力和NO生成能力的影响

多糖和果胶实验组分为高中低三个浓度，分别为10μg/mL、100μg/mL、1000μg/mL。

腹腔巨噬细胞的制备：小鼠颈椎脱臼处死，消毒；

打开腹腔，D-Hank’s溶液冲洗，收集腹腔液，4℃低温离心；

重复用D-Hank’s溶液冲洗两次，低温离心后弃上清，RPMI-1640培养基重悬细胞；

计算并调整细胞浓度至5×10⁶个/mL，1mL/孔加入6孔板中；

将培养板置于5％CO₂恒温培养箱37℃条件下培养，用预温37℃的D-Hank’s液清洗培养板2-3次，除去未贴壁或贴壁性不好的巨噬细胞，余下的即为纯化的贴壁巨噬细胞。

2.1多糖和果胶对巨噬细胞吞噬中性红能力的影响：

使用PBS配制浓度为0.075％的中性红溶液，过滤，除菌；

向巨噬细胞中加入中性红溶液(100μL/孔)，培养1-2h；

清洗培养板，加入100μL细胞裂解液(乙醇：乙酸＝1:1，v/v)，2h后，酶标仪检测波长为550nm时反应液的吸光值；

结果表明人参果多糖和果胶在中、高浓度时均能促进巨噬细胞吞噬中性红的能力，果胶作用效果优于多糖。

2.2多糖对巨噬细胞生成NO的影响：

将巨噬细胞以1×10⁶个/孔的浓度加入到24孔板中；

将细胞培养板置于5％CO₂、37℃恒温培养箱中培养48h；

将细胞培养上清(100μL)转移到96孔培养板中，加入等体积的Griess试剂，避光反应10min；

酶标仪检测540nm波长时的吸光值，以NaNO₃为标准物做标准曲线，根据吸光值和标准曲线来计算样品刺激孔所对应的NO含量。

结果表明人参果多糖和果胶均能显著促进巨噬细胞生成NO的能力，果胶活性优于多糖。

对所得数据进行分析统计，计算均值及SD值，应用软件SPSS 12.0进行数据处理，保证3次实验重复。通常采用单因素方差分析法比较多组数据之间的关系。当P<0.01时，表示实验组与对照组差异极其显著；P<0.05时，实验组与对照组有显著性差异。

通过MTT法检测和统计学分析，人参浆果总多糖和果胶均能够提高小鼠淋巴细胞增殖能力、巨噬细胞吞噬能力和NO生成能力，其中果胶效果更佳，可见，本发明制得的人参浆果总多糖和果胶均具有很好的免疫调节活性。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。