本发明涉及到核桃低聚肽在抗疲劳功效上的应用，属于生物技术领域。
背景技术：
现代社会生活节奏加快，许多人长期疲劳得不到恢复，造成疲劳感，怠倦感长期得不到恢复，从而处于亚健康状态。基于此，需要寻找抗疲劳的物质来延缓长时间运动，剧烈运动或是精神压力下的疲劳发生。
核桃又名胡桃，学名Juglans regia L，核桃属，与腰果、榛子、扁桃并称世界四大干果。核桃蛋白质中18种氨基酸齐全，且人体所需的8种必需氨基酸含量合理。与核桃蛋白相比，其水解产物核桃低聚肽除氨基酸组成与核桃蛋白一样具有优质蛋白的特点以外，还具有核桃蛋白所不具备的良好的溶解性、稳定性等理化性质，而且具有易吸收和低过敏原性、降低血脂和胆固醇、降低血压、促进矿物质吸收和脂肪代谢、增强运动员体能等多种生理功能，因此开发核桃低聚肽已经成为食品药品领域的研究热点。
考虑到核桃蛋白与多肽的特有性质。本发明进一步按照先期申请专利CN105936927A的制备方法所得核桃低聚肽，考察其在抗疲劳功效有明显的功效，因而可以开发用于预防或者缓解疲劳的药品、食品或者保健食品。
技术实现要素：
本发明公开了参照前期我方核桃低聚肽制备工艺所得核桃多肽，进行体内抗疲劳功效研究。发现其具有明显的抗疲劳功效，可以用于预防或缓解疲劳的食品，保健品或药品。优选剧烈运动或是精神压力造成的疲劳，更优选剧烈运动造成的疲劳。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种核桃低聚肽，采用GB/T 22492-2008附录A与附录B的检测方法，测得肽含量在70wt％以上，其中85％以上核桃低聚肽的分子量小于1500Dalton，其分子量分布如下：
更优选地，肽含量为82.3wt％，小于1500Dalton分子量占94.1％；肽含量为82.9wt％，小于1500Dalton分子量占87.8％；肽含量为75.4wt％，小于1500Dalton分子量占88.4％。
本发明还提供了所述核桃低聚肽粉的制备方法，包括二次酶解步骤；优选地，还包括碱提酸沉法提取蛋白；(2)蛋白酶解；(3)分离纯化。
优选地，所述方法包括下述步骤：
(1)碱提酸沉法提取蛋白：将脱脂后的核桃粕，与水按重量比为1∶5～1∶15混合，调节pH至9～11于室温提取2次，每次1～2h，合并两次碱提液，离心过滤，调节滤液的pH为3～5，静置5～6h，弃去上清液，最后往沉淀物中加入体积比为1∶10～1∶20的水，搅拌均匀；
(2)蛋白酶解：将步骤(1)中的蛋白液加入核桃粕重量的0.1～2％生物酶，调节温度为40～55℃搅拌酶解3～7h后，煮沸灭活10～30min，离心，沉淀物和上清液待用；
(3)分离纯化：将步骤(2)中的上清液使用孔径为0.1～0.5μm的微滤膜进行过滤，透过液再经2000～20000Dalton超滤膜处理后，超滤膜透过液待用，合并步骤(2)中的沉淀物和两种膜的截留液，加入第一次酶解加酶量的10％～30％生物酶调节温度为40～55℃搅拌酶解3～7h后，煮沸灭活10～30min，离心，上清液经孔径为0.1～0.5μm的微滤膜进行过滤，透过液经2000～20000Dalton超滤膜处理后，合并两次酶解的超滤膜透过液，浓缩干燥后，得到核桃低聚肽粉。
优选地，核桃的脱脂选自冷榨、热榨或者有机溶剂脱脂法，优选地使用冷榨脱脂法。
优选地，所述的碱提酸沉法选自连续逆流提取法和普通提取法。
优选地，所述生物酶选自食品级的中性蛋白酶(酶活力≥30万u/g)、木瓜蛋白酶(酶活力≥40万u/g)、菠萝蛋白酶(酶活力≥30万u/g)、碱性蛋白酶(酶活力≥20万u/g)、胃蛋白酶(酶活力≥50万u/g)、胰酶(酶活力≥3000u/g)中的一种或者它们的混合物，优选地使用中性蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶中的一种或者它们的混合物。
