发明领域
本发明涉及合成的共有(consensus)口蹄疫病毒(fmdv)免疫原性蛋白和编码此类蛋白的核酸分子、抗fmdv的疫苗、用于诱导抗fmvd的免疫反应的方法、用于区分被fmdv感染的个体与已接种的抗fmdv的个体的方法以及预防性和/或治疗性免疫个体以抗fmdv的方法。
发明背景
口蹄疫是驯养和野生偶蹄动物(包括牛、猪、山羊和鹿)的高度接触性传染病，其在宿主细胞中快速复制并且传播至接触易感性动物。该疾病的特征在于发热、跛行以及舌、足、口鼻部和乳头的水疱性病变，从而导致成年动物的高发病率但死亡率较低。病原体(causativeagent)为口蹄疫病毒(fmdv)(细小rna病毒科的口疮病毒属的种的类型)。fmdv为由二十面体衣壳(具有4种结构蛋白vp1-4，每一种蛋白60个拷贝)包围的约8500个碱基的单链正义rna基因组并且在抗原性上高度可变，具有几个亚型(包括a、asia1、o、c、sat1、sat2和sat3)。最近口蹄疫在许多先前无疾病国家(包括1997年在中国台湾、2001年在英国和荷兰的暴发)以及在几个南美国家的出现已提高了对该经济破坏性病毒的认识。此外，全世界都在关注可能的恐怖分子袭击可能利用fmdv攻击例如1000亿美元/年畜牧业的国家。
先前控制fmdv的措施包括宰杀感染的或接触传染病的动物和排除污染。如果国家在最近暴发后3个月呈现无fmdv状况，则因fmdv暴发而宰杀它们的家畜的国家才可有重新开始家畜活动。国家通常将接种动物以治疗fmdv暴发用作最后一着，因为已接种动物并且未宰杀动物的国家必须等待整整一年来恢复无fmd状态。然而国家期望在任何fmdv暴发之前接种它们的动物并且能够保持它们的无fmd状态。
过去，fmdv疫苗包括化学灭活的完整病毒抗原和佐剂；然而，对此存在不利方面，因为其需要昂贵的高污染制造设施来生产疫苗。在过去25-30年中，研究者一直努力开发在单次接种后提供保护作用的疫苗。这些努力包括从病毒颗粒纯化的vp1、生物工程改造的vp1、vp1肽、化学合成vp1肽、表达vp1表位的活载体的使用、利用编码vp1表位的dna的接种以及使用从fmdv感染的培养物产生的全长衣壳蛋白vp1-4或通过复制缺陷型人腺病毒5型(ad5)载体进行的vp1-4的递送。所有这些方法仅给接种的动物提供有限数量的跨所有fmdv病毒亚型的表位。
因此，在本领域存在对诊断fmdv感染的哺乳动物的疫苗和方法的需要，所述疫苗和方法适合于提供抗跨fdmv的不同亚型的多个表位的保护作用。
发明概要
本文中提供了分离的核酸，所述核酸包含编码口蹄疫病毒亚型a、asia1、c、o、sat1、sat2、sat3、sat4的vp1-4的共有氨基酸序列的序列或其互补序列。所述核酸可包括选自(a)seqidno:17-23；(b)编码24-30的氨基酸序列的核苷酸序列；(c)(a)的80％变体；和(a)或(b)的互补序列的序列。还提供了包含异源序列的载体，其中所述异源序列由上述序列组成。
本文中还提供了能够在哺乳动物中产生抗多个口蹄疫病毒(fmdv)亚型的免疫反应的疫苗，其中所述疫苗包含包括有效地连接于编码序列(其编码包含来自一个或多个fmdv亚型的衣壳蛋白vp1-4的共有fmdv抗原)的启动子的dna质粒和药学上可接受的赋形剂，其中dna质粒能够在哺乳动物的细胞中以有效地引起哺乳动物的免疫反应的量表达共有fmdv抗原。所述疫苗可产生抗fmdv亚型a、asia1、c、o、sat1、sat2、sat3或其组合的免疫反应。疫苗的质粒的编码序列可具有选自seqidno:1-7或其组合的fmdv抗原。疫苗的质粒的编码序列还可包括n末端前导序列，其中所述前导序列为igg或ige。疫苗的质粒还可在编码序列的3’末端之后包含多腺苷酸化序列。疫苗的质粒还可包括编码来自亚型a、asia1、c、o、sat1、sat2或sat3的共有fmdv3c蛋白酶的核苷酸序列。fmdv3c蛋白酶的核苷酸序列可以为seqidno:15并且可由seqidno:16所示的氨基酸序列编码。可对疫苗的质粒进行密码子最优化。fmdv抗原的编码序列还可包括vp1-4和3c蛋白酶(包括seqidno:7-14)。疫苗的药学上可接受的赋形剂可以是佐剂并且所述佐剂可以为il-2或il-15。疫苗的药学上可接受的赋形剂可以是转染促进剂。转染促进剂可以是浓度低于6mg/ml的聚阴离子、聚阳离子或脂质例如聚-l-谷氨酸。可给猪、反刍动物、人或灵长类动物施用疫苗。所述疫苗可引起体液或细胞或体液及细胞反应。
