一种新型氟化的聚酰胺基因转染试剂其制备方法及应用与流程

本发明属于生物技术领域，涉及一种新型氟化的聚酰胺基因转染试剂其制备方法及应用。

背景技术：

基因治疗成为现在临床应用的一种方法，即将特定的基因材料转入到特定的细胞进而治疗各种慢性性疾病和遗传病。常用于基因治疗的载体有两种，病毒性载体和非病毒性载体。目前，由于病毒性载体具有低免疫原性，潜在的传染性及致瘤性等一系列的严重缺陷，在应用上存在一定的局限性。因此，非病毒基因转染载体的研究成为热点，在这些非病毒基因转染载体中，聚阳离子高分子由于存在较低的免疫原性，可塑性强，负载量大，易规模化生产等优点而被广泛应用。与此同时聚阳离子化合物的质子海绵效应，使得其化学结构在生理条件下有1/6至1/5的胺基发生质子化反应，从而使溶酶体破裂，从而起到质子海绵作用，使聚阳离子高分子/dna复合物得以释放入胞质，很大程度上减少dna在吞噬泡内富集并进而被降解的作用，因而提高转染效率。

目前，现有技术中急需一种新型氟化的聚酰胺基因转染试剂其制备方法及应用。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种新型氟化的聚酰胺基因转染试剂其制备方法及应用，打破以往采用只采用枝状的聚乙烯亚胺合成一些基因转染载体，采用一些低成本的易合成，结构相对稳定的线状的聚乙烯亚胺。采用不同碳链长度的含氟脂肪酸酐多种修饰剂修饰之后，降低与血液组织中的聚集，从而增加了基因转染效率。

其具体技术方案为：

一种新型氟化的聚酰胺基因转染试剂，polyamide聚酰胺分子式为：

(ch2ch2)n(nco)(c)mr1r2r3

结构式为：

r1，r2，r3＝f，chf2，cf3，ch2f，cf2cf3，cf2cf2cf3

一种本发明所述新型氟化的聚酰胺基因转染试剂的制备方法，包括以下步骤：不同分子量的聚乙烯亚胺与脂肪类含氟酸酐在摩尔比为1∶1的情况下，于甲醇溶液中反应48h之后；分别在室温条件下，于pbs缓冲溶液和蒸馏水中透析48h，经过-80℃过夜，冷冻干燥后，即获得白色絮状的氟化的聚阳离子化合物。

本发明所述新型氟化的聚酰胺基因转染试剂在基因治疗药物制备过程中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明打破以往采用只采用枝状的聚乙烯亚胺合成一些基因转染载体，采用一些低成本的易合成，结构相对稳定的线状的聚乙烯亚胺。采用不同碳链长度的含氟脂肪酸酐多种修饰剂修饰之后，降低与血液组织中的聚集，从而增加了基因转染效率。

附图说明

图1：pei和聚酰胺的红外吸收光谱；

图2：pei和聚酰胺的核磁谱图；

图3：pei和聚酰胺在pbs缓冲液的紫外光谱吸收图；

图4：pei，lipo2000和polyamide绿色荧光蛋白(gfp)基因转染效率比较，其中，图4(a)lipo2000；图4(b)linearpei(10kd)；图4(c)10kd-polyamidea；图4(d)10kd-polyamideb；图4(e)linearpei(25kd)；图4(f)25kd-polyamidea；图4(g)26kd-polyamidea；

图5：pei，lipo2000和polyamide基因转染效率比较；

图6：pei和polyamide的细胞毒性分析。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

该新型氟化试剂的理化表征，首先，对该材料进行红外光谱分析，将合成的材料红外光谱，核磁图谱，uv图谱分析及透视电镜。

经过对合成的高分子纳米材料进行红外光谱分析，相比没有经过任何修饰的聚乙烯亚胺，氟化后的聚乙烯亚胺于1681cm和1630cm出现酰胺基的c＝o特征吸收峰，证明酰胺基的形成。同时对其进行核磁图谱分析，发现其氟化度几乎达100％。

对其进行uv图谱分析，现经修饰后的pei透过率相比没有修饰明显增加，同时化学修饰过的聚乙烯亚胺在208nm有吸收，也证实了酰胺的形成，与之前红外光谱结果相一致。

氟化的聚阳离子与dna复合物的理化特征：首先通过凝胶阻滞实验检测聚阳离子化合物与dna的结合能力，分子量分别是10kda与24kda的聚乙烯亚胺，分别经过含氟酸酐a和含氟酸酐b修饰之后，形成四种新型的氟化转染试剂，将四种氟化试剂与dna分别在n/p3.8、7.5、15、30的情况下，检测该新型转染试剂与dna的结合能力。

