一种零背景的平末端克隆载体pRI857及其构建方法和应用与流程

本发明涉及一种零背景的平末端克隆载体pri857及其构建方法和应用，具体涉及一种用温敏型启动子ci857-pr控制抗性基因kan^r的表达以此作为筛选标记的pri857克隆载体及其在基因克隆和基因文库构建中的应用，属于生物技术领域。

技术背景

随着现代生物技术的快速发展，通过pcr技术扩增目的dna片段，利用体外重组的方式，将dna序列插入到克隆载体中，实现目的基因的异源表达，在医学，工业和农业生产上取得了重要的成就，也给生物技术的发展开辟了一条新的道路。同时，由于生物信息学的突飞猛进，二代测序技术的问世，这样，阳性克隆的筛选显得尤为重要，而有效的筛选手段是对dna序列测定和后续基因功能验证的必须手段。利用lacz作为筛选标记的蓝白斑筛选系统，通过产生β-半乳糖苷酶将x-gal分解为半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝，有色物质可以使细菌呈蓝色(langley,k.e.；etal.(1975)."molecularbasisofbeta-galactosidasealpha-complementation".proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica.72(4):1254–1257.)；而阳性克隆则由于外源基因的插入，破坏了lacz的阅读框，使得β-半乳糖苷酶无法正确表达，不能产生蓝色的5-溴-4-靛蓝，故菌落呈白色，通过颜色的差异可以轻易的挑选出正确克隆。然而这种方法有时候会因为有些空载体也显白色，故而也存在限制。

温敏型启动子pr、pl启动子来至于λ噬菌体，受ci857基因的严格调控，30℃下阻遏pr启动子转录，随着温度的提高，阻遏蛋白ci857与pr启动子的结合逐渐减弱，pr启动子的转录则不断提高(villaverdea,etal.fineregulationofci857-controlledgeneexpressionincontinuouscultureofrecombinantescherichiacolibytemperature[j].appliedandenvironmentalmicrobiology,1993,59(10):3485-3487.)。当温度达到37℃时，阻遏蛋白ci857对pr启动子的抑制能力减弱，使得pr启动子能驱动抗性基因的表达，通过这一技术来进行分子克隆，可以获得100％的阳性克隆。

技术实现要素：

针对基因克隆中的实际问题和需求，本发明提供了一种零背景的平末端克隆载体pri857，该零背景平末端快速克隆载体是利用阻遏子ci857和温敏型启动子pr来控制抗生素基因kan^r的表达以此作为筛选标记的pri857克隆载体，可以高效克隆平末端pcr产物和任何具有平末端的dna片段。

本发明的技术方案如下：

一种重组质粒pbbr1mcs-pr，为利用pcr扩增质粒pcp20中的pr启动子基因替换pbbr1mcs-2质粒中的kan^r的启动子序列，形成全长序列为seqidno.15的重组质粒。

一种重组质粒puc-ci857，为利用pcr扩增质粒pcp20中的ci857基因替换puc19中的lacza基因，形成全长序列为seqidno.16的重组质粒。

一种零背景的平末端克隆载体pri857，为利用pcr扩增重组质粒puc-ci857中的plac-ci857基因和重组质粒pbbr1mcs-pr中的pr-kan^r基因替换质粒pkv6中的ampr和ermb-erma基因，pr-kan^r基因，plac-ci857基因与质粒pkv6中的dbl-cole1基因顺序连接形成全长序列为seqidno.17的重组质粒，所述的ci857开放阅读框上设计有bfrbi平末端酶切位点。

进一步地，本发明还提供上述零背景的平末端克隆载体pri857的构建方法，包括引物设计、基因克隆和载体构建，利用pcr扩增质粒pcp20中的pr启动子序列来替换质粒pbbr1mcs-2中kan^r基因的启动子序列，形成重组质粒pbbr1mcs-pr；利用pcr扩增质粒pcp20中的ci857基因替换质粒puc19中的lazza基因，形成重组质粒puc-ci857；通过合成引物pcr扩增质粒pbbr1mcs-pr中的pr-kan^r目的片段，质粒puc-ci857中的plac-ci857目的片段和质粒pkv6中的dbl-cole1目的片段，最后将pr-kan^r、plac-ci857、dbl-cole1片段进行顺序连接，得到零背景克隆载体pri857。