本文中还提供了能够在哺乳动物中产生抗多个口蹄疫病毒(fmdv)亚型的免疫反应的疫苗，其中所述疫苗包括一种或多种包含有效地连接于编码序列(编码包含来自选自亚型a、asia1、c、o、sat1、sat2、sat3或其组合的一个或多个fmdv亚型的衣壳蛋白vp1-4的共有fmdv抗原)的启动子的dna质粒和其药学上可接受的赋形剂，其中所述dna质粒能够在哺乳动物的细胞中以有效地引起哺乳动物的免疫反应的量表达共有fmdv抗原。fmdv抗原的编码序列可选自seqidno:1-7或其组合。疫苗的质粒还可包括编码亚型a、asia1、c、o、sat1、sat2或sat3的fmdv的共有3c蛋白酶的核苷酸序列，并且可包括seqidno:15所示的核苷酸序列。可给哺乳动物例如猪、反刍动物、人或灵长类动物施用疫苗。疫苗可在哺乳动物中引起免疫反应例如体液、细胞或体液及细胞反应。
本文中还提供了能够在哺乳动物中产生抗多个fdmv亚型的免疫反应，其中所述疫苗包含包括一个或多个编码口蹄疫病毒(fmdv)亚型a、asia1、c、o、sat1、sat2或sat3的衣壳蛋白vp1-4的共有氨基酸序列的抗原和其药学上可接受的赋形剂。fmdv抗原的编码氨基酸序列可以是seqidno:24-30。药学上可接受的赋形剂可以是选自il-2和il-15的佐剂。疫苗的药学上可接受的赋形剂可以是转染促进剂。转染促进剂可以是浓度低于6mg/ml的聚阴离子、聚阳离子或脂质例如聚-l-谷氨酸。还可给哺乳动物例如猪、反刍动物、人或灵长类动物施用疫苗。疫苗可在哺乳动物中引起免疫反应例如体液、细胞或体液及细胞反应。
本文中还提供了用于在哺乳动物中引起抗多个fmdv病毒亚型的免疫反应的方法，包括将权利要求1或21的dna质粒疫苗递送至哺乳动物的组织并且以有效地允许dna质粒进入细胞的恒定电流利用脉冲能量对组织的细胞进行电穿孔。方法中权利要求1的dna质粒的递送可包括将dna质粒疫苗注射入真皮内、皮下或肌肉组织。可通过预设电流来递送所述方法的dna质粒，并且脉冲能量处于等于当前电流的恒定电流。方法的电穿孔步骤还可包括测量电穿孔细胞的阻抗，相对于测量的阻抗调整脉冲能量的能量水平以维持电穿孔细胞中的恒定电流，其中测量和调整步骤在脉冲能量的寿命内进行。电穿孔步骤还可包括按照以分散模式递送脉冲能量的脉冲序列模式将脉冲能量递送至多个电极。
还提供了诊断被fmdv感染的哺乳动物的方法，其中所述方法包括从哺乳动物分离液体样品，从哺乳动物的液体样品分离抗体，以及将从步骤b分离的抗体与已用权利要求3的疫苗接种的对照哺乳动物相比较，其中对照哺乳动物只具有针对fmdvvp1-4蛋白的抗体，被感染的fmdv哺乳动物具有针对fmdvvp1-4蛋白和fmdv非结构蛋白的抗体。非结构蛋白可以是fmdv2c、3a和3d聚合酶。
提供了分离的核酸分子，所述核酸分子包含编码具有如下的蛋白质的序列：一个或多个具有或不具有前导序列的选自seqidno:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40和42中的一个或多个的序列、其互补序列、其包含至少20个氨基酸的免疫原性片段的序列、与seqidno:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40和42具有80％或更多同源性的变体、其互补序列、其包含至少20个氨基酸的免疫原性片段及其互补序列。
在某些实施方案中，所述核酸序列选自具有或不具有前导序列的seqidno:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39和41、其互补序列、其编码至少20个氨基酸的片段、其互补序列、与seqidno:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39和41具有80％同源性的核酸分子、其互补序列、其编码至少20个氨基酸的片段及其互补序列。
提供了疫苗，所述疫苗包含此类核酸分子和/或一种或多种蛋白质，所述蛋白质选自具有或不具有前导序列的seqidno:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40和42、其包含至少20个氨基酸的免疫原性片段、与seqidno:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40和42具有80％或更多同源性的变体和其包含至少20个氨基酸的免疫原性片段。