优选地，所述浓缩可以为膜浓缩、减压浓缩或常压浓缩；所述干燥可以为喷雾干燥、真空干燥、加热干燥或冷冻干燥。
所述制备工艺为两次酶解，低聚肽产率比单次酶解法提高了4～9％，所制备的低聚肽的肽含量与其分子量分布和单次酶解法相当。
本发明还提供了一种组合物，其含有上述核桃低聚肽粉，和药物或食品上可接受的助剂。
所述组合物的剂型选自素片、薄膜包衣片、糖衣片、肠衣片、分散片、胶囊、颗粒剂、口服溶液或口服混悬液。
所述的核桃低聚粉具有明显的抗疲劳功效，可以用于预防或缓解疲劳的食品，保健品或药品。优选剧烈运动或是精神压力造成的疲劳，更优选剧烈运动造成的疲劳。
实施例
下面通过实施例对本发明作进一步说明。应该理解的是，本发明实施例所述方法仅仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明要求保护的范围。如无特别说明，实施例中用到的所有原料和溶剂均购自Sigma Biochemical and Organic Compounds for Research and Diagnostic Clinical Reagents公司。
核桃多肽制备实施例：
实施例1：
核桃多肽Z-1的制备：将300kg冷榨脱脂后的核桃粕均分成三等份，第一等份核桃粕(记录为A)，与水按重量比为1∶10混合，调节pH至10于室温提取2h；提取完成后，过滤，滤渣进行二次提取，滤液倒入第二等份的核桃粕(记录为B)，调节pH至10于室温提取2h；B完成第一次提取后，滤液待用，滤渣继续进行第二次提取；A完成二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入第三等份的核桃粕(记录为C)，调节pH至10于室温提取2h；B完成二次提取后，滤渣弃去，滤液倒入C完成第一次提取的滤渣中提取2h，而C第一次提取的滤液待用；样品C完成第二次提取后，滤渣弃去，滤液待用；最后合并以上待用滤液，调节pH为5，静置6h，弃去上清液，最后往沉淀物中加入体积比为1∶10的水，搅拌均匀并将pH值调节至中性，再加入1kg中性蛋白酶(酶活力为30万u/g)，调节温度为45℃搅拌酶解6h后，煮沸灭活30min，离心，沉淀物待用；上清液经孔径为0.1μm的微滤膜进行过滤，透过液再经5000Dalton超滤膜处理后，超滤膜透过液待用，合并沉淀物和两种膜的截留液并调节pH值为中性，加入100g中性蛋白酶调节温度为45℃搅拌酶解6h后，煮沸灭活30min，离心，上清液经孔径为0.1μm的微滤膜过滤，透过液经5000Dalton超滤膜处理后，合并两次酶解的超滤膜透过液，减压浓缩至固含4.2％，经喷雾干燥后，得到淡黄色核桃低聚肽粉(批号为：Z-1)，肽含量为82.3wt％，小于1500Dalton分子量占94.1％。
实施例2：
核桃多肽M-1的制备：将冷榨脱脂后的核桃粕100kg，与水按重量比为1∶10混合，调节pH至9.5于室温提取2次，每次2h，合并两次碱提液，离心过滤，调节滤液的pH为5，静置6h，弃去上清液，最后往沉淀物中加入体积比为1∶10的水，搅拌均匀并将pH值调节至中性，加入1kg木瓜蛋白酶(酶活力为50万u/g)，调节温度为50℃搅拌酶解5h后，煮沸灭活30min，离心，沉淀物待用；上清液经孔径为0.1μm的微滤膜进行过滤，透过液再经5000Dalton超滤膜处理后，超滤膜透过液待用，合并沉淀物和两种膜的截留液并调节pH值为中性，加入300g木瓜蛋白酶调节温度为50℃搅拌酶解4h后，煮沸灭活30min，离心，上清液经孔径为0.1μm的微滤膜过滤，透过液经10000Dalton超滤膜处理后，合并两次酶解的超滤膜透过液，减压浓缩至固含4.0％，经喷雾干燥后，得到淡黄色核桃低聚肽粉(批号为：M-1)，肽含量为82.9wt％，小于1500Dalton分子量占87.8％。