本发明利用温敏性启动子元件ci857-pr控制抗性基因kan^r的表达，并在ci857开放阅读框上设计bfrbi酶切位点，以用于克隆任意dna片段。在37℃的卡那霉素培养基中，当目的dna片段插入ci857的bfrbi酶切位点后会破坏原有阻遏基因ci857的阅读框，使得pr启动子的抑制被解除，从而kan^r基因得以顺利表达，由此可使转化子在30℃的卡那霉素平板上正常生长，而自连产生的空载体，其转化子在30℃培养时会由于kan^r基因依然被ci857蛋白抑制，而不能存活在卡那霉素的平板上，导致细胞死亡，从而实现“零背景”的克隆效果。本发明的零背景平末端克隆载体pri857可用于克隆任意pcr产物和平末端dna序列，并且以kan^r基因作为筛选标记时克隆阳性率可以达到100％。此外，该克隆载体也可用于基因组文库的高效构建，同时能有效避免空载体干扰，是后基因组时代高通量基因筛选与功能验证的一种有效工具。

附图说明

图1为pbbr1mcs-pr载体的酶切验证图，m表示marker，a表示pbbr1mcs-pr载体经hindiii酶切的条带，b表示pbbr1mcs-pr载体经psti酶切后的条带。

图2为构建完成的pbbr1mcs-pr质粒图谱。

图3为puc-ci857载体的酶切验证图，m表示marker，a表示puc-ci857载体经scai酶切的条带，b表示puc-ci857载体经scai和pcii酶切后的条带。

图4为构建完成的puc-ci857质粒图谱。

图5为pri857载体的酶切验证图，m表示marker，a表示pri857载体经kpni酶切后的条带，b表示pri857载体经psti酶切后的条带。

图6为构建完成的pri857质粒图谱。

图7为dh5α/pri857分别在37℃(a)和30℃(b)培养平板上生长状况。

图8为采用pri857载体用于克隆绿色荧光蛋白基因克隆平板。

图9为利用pri857载体构建基因组文库后经bamhi酶切后的电泳图。

具体实施方式

为了进一步阐明本发明的适用范围，以下集合实施例和附图对本发明加以说明，但该载体的应用不局限本发明所定范围。

本发明所述的质粒pcp20，puc19，pkv6，pbbr1mcs-2，以及大肠杆菌dh5α，dh10β均由商业购买。

实施例一：一种零背景克隆载体pri857的构建方法

1、一种重组质粒pbbr1mcs-pr的构建方法，包括以下步骤：

(1)引物设计：人工设计合成特异性引物序列

prfor：5’-ggttagtatgcagccgtcacagtgctcgttctctggcgtc-3’；

prev：5’-gcatgtactaaggaggttgtatgattgaacaagatggattg-3’

mcsfor：5’-caatccatcttgttcaatcatacaacctccttagtacatgc-3’；

mcsrev：5’-gacgccagagaacgagcactgtgacggctgcatactaacc-3’

(2)pcr扩增：pcr反应体系配制如表1所示。

表1pcr反应体系配制表

pcr程序是98℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸10min。采用pcp20质粒dna为模板和cifor/cirev引物用以扩增pr启动子目的片段，而采用pbbr1mcs-2质粒dna为模板和mcsfor/mcsrev引物用以扩增rep-lacz-kan^r目的片段。所述pr目的片段长度为432bp，rep-lacz-kan^r目的片段长度为4061bp。