还提供了组合物，其包含一种或多种选自具有或不具有前导序列的seqidno:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40和42的蛋白质、其包含至少20个氨基酸的免疫原性片段、与seqidno:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40和42具有80％或更多同源性的变体和其包含至少20个氨基酸的免疫原性片段。
提供了用于在哺乳动物中引起抗一个或多个fmdv病毒亚型的免疫反应的方法。所述方法包括使用此处公开的疫苗并且，在某些实施方案中，可包括如下步骤：给哺乳动物的组织施用编码具有fmdv免疫原性序列的蛋白质的核酸分子；和以有效地允许dna质粒进入细胞的恒定电流用脉冲能量对组织的细胞进行电穿孔。
还提供了用于在按照本文中公开的方法接种的哺乳动物中诊断被fmdv感染的哺乳动物的方法。所述方法包括从接种的哺乳动物分离液体样品，和检测未包括在所述疫苗中的fmdv蛋白和/或抗未包括在所述疫苗中的fmdv蛋白的抗体的存在。这类fmdv蛋白和/或抗这类fmdv蛋白的抗体的存在表明接种的哺乳动物已被fmdv感染。
发明详述
已产生了用于融合蛋白的共有氨基酸序列，所述融合蛋白包含来自不同血清类型的多种fmdv蛋白和单个fmdv蛋白。还产生了编码所述蛋白质的核酸分子。
在本发明的一个方面，存在融合蛋白，包含共有fmdv蛋白vp1、vp2、vp3、vp4和/或3c和编码此类蛋白的核酸，所述融合蛋白可被产生并且用于疫苗中从而为哺乳动物提供抗跨一个或多个fmdv亚型(包括a、asia1、o、c、sat1、sat2和sat3)的口蹄疫的保护作用。
在本发明的另一个方面，存在来自两个不同亚型的融合蛋白，包含共有fmdv蛋白vp1和编码此类蛋白的核酸，所述融合蛋白可被产生并且用于疫苗中从而为哺乳动物提供抗跨一个或多个fmdv亚型(包括a、asia1、o、c、sat1、sat2和sat3)的口蹄疫的保护作用。
在本发明的另一个方面，存在的共有fmdv蛋白vp1和编码它们的核酸序列。它们可被产生并且用于疫苗中从而为哺乳动物提供抗跨一个或多个fmdv亚型(包括a、asia1、o、c、sat1、sat2和sat3)的口蹄疫的保护作用。
然而不受特定理论的束缚，抗一个或多个mdv亚型的vp1、vp2、vp3和/或vp4的共有氨基酸序列的疫苗将提供在引发有效的抗每一个fmdv亚型内的大部分种类的免疫反应(体液、细胞或两者)中是有效的一大组表位。本发明涉及使用fmdv亚型的这些共有氨基酸vp1、vp2、vp3和/或vp4序列产生待用于疫苗(所述疫苗用于给哺乳动物施用以提供抗fmdv的预防性保护)的适当的质粒和蛋白质。同样地，本发明还涉及使用fmdvvp1、vp2、vp3和/或vp4抗原的这些共有序列鉴定和区分已被适当接种并且未被感染的哺乳动物与已被fmdv感染(通过对针对fmdv的非结构蛋白质例如3d聚合酶的抗体的检测)的哺乳动物的诊断方法。
然而不受特定理论的束缚，vp1为抗vp1的共有氨基酸序列的疫苗的优良免疫原性靶。vp1为优势免疫原。
1.定义
本文中所使用的术语仅仅为了描述特定实施方案并且无意进行限定。除非上下文中明确另有说明，否则说明书和所附权利要求中所使用的单数形式“一种/个(a)”、“一种/个(an)”和“该/所述(the)”包括复数所指物。
对于本文中数值范围的引用，明确地包括以相同的精度存在于其间的每一个插入数值。例如，对于6-9的范围，除了6和9外还包括数值7和8，对于范围6.0-7.0，明确地包括数值6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。
a.佐剂
本文中所使用的“佐剂”可以意指添加至本文中描述的dna质粒疫苗以增强口蹄疫病毒(fmdv)抗原(其由在下文中描述的dna质粒和编码核酸序列编码)的抗原性的任何分子。
b.抗体
“抗体”可意指种类igg、igm、iga、igd或ige的抗体或其片段或衍生物，包括fab、f(ab')2、fd和单链抗体、双抗体、双特异性抗体、双功能抗体及其衍生物。抗体可以是从哺乳动物的血清样品分离的抗体、多克隆抗体、亲和纯化的抗体或其混合物，所述抗体显示足够的对期望的表位或来源于其的序列的结合特异性。
