本发明涉及一种水溶性银杏外种皮多糖及其制剂的制备方法，属于中药制药领域。
背景技术：
我们从银杏外种皮中提取多糖类化合物并进行了一系列基础研究及临床初步试用，发现银杏外种皮多糖（Ginkgo biloba exocarp polysaccharide，GBEP）具有直接杀伤肿瘤细胞和增强免疫功能的作用。其胶囊制剂在临床应用于肿瘤患者多年，取得了良好的经济和社会效益。然而，用传统工艺（ZL00134363.7）制备的GBEP水溶性不是太理想，只能制成固体制剂；而改进后的工艺（ZL201010251068.9）虽然可以提高水溶性，制备固体和液体制剂，但操作繁琐制备时间较长，因而成本也较高。因此，进行工艺改进在改善水溶性的同时，提高制备效率是本课题组多年来关注的问题。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种水溶性银杏外种皮多糖及其制剂的制备方法。
本发明的第一个目的是通过以下技术方案实现的，水溶性银杏外种皮多糖的制备方法，包括以下步骤：
（1）将被乙醇浸泡过的银杏外种皮置于煮提锅中常规加水煎煮 2 - 3 次并分别过滤，将滤液合并减压浓缩至比重在1.21-1.30，将乙醇缓慢加入浓缩液中，使乙醇终浓度在60 - 80%（V/V），边加边快速搅动，静置后离心弃上清，再用高浓度乙醇离心洗涤数次，得乙醇沉淀物；
（2）打开行星式球磨机，按填充率为40-60%在球磨罐中装入直径分别为20mm、10mm和6mm的大中小玛瑙磨球，大中小玛瑙磨球的数量比为1:（28-32）:（152-155），
按球料比15-20:1（W/W）加入步骤（1）中所述的乙醇沉淀物；正反交替间隔运行，转速为300-600rpm /min，循环3-5次，过筛后真空干燥或冷冻干燥，即可得到水溶性银杏外种皮多糖。
步骤（2）中所述正反交替间隔运行为正向运行0.8-1.2h后停机0.5-1.0h再反向运行0.8-1.2h停机0.5-1.0h。
本发明的第二个目的是通过以下技术方案实现的，水溶性银杏外种皮多糖制剂的制备方法，将上述方法制备的水溶性银杏外种皮多糖加入少量赋型剂或矫味剂和防腐剂制成抗肿瘤胶囊制剂或抗肿瘤口服液制剂。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明利用行星式球磨机的转动或振动使硬球对原料进行强烈的撞击、研磨和搅拌，将原材料粉碎为水溶性微粒。该方法操作及制备流程简单可控，所得银杏外种皮多糖粒径减小，粒度分布均匀，水溶性和抗肿瘤效价强度皆明显提高，可以制备成抗肿瘤固体和液体制剂。该方法操作简便，成本低，适合工业化大生产。
1、水溶性测定
粉碎前的GBEP在1.5%（W/V）浓度下肉眼观察完全溶解于水，而粉碎后的GBEP在2.5%（W/V）浓度下肉眼观察完全溶解于水，提示水溶性提高。
2、粒径测定
精密称取粉碎前和粉碎后的GBEP各2.5mg，分别溶于蒸馏水，定容至50 ml，得到浓度为50 μg/mL的GBEP水溶液。取该水溶液置于具塞试管中，超声20min后，采用马尔文激光粒度仪，测定粒径。结果显示，粉碎前的银杏外种皮多糖粗粉的粒径为1.5-2.0μm，而采用该方法制得的水溶性银杏外种皮多糖粒径为200-250nm。
3、ζ电位测定
精密称取粉碎前和粉碎后的GBEP各2.5mg，分别溶于蒸馏水，定容至50 ml，得到浓度为50 μg/mL的GBEP水溶液。取该水溶液置于具塞试管中，超声20min后，采用马尔文激光粒度仪，测定ζ电位。结果显示，粉碎前的银杏外种皮多糖ζ电位为(-14)-(-11) mV，而采用该方法制得的银杏外种皮多糖ζ电位为(-26)-(-24) mV，提示粉碎后的银杏外种皮多糖水溶液更稳定。
4、肽多糖含量的测定