(3)载体构建：将上述扩增的pr和rep-lacz-kan^r目的片段通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，并切胶回收。将pr和rep-lacz目的片段用gibsonassembly的方式进行连接，并将连接产物转化至大肠杆菌dh5α中，涂布在含有50μg/ml的卡那霉素lb平板上，于37℃培养18h，挑选克隆于卡那霉素液体培养基中，在30℃培养8h，提取质粒验证，获得质粒pbbr1mcs-pr。质粒pbbr1mcs-pr用hindiii酶切后长度为4413bp的核酸片段，用psti酶切后长度分别为1242bp和3171bp的核酸片段，电泳图如图1所示。构建完成的pbbr1mcs-pr质粒图谱如图2所示。

2、一种重组质粒puc-ci857的构建方法，包括以下步骤：

(1)引物设计：人工设计合成特异性引物序列

cifor：5’-ggtttcttttttgtgctcatagctgtttcctgtgtgaaattg-3’；

cirev：5’-gatcggcaaggtgttctggtagacaagctgtgaccgtctc-3’

pucfor:5’-gagacggtcacagcttgtctaccagaacaccttgccgatc-3’；

pucrev:5’-caatttcacacaggaaacagctatgagcacaaaaaagaaacc-3’

(2)pcr扩增：pcr反应体系配制如表1所示。

pcr程序是98℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火30s,72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸10min。采用pcp20质粒dna为模板和cifor/cirev引物用以扩增ci857目的片段，而采用puc19质粒dna为模板和pucfor/pucrev引物用以扩增rep-lacz目的片段。所述ci857目的片段长度为772bp，puc19目的片段长度为2329bp。

载体构建：将上述扩增的ci857和puc19目的片段通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，并切胶回收。将ci857和puc19目的片段用gibsonassembly的方式进行连接，并将连接产物转化至大肠杆菌dh5α中，涂布在含有100μg/ml的氨苄青霉素lb平板上，于37℃培养18h，挑选克隆于卡那霉素液体培养基中，在37℃培养8h，提取质粒验证，获得质粒puc-ci857。质粒puc-ci857用scai酶切后长度为3019bp的核酸片段，用scai和pcii酶切后长度分别为1373bp和1646bp的核酸片段，如图3所示；构建完成的puc-ci857质粒图谱如图4所示。

3、一种重组质粒pri857的构建方法，包括以下步骤：

(1)引物设计：人工设计合成特异性引物序列

pkfor：5’-cagtgaggcacctatctcagtcagaagaactcgtcaagaag-3’；

pkrev：5’-gaaacctgtcgtgccagctgacgttaaatctatcaccgcaag-3’

pcfor：5’-cttgcggtgatagatttaacgtcagctggcacgacaggtttc-3’；

pcrev：5’-cccatagttcatcagttaaccagaacaccttgccgatc-3’

dblcfor：5’-gatcggcaaggtgttctggttaactgatgaactatggg-3’；

dblcrev：5’-cttcttgacgagttcttctgactgagataggtgcctcactg-3’

(2)pcr扩增：pcr反应体系配制如表1所示。

pcr程序是98℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸10min。采用pbbr1mcs-pr质粒dna为模板和pkfor/pkrev引物用以扩增pr-kan^r目的片段，采用puc-ci857质粒dna为模板和pcfor/pcrev引物用以扩增ci857目的片段，采用pkv6质粒dna为模板和dblcfor/dblcrev引物用以扩增dbl-cole1目的片段。所述plac-ci857目的片段长度为937p，pr-kan^r目的片段长度为935bp，dbl-cole1目的片段长度为1679bp。

载体构建：将上述扩增的plac-ci857，pr-kan^r和dbl-cole1目的片段通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，并切胶回收。将plac-ci857，pr-kan^r和dbl-cole1目的片段用gibsonassembly的方式进行连接，并将连接产物转化至大肠杆菌dh5α中，涂布在含有100μg/ml的氨苄青霉素lb平板上，于37℃培养18h，挑选克隆于卡那霉素液体培养基中，在37℃培养8h，提取质粒验证，获得质粒pri857。