c.编码序列
本文中所使用的“编码序列”或“编码核酸”可以意指包含编码蛋白质的核苷酸序列的核酸(rna或dna分子)。编码序列还可包括起始信号和终止信号，所述起始信号和终止信号有效地连接于能够在对其施用了所述核酸的个体或哺乳动物的细胞中指导表达的调控元件(包括启动子和多腺苷酸化信号)。
d.互补序列
本文中所使用的“互补序列(complement)”或“互补的(complementary)”可以意指核酸，可以意指核酸分子的核苷酸或核苷酸类似物之间的沃尔森-克里克(例如，a-t/u和c-g)或hoogsteen碱基配对。
e.共有区或共有序列
本文中所使用的“共有区”或“共有序列”可以意指基于特定流感抗原的多个亚型的比对分析构建的合成的核酸序列或相应多肽序列，其可用于诱导抗特定流感抗原的多个亚型或血清型的广泛免疫。共有fmdv抗原可包括vp1、vp2、vp3、vp4和c2蛋白酶核苷酸和氨基酸序列。同样地，还可将合成抗原例如融合蛋白操作成共有序列(或共有抗原)。
f.恒定电流
本文中所使用的“恒定电流”定义了在被递送至相同组织的电脉冲的持续时间中被组织或界定所述组织的细胞接收或经受的电流。电脉冲源自从本文中描述的电穿孔装置。该电流在电脉冲的寿命期间以恒定的安培度保持在所述组织中，因为本文中提供的电穿孔装置具有反馈元件，从而优选具有瞬时反馈。反馈元件可在整个脉冲持续过程中测量组织(或细胞)的电阻并且引起电穿孔装置改变其电能输出(例如，增加电压)，这样相同组织中的电流在整个电脉冲过程中(在微秒的量级上)以及脉冲之间保持恒定。在某些实施方案中，反馈元件包括控制器。
g.电流反馈或反馈
本文中所使用的“电流反馈”或“反馈”可互换使用并且可以意指提供的电穿孔装置的活动响应，其包括测量电极之间的组织中的电流和相应地改变由ep装置递送的能量输出，以将电流维持在恒定水平上。该恒定水平是由用户在开始脉冲序列或电处理之前预先设置的。反馈可通过电穿孔装置的电穿孔组件例如控制器来实现，因为其中的电路能够连续监控电极之间的组织中的电流并且将该监控的电流(或组织内的电流)与预设电流相比较，以及不断地进行能量输出调整以将监控的电流维持在预设水平上。由于反馈回路为模拟闭合环反馈，因此其可以是瞬时的。
h.分散电流
本文中所使用的“分散电流”可以意指从本文中描述的电穿孔装置的各种针电极阵列传递的电流的模式，其中所述模式使待被电穿孔的组织的任何区域上的电穿孔相关热应激的发生降至最低或优选消除其发生。
i.电穿孔
本文中可互换使用的“电穿孔”、“电通透作用(electro-permeabilization)”或“电动力学增强(electro-kineticenhancement)”(“ep”)可以指使用跨膜电场脉冲来在生物膜上诱导极微小的路径(孔)；它们的存在允许生物分子例如质粒、寡核苷酸、sirna、药物、离子和水从细胞膜的一侧穿过进入另一侧。
j.反馈机制
本文中所使用的“反馈机制”可以指通过软件或硬件(或固件)进行的过程，所述过程接收和比较期望的组织的阻抗(在递送脉冲能量之前、期间和/或之后)与预设值(优选电流)，然后调整所递送的脉冲能量以达到所述预设值。可通过模拟闭环回路进行反馈机制。
k.片段
本文中所使用的“片段”可以意指核酸的一部分，所述部分编码能够在哺乳动物中引起与至少一个fmdv亚型例如a、asia1、c、o、sat1、sat2或sat3的非片段引起的免疫反应大体上相似的免疫反应的多肽。所述片段可以是选自本发明的各种编码核苷酸序列(包括seqidno:1-7和15-21)的至少一个的dna片段。所述片段可包括seqidno:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39和41的核酸序列的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。片段可包括seqidno:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39和41的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％，提供的片段包括氨基酸21、86、127、129、154、156、182、195、206、218、220、237、249、255、265、271或275的一个或多个。