采用苯酚硫酸法测多糖含量：精密称取无水葡萄糖标准品适量，用蒸馏水配成1mg/ml的葡萄糖标准液，再进一步稀释为不同浓度。精密量取浓度为30μg/ml、60μg/ml、90μg/ml、120μg/ml、150μg/ml、180μg/ml的葡萄糖标准溶液0.5ml于6支10ml具塞试管中，加入50mg/ml的重蒸酚溶液1ml，混合均匀后，加入5ml浓硫酸，混合均匀，沸水浴15min，冷水浴30min。用紫外分光光度计于490nm处测定吸光度，对葡萄糖溶液浓度和吸光度进行线性回归，建立回归方程。取供试品溶液0.5ml，按上述操作测吸光度值，代入回归方程，计算出多糖含量。
采用考马斯亮蓝法测蛋白质含量：精密称取牛血清白蛋白标准品适量，用蒸馏水配成100μg/ml的蛋白标准溶液，再进一步稀释为不同浓度。精密量取浓度为20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml蛋白标准溶液0.5ml分别于5支10ml具塞试管，再加入2.5ml考马斯亮蓝G-250溶液，摇匀后，放置5～10min，待其充分反应后，用紫外分光光度计于595nm处测定吸光度，对牛血清白蛋白溶液浓度和吸光度进行线性回归，建立回归方程。取供试品溶液0.5ml，按上述操作测吸光度值，代入回归方程，计算出蛋白质含量。
采用红外光谱分析仪进行定性分析。结果显示银杏外种皮多糖含酰胺键，提示为肽多糖。肽多糖含量%=(多糖含量+蛋白质含量)%。
粉碎前的银杏外种皮多糖其多糖含量为36%、蛋白质含量为28%，所以肽多糖含量为36%+28%=64%。采用该方法制得的水溶性银杏外种皮多糖其多糖含量为40%、蛋白质含量为26%，所以肽多糖含量为40%+26%=66%，提示粉碎前后银杏外种皮多糖抗肿瘤有效部位含量基本保持不变。
5、药效研究
取处于对数生长期的HepG-2细胞，用胰蛋白酶消化、Hank’s液洗涤后，用含10%小牛血清RPMI1640培养液调整细胞至1×105/ml。向96孔培养板各孔中分别加入上述细胞悬液100μl，在5%CO2、37℃饱和湿度的培养箱中培养24h后，加入用含10%小牛血清RPMI1640培养液配制的不同浓度的样品各100μl，每个浓度设6个复孔，培养48h。培养结束前4h加入MTT（终浓度5mg/ml），继续培养4h后弃去培养液，加入酸化异丙醇，振荡10min，用酶标仪于570nm处测定各孔的OD值。按公式“抑制率=(1-药物孔OD值/对照孔OD值)×100%”，计算体外对HepG-2细胞增殖的抑制率。结果见表1。
表1 银杏外种皮多糖对人肝癌HepG-2细胞的抑制作用
表1结果显示，银杏外种皮多糖在10-320μg/ml剂量下对人肝癌细胞具有直接抑制作用，随着剂量增加，其抑制作用也逐渐增强。而且，粉碎后的银杏外种皮多糖的半数抑制浓度IC50（μg/ml）显著低于粉碎前的，说明效价强度更高。
具体实施方式
实施例1
取被乙醇浸泡过的干银杏外种皮120克，置于煮提锅中加水1500克，于95℃时煎煮1小时，过滤后继续加水重复上述煎煮方法1 次并过滤，将2次的滤液合并，于70℃减压浓缩至比重为1.21，将95％的乙醇缓慢加入浓缩液中，使乙醇终浓度在80％，边加边快速搅动，静置6小时后将沉淀物离心甩干，再用高浓度乙醇（体积浓度98%以上）洗涤2次，得乙醇沉淀物；打开行星式球磨机，按填充率50%在球磨罐中装入数量比为1:28:155的大中小玛瑙磨球，按球料比为20:1（W/W）加入上述乙醇沉淀物；正向运行1.0h后停机1.0h再反向运行1.0h后停机1.0h；转速为600rpm/min，循环3次，得到的水溶性银杏外种皮多糖在2.5%（W/V）浓度下肉眼观察完全溶解于水，粒径为219.3nm，ζ电位为-25.4mV。采用苯酚硫酸法及考马斯亮蓝法分别检测其多糖及蛋白质含量，结果分别为40%及26%，肽多糖总含量为66%。