实施例3：
核桃多肽B-1的制备：将冷榨脱脂后的核桃粕100kg，与水按重量比为1∶10混合，调节pH至9.5于室温提取2次，每次2h，合并两次碱提液，离心过滤，调节滤液的pH为5，静置6h，弃去上清液，最后往沉淀物中加入体积比为1∶10的水，搅拌均匀并将pH值调节至中性，再加入1kg木瓜蛋白酶(酶活力为100万u/g)，调节温度为55℃搅拌酶解6h后，煮沸灭活30min，离心，沉淀物待用；上清液经孔径为0.1μm的微滤膜进行过滤，透过液再经5000Dalton超滤膜处理后，超滤膜透过液待用，合并沉淀物和两种膜的截留液并调节pH值为中性，加入300g菠萝蛋白酶调节温度为55℃搅拌酶解6h后，煮沸灭活30min，离心，上清液经孔径为0.1μm的微滤膜过滤，透过液经5000Dalton超滤膜处理后，合并两次酶解的超滤膜透过液，减压浓缩至固含3.8％，经喷雾干燥后，得到淡黄色核桃低聚肽粉(批号为：B-1)，测得肽含量为75.4wt％，小于1500Dalton分子量占88.4％。
生物活性实施例1：
1.斑马鱼抗疲劳实验最大耐受浓度(MTC)测定：
1.1实验动物：
野生型AB品系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行。年龄为受精后4天(4dpf)，共1740尾，每个孔(即每个浓度组)30尾。用于确定供试品MTC测定。
斑马鱼均饲养于28℃的养鱼用水中(水质：每1L反渗透水中加入200mg速溶海盐，电导率为480～510μS/cm；pH为6.9～7.2；硬度为53.7～71.6mg/L CaCO3)，实验动物使用许可证号为：SYXK(浙)2012-0171。饲养管理符合国际AAALAC认证的要求。
1.2实验方法：
随机选取4dpf野生型AB品系斑马鱼1740尾于六孔板中，每孔(即每个浓度组)30尾，分别水溶给予“Z-1”、“B-1”、“M-1”、分别按500、1000、1500、2000μg/mL浓度，同时设置正常对照组，即养鱼用水处理斑马鱼，每孔容量为3mL。在实验过程中，每天观察记录斑马鱼的死亡情况并移除死亡的斑马鱼。供试品处理结束后，统计各实验组的斑马鱼死亡数量和毒性情况，分析并确定供试品的MTC。如果在最初的浓度检测实验中不能得到MTC，则可调整供试品的检测浓度，上限是2000μg/mL或供试品最大可给样浓度，下限是0.1μg/nL。
2.斑马鱼运动能力改善作用测定：
2.1实验动物：
野生型AB品系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行。年龄为受精后4天(4dpf)，共390尾。用于评价供试品对亚硫酸钠诱发的疲劳斑马鱼的运动改善作用。
斑马鱼均饲养于28℃的养鱼用水中(水质：每1L反渗透水中加入200mg速溶海盐，电导率为480～510μS/cm；pH为6.9～7.2；硬度为53.7～71.6mg/L CaCO3)，实验动物使用许可证号为：SYXK(浙)2012-0171。饲养管理符合国际AAALAC认证的要求。
2.2疲劳模型：
用8mg/mL亚硫酸钠处理野生AB品系斑马鱼2h，建立斑马鱼疲劳模型。
阳性对照药中华跌打丸，每丸6克，批号130103，购自广西梧州制药(集团)股份有限公司。临用时养鱼水配制成20mg/mL的母液，实验时用养鱼用水稀释成所需浓度，现用现配。