所有此类片段也可任选地不包括氨基酸。dna片段在长度上可以为30或更多个核苷酸，在长度上为45或更多、60或更多、75或更多、90或更多、120或更多、150或更多、180或更多、210或更多、240或更多、270或更多、300或更多、360或更多、420或更多、480或更多、540或更多、600或更多、660或更多、720或更多、780或更多、840或更多、900或更多、960或更多、1020或更多、1080或更多、1140或更多、1200或更多、1260或更多、1320或更多、1380或更多、1440或更多、1500或更多、1560或更多、1620或更多、1680或更多、1740或更多、1800或更多、1860或更多、1820或更多、1880或更多、1940或更多、2000或更多、2600或更多、2700或更多、2800或更多、2900或更多、2910或更多、2920或更多、2930或更多、2931或更多、2932或更多、2933或更多、2934或更多、2935或更多、2936或更多、2937或更多或2938或更多个核苷酸。
dna片段可包括免疫球蛋白前导序列例如ige或igg序列的编码序列。
dna片段可少于10个核苷酸、少于20、少于30、少于40、少于50、少于60、少于75、少于90、少于120、少于150、少于180、少于210、少于240、少于270、少于300、少于360、少于420、少于480、少于540、少于600、少于660、少于720、少于780、少于840、少于900、少于960、少于1020、少于1080、少于1140、少于1200、少于1260、少于1320、少于1380、少于1440、少于1500、少于1560、少于1620、少于1680或少于1740个核苷酸、少于1800、少于1860、少于1820、少于1880、少于1940、少于2000、少于2600、少于2700、少于2800、少于2900、少于2910、少于2920、少于2930、少于2931、少于2932、少于2933、少于2934、少于2935、少于2936、少于2937或少于2938个核苷酸。
“片段”还可表示能够在哺乳动物中引起与至少一个fmdv亚型例如a、asia1、c、o、sat1、sat2或sat3的非片段引起的免疫反应大体上相似的免疫反应的多肽片段。片段可以是选自本发明的各种编码多肽序列(包括seqidno:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40和42)的至少一个的多肽片段。可分析多肽片段以接触由公共可获得的数据库例如losalamos国家实验室的fmdv序列数据库提供的至少一个抗原性表位。蛋白质的片段可包括seqidno:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40和42的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。多肽可包括免疫球蛋白前导序列例如ige或igg的氨基酸序列。多肽片段在长度上可为30或更多个氨基酸，在长度上可为45或更多、60或更多、75或更多、90或更多、120或更多、150或更多、180或更多、210或更多、240或更多、270或更多、300或更多、360或更多、420或更多、480或更多、540或更多、600或更多、660或更多或710个氨基酸或更多氨基酸。肽片段在长度上可少于10个氨基酸、少于20、少于30、少于40、少于50、少于60、少于75、少于90、少于120、少于150、少于180、少于210、少于240、少于270、少于300、少于360、少于420、少于480、少于540、少于600、少于660、少于700、少于701、少于702、少于703、少于704、少于705、少于706、少于707、少于708、少于709或少于710个氨基酸。
l.同源性
可使用clustalw(http://www.ebi.ac.uk/tools/clustalw2/index.html)产生多个序列比对的同源性。
m.同一性