采用MTT法体外检测对HepG-2细胞增殖的影响，接种细胞24h后加入水溶性银杏外种皮多糖，继续培养48h检测。结果显示，水溶性银杏外种皮多糖终浓度在320μg/ml，160μg/ml，80μg/ml，40μg/ml，20μg/ml，10μg/ml下可直接抑制人肝癌细胞生长，且随着剂量增加，其抑制作用逐渐增强，抑制率（%）分别为70，65，56，48，31及15，半数抑制浓度IC50（μg/ml）为122.5。取水溶性银杏外种皮多糖干粉200g溶解于纯净水中，按药物质量要求加入适量矫味剂及防腐剂，摇匀，按10ml规格装瓶，制成水溶性银杏外种皮多糖口服液制剂。
实施例2
取被乙醇浸泡过的干银杏外种皮160克，置于煮提锅中加水2000克，于98℃时煎煮1小时，过滤后继续加水重复上述煎煮方法1 次并过滤，将2次的滤液合并，于70℃减压浓缩至比重为1.26，将95％的乙醇缓慢加入浓缩液中，使乙醇终浓度在60％，边加边快速搅动，静置10小时后将沉淀物离心甩干，再用高浓度乙醇洗涤2次，得乙醇沉淀物；打开行星式球磨机，按填充率为60%在球磨罐中装入数量比为1:32:152的大中小玛瑙磨球，按球料比为15:1（W/W）加入上述乙醇沉淀物；正向运行0.8h后停机0.5h再反向运行0.8h后停机0.5h；转速为300 rpm/min，循环5次，得到的水溶性银杏外种皮多糖在2.5%（W/V）浓度下肉眼观察完全溶解于水，粒径为246.2nm，ζ电位为-25.1mV。采用苯酚硫酸法及考马斯亮蓝法分别检测其多糖及蛋白质含量，结果分别为36%及25%，肽多糖总含量为61%。采用MTT法体外检测对HepG-2细胞增殖的影响，接种细胞24h后加入水溶性银杏外种皮多糖，继续培养48h检测。结果显示，水溶性银杏外种皮多糖终浓度在320μg/ml，160μg/ml，80μg/ml，40μg/ml，20μg/ml，10μg/ml下可直接抑制人肝癌细胞生长，且随着剂量增加，其抑制作用逐渐增强，抑制率（%）分别为67，63，55，47，28及13，半数抑制浓度IC50（μg/ml）为137.2。取水溶性银杏外种皮多糖干粉100g，加入赋型剂50g，拌匀，按每粒150mg装入空心胶囊，制成水溶性银杏外种皮多糖胶囊制剂。
实施例3
取被乙醇浸泡过的干银杏外种皮100克，置于煮提锅中加水1500克，于96℃时煎煮1小时，过滤后继续加水重复上述煎煮方法1 次并过滤，将2次的滤液合并，于70℃减压浓缩至比重为1.30，将95％的乙醇缓慢加入浓缩液中，使乙醇终浓度在70％，边加边快速搅动，静置12小时后将沉淀物离心甩干，再用高浓度乙醇洗涤3次，得乙醇沉淀物；打开行星式球磨机，按填充率为40%在球磨罐中装入数量比为1:31:154的大中小玛瑙磨球，按球料比为18:1（W/W）加入上述乙醇沉淀物；正向运行1.2h后停机0.8h，再反方向运行1.2h后停机0.8h，转速为500 rpm/min，循环4次，得到的水溶性银杏外种皮多糖在2.5%（W/V）浓度下肉眼观察完全溶解于水，粒径为238.5nm，ζ电位为-25.2mV。采用苯酚硫酸法及考马斯亮蓝法分别检测其多糖及蛋白质含量，结果分别为38%及26%，肽多糖总含量为64%。采用MTT法体外检测对HepG-2细胞增殖的影响，接种细胞24h后加入水溶性银杏外种皮多糖，继续培养48h检测。结果显示，水溶性银杏外种皮多糖终浓度在320μg/ml，160μg/ml，80μg/ml，40μg/ml，20μg/ml，10μg/ml下可直接抑制人肝癌细胞生长，且随着剂量增加，其抑制作用逐渐增强，抑制率（%）分别为69，64，55，48，30及14，半数抑制浓度IC50（μg/ml）为128.5。取水溶性银杏外种皮多糖干粉200g溶解于纯净水中，按药物质量要求加入适量矫味剂及防腐剂，摇匀，按20ml规格装瓶，制成水溶性银杏外种皮多糖口服液制剂。