2.3实验方法：
随机选取4dpf野生型AB品系斑马鱼390尾于六孔板中，每孔(即每个供试品组)30尾，分别水溶给予“Z-1”、“B-1”、“M-1”MTC浓度，阳性对照药中华跌打丸1.0mg/mL浓度，同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3mL。供试品预处理一段时间后，除正常对照组外，其余实验组均同时水溶给予亚硫酸钠以诱发斑马鱼疲劳模型。供试品和亚硫酸钠共同处理斑马鱼一段时间后，每个实验组随机选取10尾斑马鱼，利用行为分析，测定斑马鱼的运动总距离(S)，定量评价供试品对亚硫酸钠诱发的疲劳斑马鱼的运动改善作用。供试品对斑马鱼运动能力改善作用计算公式如下：
用方差分析和Dunnett’s T-检验进行统计学分析，p＜0.05表明具有显著性差异，提供具有代表性的实验图谱。
3.斑马鱼体内乳酸含量测定：
3.1实验动物：
野生型AB品系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行。年龄为受精后4天(4dpf)，共1440尾。用于评价供试品对亚硫酸钠诱发的疲劳斑马鱼体内乳酸含量的影响。
斑马鱼均饲养于28℃的养鱼用水中(水质：每1L反渗透水中加入200mg速溶海盐，电导率为480～510μS/cm；pH为6.9～7.2；硬度为53.7～71.6mg/L CaCO3)，实验动物使用许可证号为：SYXK(浙)2012-0171。饲养管理符合国际AAALAC认证的要求。
3.2疲劳模型：
用8mg/mL亚硫酸钠处理野生AB品系斑马鱼2h，建立斑马鱼疲劳模型。
阳性对照药中华跌打丸，每丸6克，批号130103，购自广西梧州制药(集团)股份有限公司。临用时养鱼水配制成20mg/mL的母液，实验时用养鱼用水稀释成所需浓度，现用现配。
3.3实验方法
随机选取4dpf野生型AB品系斑马鱼810尾于六孔板中，每孔(即每个供试品组)30尾，分别水溶给予“Z-1”、“B-1”、“M-1”MTC浓度，阳性对照药中华跌打丸1.0mg/mL浓度，同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3mL；每个实验组设置3个平行。供试品预处理一段时间后，除正常对照组外，其余实验组均同时水溶给予亚硫酸钠以诱发斑马鱼疲劳模型。供试品和亚硫酸钠共同处理斑马鱼一段时间后，每个实验组将3个平行实验组中的斑马鱼汇集在一起(共90尾)，按照乳酸测定试剂盒说明书，利用NanoDrop2000超微量分光光度计间接测定斑马鱼体内乳酸含量，分别定量评价“0415”、“0418”、“0420”、“0422”、“0601-3”和“0506”在MTC浓度下对亚硫酸钠诱发的疲劳斑马鱼体内的乳酸含量的影响，并计算乳酸含量降低率。其计算公式为：
用方差分析和Dunnett’s T-检验进行统计学分析，p＜0.05表明具有显著性差异。
4抗疲劳实验结果
4.1核桃多肽最大可耐受浓度(MTC)实验结果：
4.1.1核桃多肽Z-1最大可耐受浓度
4.1.2核桃多肽B-1最大可耐受浓度
4.1.2核桃多肽M-1最大可耐受浓度
以上三种核桃多肽产品可耐受浓度均大于2000μg/mL，具有很好的安全性。
4.2核桃多肽运动改善作用
与模型对照组比较，*P＜0.0001
4.3核桃多肽对体内乳酸含量影响
与模型对照组比较，*p＜0.001。
斑马鱼抗疲劳实验结果表明，采用我方申请专利CN105936927A的制备方法所得核桃低聚肽，具有很好的安全性，以及对体内运动距离和促进乳酸代谢均显阳性。该生物活性结果说明核桃低聚粉具有明显的抗疲劳功效，可以用于预防或缓解疲劳的食品，保健品或药品。