本文中所使用的“相同的”或“同一性”在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中可以意指序列具有指定百分比的在指定区域内相同的残基。可如下计算百分比：通过任选地将两个序列对齐，在指定的区域中比较两个序列，测定两个序列中在其上存在相同残基的位点的数目以产生匹配位点的数目，将匹配位点的数目除以指定区域的位点总数，然后将结果乘以100来产生序列同一性的百分比。在其中两个序列具有不同长度或比对产生一个或多个交错末端并且指定的比较区域只包括单一序列的情况下，将单个序列的残基包括在计算的分母中而非分子中。当比较dna和rna时，可认为胸腺嘧啶(t)和尿嘧啶(u)是等同的。可手工或通过使用计算机序列算法例如blast或blast2.0来计算同一性。
n.阻抗
当讨论反馈机制时可使用本文中所使用的“阻抗”，可按照欧姆定律将其转换成电流值，从而使得能够与预设电流进行比较。
o.免疫反应
本文中使用的“免疫反应”可以意指宿主的免疫系统例如哺乳动物的免疫系统响应fmdv共有序列的引入(通过提供的dna质粒疫苗)的激活。免疫反应可以以细胞或体液反应或两者的形式存在。
p.核酸
本文中所使用的“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”可意指至少两个共价连接在一起的核苷酸。单链的描述也确定了互补链的序列。因此，核酸还包括被描述的单链的互补链。核酸的许多变体可用于与给定的核酸相同的目的。因此，核酸还包括大体上相同的核酸及其互补序列。单链提供了可在严格杂交条件下与靶序列杂交的探针。因此，核酸还包括在严格杂交条件下杂交的探针。
核酸可以是单链或双链的，或可包含双链和单链序列的部分。核酸可以是dna(基因组dna和cdna)、rna或杂交体，其中核酸可包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，以及碱基(包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤)的组合。核酸可通过化学合成法或通过重组法获得。
核酸通常包括磷酸二酯键，虽然可包括核酸类似物，所述核酸类似物可具有至少一个不同的连接例如氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或o-甲基亚磷酰胺连接以及肽核酸主链和连接。其它核酸类似物包括具有带正电荷主链(positivebackbone)、非离子型主链和非核糖主链的核酸类似物，包括美国专利no.5,235,033和5,034,506(将所述专利通过引用并入本文)中描述的核酸类似物。包括一个或多个非天然存在或修饰的核苷酸的核酸也包括在核酸的定义内。修饰核苷酸类似物可位于例如核酸分子的5'末端和/或3'末端。核苷酸类似物的代表性实例可选自糖-或主链-修饰的核糖核苷酸。然而应当指出，包含非天然存在的核碱基而非天然存在的核碱基的核碱基修饰的核苷酸即核糖核苷酸，例如在5-位上被修饰的尿苷或胞苷例如5-(2-氨基)丙基尿苷、5-溴尿苷；在8-位上被修饰的腺苷和鸟苷例如8-溴鸟苷；脱氮核苷酸例如7-脱氮-腺苷；o-和n-烷基化的核苷酸例如n6-甲基腺苷也是合适的。2'-oh-基团可被选自h、or、r、卤素、sh、sr、nh2、nhr、nr2或cn的基团替代，其中r为c1-c6烷基、烯基或炔基并且卤素为f、cl、br或i。修饰核苷酸还包括通过例如krutzfeldt等人，nature(2005年10月30日)，soutschek等人，nature432:173-178(2004)和美国专利公布no.20050107325(将所述文献和专利公布通过引用并入本文)中描述的羟脯氨醇连接与胆固醇缀合的核苷酸。修饰核苷酸和核酸还可包括锁核酸(lockednucleicacid)(lna)，如美国专利no.20020115080(将其通过引用并入本文)中所描述的。其它修饰核苷酸和核酸描述于美国专利公布no.20050182005(将其通过引用并入本文)中。可因多个原因进行磷酸核糖主链的修饰例如以增加这类分子在生理环境中的稳定性和半衰期，以增强穿过细胞膜的扩散，或作为生物芯片上的探针。可制备天然存在的核酸和类似物的混合物；可选择地，可制备不同核酸类似物的混合物和天然存在的核酸与类似物的混合物。
q.有效连接的
本文中所使用的“有效连接的”可以意指基因的表达处于与其空间上连接的启动子的控制之下。启动子可位于处于其控制之下的基因的5'(上游)或3'(下游)。启动子与基因之间的距离可以与所述启动子所源自的基因中启动子与其控制的基因之间的距离大致相同。这在本领域是已知的，该距离的变化可被容纳而不丧失启动子功能。