粒度分析实验：检测转染试剂与dna结合之后的尺寸与电势是如何变化的，其方法与前面方法一致，分别在n/p3.8、7.5、15、30的情况下，检测新型转染载体与dna于pbs缓冲溶液中结合30min之后的尺寸与电势是如何变化的。

基因转染：设计不同的浓度梯度，即n/p分别在3.8、7.5、15、30情况下，检测转染转染试剂在不同浓度下的转染效率，从而筛选出每种转染试剂最优化的转染条件，本实验是将hek293细胞平铺6孔板中，每孔细胞数大约为7*104.于37℃.5％co2培养箱中培养24h，聚乙烯亚胺与dna的结合体系，2ug的质粒(pegfp)，在将pei/dna复合物加入到细胞之前，现将两者在dmem中结合15-20min左右，于37℃.5％co2培养箱培养48h，在荧光显微镜观测egfp的表达，转染效率＝绿色荧光的细胞数目/总的细胞数目*100％。

检测egfp的表达：实验采用带有绿色荧光标签的egfp质粒，将合成的新型转染试剂转入hek293细胞，lipo2000作为对照，检测其转染效率。发现经过氟化的pei转染效率比没有氟化的pei转染效率要高。对其进行定量分析，通过luciferase实验，再次证实氟化后的pei相比没有氟化的pei及商业上常用的转染试剂lipo2000，其转染效率明显增加。

mtt实验：通过mtt实验，检测hek293细胞的毒性。将hek293细胞平铺96孔板中，没孔细胞数是5000，于37℃.5％co2培养箱培养24h，pei/dna复合物(n/p的摩尔比为3.8、7.5、15、30)于dmem溶液中结合15-20min之后加入96孔细胞培养板中，培养箱中培养48h，将原培养基弃掉，按培养基/mtt(5mg/ml)10∶1的比例混合均匀加入新的培养基，孵育4h之后，弃培养基，每孔加入150ul的dmso溶液，振荡15min，酶标仪检测。细胞活性率＝样本检测的od值/对照样品的od值*100％。

通过mtt细胞毒性分析实验，对氟化的新型转染试剂进行毒性检测，发现其细胞毒性相比没有修饰的pei及商业上常用的转染试剂lipo200有轻微程度较低，由此说明氟化后的pei的细胞毒性相比没有氟化的pei和lipo2000，细胞毒性较小。

荧光报告实验：通过荧光报告实验，对基因转染效率进行定量分析。本实验是将hek293细胞平铺24孔板中，每孔细胞数4*104，培养24h，加入0.5ug的egfp质粒，在最佳pei/dna于dmen溶液中结合15-20min，加入细胞中，培养48h后，检测其荧光强度，lipo2000作为阳性对照。

细胞摄取：分别将没有氟化的聚乙烯亚胺与经过氟化的聚酰胺在最优化的转染条件下，检测细胞摄取情况。本实验采用yoyo-1荧光染料标记renailla质粒，lysotracker标记溶酶体，dapi标记细胞核，在将pei/dan复合之前，先dna与yoyo-1孵育10min，然后将转染试剂(pei)与dna结合进行基因转染。转染4h之后，将细胞消化下来，采用流式细胞计数仪进行定量分析，另外也可以采用激光共聚焦直接观察细胞摄取情况。

本发明采用的是线性的聚乙烯亚胺，之所以选用线状的聚乙烯亚胺为基因转染载体，最关键的一点是因为它的结构较枝状的更为稳定，在与修饰剂反应时可控性强。同时相对枝状的聚乙烯亚胺，线状的聚乙烯亚胺成本低，更易大规模化生产。另外，有报道曾指出，氟化作用可以提高聚阳离子化合物改善细胞膜结构，穿过磷脂双分子结构，促进内含体逃逸能力进而提高转染效率。研究表明，聚乙烯亚胺/dna复合物容易在肺部，肝脏，脾脏等组织发生聚集，此外该复合物亦容易吸收血液中的负性血清蛋白，导致复合物不稳定，进而降低甚至失去传递活性，而本发明采用的采用不同碳链长度的含氟脂肪酸酐与聚乙烯亚胺结合之后，降低了聚阳离子化合物与血液组织的粘附作用，使其在基因转染过程的该复合物的尺寸与电势不会发生变化，从而增加了基因转染效率。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。