琼脂糖凝胶电泳参见《分子克隆》中琼脂糖凝胶电泳的方法，胶回收采用qiagen胶回收试剂盒，化学转化法参见《分子克隆》中氯化钙制备和感受态转化大肠杆菌的方法。连接体系和方法参见gibsonassembly。质粒经kpni酶切后的大小为3430bp的核酸片段，经psti酶切后的大小分别为1952bp和1478bp的核酸片段，验证图如图5所示。构建完成的pri857质粒图谱如图6所示。将dh5α/pri857涂布在卡那霉素50μg/ml的固体培养基，分别于37℃和30℃培养，结果如图7所示。

实施例二：一种零背景克隆载体pri857用于克隆gfp基因的应用

一种零背景克隆载体pri857用于克隆gfp基因的应用，包括以下步骤：

(1)细菌培养：在卡那霉素50μg/ml的液体培养基中接种含有质粒pri857的dh5α，于37℃培养8h；在卡那霉素50μg/ml的液体培养基中接种含有质粒ptd103luxi-sfgfp的dh5α，于37℃培养8h。分别提取pri857和ptd103luxi-sfgfp两种质粒。

(2)引物设计：人工设计合成特异性引物序列

gfpfor：5’-gtcacactattgtatcgctg-3’

gfprev：5’-taagcttttacgctgcaagg-3’

(3)pcr扩增：pcr反应体系是5×q5pcrbuffer10μl，5×enhancer10μl，dntp(10mmol/l)1μl，引物(10μmol/μl)各2.5μl，质粒dna(约20ng/μl)1μl，q5dna聚合酶(5u/μl)0.5μl，加h2o至50μl。pcr程序是98℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸10min。采用ptd103luxi-sfgfp质粒dna为模板和gfpfor/gfprev引物，用以绿色荧光蛋白基因，该目标dna片段为880bp。

(4)载体酶切：将pri857质粒dna用限制性内切酶bfrbi进行酶切，胶回收线性化片段pri857。

(5)平末端连接：将线性化pri857与gfp片段以摩尔比1:3的比例进行连接，在t4连接酶的作用下，于16℃连接1h，然后转化到dh5α化学感受态细胞中，于30℃培养12h即可。

试验结果表明：通过ci857阻遏基因来控制pr启动子下游kan^r基因的表达，只有成功插入gfp目的片段的克隆可以在30℃的培养条件下存活，而自连的载体会因为不能表达卡那霉素抗性蛋白而凋亡，克隆结果可见克隆平板，每个克隆都是绿色的，结果如图8所示。

实施例三：一种零背景克隆载体pri857用于基因组文库构建的应用

一种零背景克隆载体pri857用于基因组文库构建的应用，包括以下步骤：

(1)细菌培养：在卡那霉素50μg/ml的液体培养基中接种含有质粒pri857的dh5α，于37℃培养10h；同时在lb液体培养基中接种蜡状芽孢杆菌，于37℃培养10h。分别提取pri857质粒和蜡状芽孢杆菌基因组dna。

(2)载体酶切：将pri857质粒dna用限制性内切酶bfrbi进行酶切，通过琼脂糖凝胶回收线性化pri857dna片段。

(3)基因组dna酶切：将基因组dna用限制性内切酶alui进行部分酶切，通过琼脂糖凝胶回收dna片段。

(4)平末端连接：将线性化pri857与经alui部分酶切的蜡状芽孢杆菌基因组dna以摩尔比1:3的比例进行连接，在t4dna连接酶的作用下，于16℃过夜连接，然后转化到dh10b电转化感受态细胞中，于30℃培养18h。

试验结果表明：通过ci857阻遏基因来控制pr启动子下游kan^r基因的表达，只有成功插入目的片段的克隆可以在30℃的培养条件下存活，而自连的载体会因为不能表达卡那霉素抗性蛋白而凋亡，挑取10个克隆提质粒，通过bamhi酶切如图9所示。