r.启动子
本文中所使用的“启动子”可以意指能够赋予、激活或增强核酸在细胞中表达的合成或天然来源的分子。启动子可包括一个或多个特异性转录调控序列以进一步增强表达和/或改变相同基因的空间表达和/或时间表达。启动子还可包括离转录的起始位点多至数千碱基对的远侧增强子或抑制元件(repressorelement)。启动子可源自包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫和动物的来源。启动子可组成型地或差异地(针对其中表达发生的细胞、组织或器官或针对表达发生时所处的发育阶段，或响应外部刺激例如生理应激、病原体、金属离子或诱导剂)调节基因组件的表达。启动子的代表性实例包括细菌噬菌体t7启动子、细菌噬菌体t3启动子、sp6启动子、lac操纵子-启动子、tac启动子、sv40晚期启动子、sv40早期启动子、rsv-ltr启动子、cmvie启动子、sv40早期启动子或sv40晚期启动子和cmvie启动子。
s.严格杂交条件
本文中所使用的“严格杂交条件”可以意指在其下第一核酸序列(例如，探针)将与例如核酸的复杂混合物中的第二核酸序列(例如，靶)杂交的条件。严格条件是序列依赖性的并且在不同的情况下不同。严格条件可经选择为比特定序列在确定的离子强度ph下的热解链温度(thermalmeltingpoint)(tm)低约5-10℃。tm可以是平衡时50％的与靶互补的探针与靶序列杂交(由于靶序列过量存在，因此在tm下，50％的探针在平衡时被占据)所处的温度(在确定的离子强度、ph和核酸浓度下)。严格条件可以是这样的条件，其中盐浓度低于约1.0m的钠离子，例如在ph7.0至8.3下约0.01-1.0m的钠离子浓度(或其它盐)并且温度为至少约30℃(对于短探针(例如，约10-50个核苷酸)而言)和至少约60℃(对于长探针(例如，超过约50个核苷酸)而言)。严格杂交还可通过添加去稳定剂例如甲酰胺来获得。对于选择性或特异性杂交，正信号可以为至少2至10倍于本底的杂交。示例性严格杂交条件包括下列条件：50％甲酰胺，5xssc和1％sds，于42℃下温育，或5xssc，1％sds，于65℃下温育，在65℃下于0.2xssc和0.1％sds中进行洗涤。
t.大体上互补
本文中所使用的“大体上互补”可以意指第一序列与8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个核苷酸或氨基酸的区域上与第二序列的互补序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的同一性，或两个序列在严格杂交条件下杂交。
u.大体上相同的
本文中所使用的“大体上相同的”可以意指第一与第二序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个核苷酸或氨基酸的区域上具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的同一性，或对于核酸而言，如果第一序列与第二序列的互补序列大体上互补。
v.亚型或血清型
在本文中可互换所使用并且关于fmdv病毒的“亚型”或“血清型”意指fmdv病毒抗原的遗传变体，以便一个亚型与不同亚型可被免疫系统识别区分开来。
w.变体
本文中所使用的针对核酸的“变体”可以意指(i)参照的核苷酸的部分或片段；(ii)参照的核苷酸序列或其部分的互补序列；(iii)与参照的核酸或其互补序列大体上相同的核酸；或(iv)在严格条件下与参照的核酸、其互补序列或与其大体上相同的序列杂交的核酸。
针对肽或多肽的“变体”意指在氨基酸序列上相异在于氨基酸的插入、缺失或保守置换，但保留至少一种生物活性的肽或多肽。变体还可以指具有在氨基酸序列上与参照蛋白质大体上相同的氨基酸序列的蛋白质，所述蛋白质保留至少一种生物活性。氨基酸的保守置换，即用具有相似性质(例如，亲水性、带电荷区域的程度和分布)的不同氨基酸替代氨基酸，在本领域被认为通常包括较小的改变。这些较小的改变可部分地通过考虑氨基酸的亲水指数来鉴定，如本领域中所理解的。kyte等人，j.mol.biol.157:105-132(1982)。氨基酸的亲水指数基于其疏水性和电荷的考虑。在本领域中已知具有相似亲水指数的氨基酸可被置换并且仍保持蛋白质功能。在一个方面，具有为±2的亲水指数的氨基酸被置换。氨基酸的亲水性也可用于展现可导致保留生物功能的蛋白质的置换。在肽的上下文中氨基酸的亲水性的考虑允许计算该肽的最大局部平均亲水性，这是已被报导与抗原性和免疫原性充分相关的有用测量。美国专利no.4,554,101，通过引用整体并入本文。具有相似亲水性值的氨基酸的置换可导致保留生物活性例如免疫原性的肽，这在本领域是被理解的。可利用彼此具有在±2内的亲水性值的氨基酸进行置换。氨基酸的疏水性指数和亲水性值都受到该氨基酸的特定侧链影响。与该观察相一致地，与生物功能相容的氨基酸置换经理解取决于氨基酸(特别是这些氨基酸的侧链)的相对相似性，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小和其它性质所揭示的。
x.载体
本文中所使用的“载体”可以意指包含复制起始点的核酸序列。载体可以是质粒、细菌噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是dna或rna载体。载体可以是自主复制染色体外载体或整合入宿主基因组的载体。
2.fmdv蛋白
本文中提供了能够在哺乳动物中引起抗一个或多个口蹄疫病毒(fmdv)亚型的免疫反应的抗原。所述抗原可以是包含衣壳蛋白vp1、vp2、vp3、vp4、其共有序列、其变体、其片段或其组合的fmdv抗原。fmdv抗原可来自fmdv亚型a、asia1、c、o、sat1、sat2或sat3。fmdv抗原可包含至少一个抗原性表位，所述表位可以对于可针对其诱导免疫反应的特定fmdv免疫原是有效的。fmdv抗原的空病毒衣壳蛋白vp1-4提供了一整套存在于完整fmdv病毒中的免疫原性位点和表位。共有fmdv抗原序列可源自来自一个fmdv亚型的多种fmdv病毒的fmdv抗原序列。共有fmdv抗原可包括vp1、vp2、vp3和vp4fmdv亚型共有蛋白质序列，其可以是共有vp1-4蛋白。共有vp1-4蛋白可包括至少一个fmdv蛋白3c的切割位点。蛋白3c的切割位点可存在于共有vp1-4蛋白的每一个共有vp1、vp2、vp3和vp4序列之间。蛋白3c对共有vp1-4蛋白的切割可切割共有vp1-4蛋白以产生共有vp1-蛋白、共有vp2-蛋白、共有vp3-蛋白和共有vp4蛋白。可选择，天然蛋白水解切割位点可存在于每一个共有抗原序列之间，例如氨基酸序列：seqidno:45:rgrkrrs。
提供了包含共有vp1、vp2、vp3和vp4以及蛋白酶3c的共有序列的融合蛋白。存在分别作为亚型a、asia1、c、o、sat1、sat2和sat3的共有序列的seqidno:2、4、6、8、10、12和14。
seqidno:16为共有3c蛋白酶序列。
提供了包含共有vp1、vp2、vp3和vp4的融合蛋白。存在seqidno:18、20、22、24、26、28和30，它们分别为亚型a、asia1、c、o、sat1、sat2和sat3的共有序列。
seqidno:32、34、36和38分别为vp1亚型asia、o、a和c的共有序列。这些序列包括ige前导序列seqidno:44，所述前导序列在每一种情况下可被不同前导序列置换或可被缺失且被甲硫氨酸置换。
seqidno:40和42为vp1的两个共有序列的融合蛋白。seqidno:40为共有vp1亚型a和vp1亚型c。seqidno:42为共有vp1亚型asia和vp1亚型o。这些序列包括ige前导序列seqidno:44，所述前导序列在每一种情况下可被不同前导序列置换或可被缺失且被甲硫氨酸置换。
此外，蛋白质可以为seqidno:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40和42的片段。在某些实施方案中，蛋白质为共有蛋白质的20％。在某些实施方案中，蛋白质为共有蛋白质的20％。在某些实施方案中，蛋白质为共有蛋白质的30％。在某些实施方案中，蛋白质为共有蛋白质的40％。在某些实施方案中，蛋白质为共有蛋白质的50％。在某些实施方案中，蛋白质为共有蛋白质的60％。在某些实施方案中，蛋白质为共有蛋白质的70％。在某些实施方案中，蛋白质为共有蛋白质的80％。在某些实施方案中，蛋白质为共有蛋白质的90％。在某些实施方案中，蛋白质为共有蛋白质的95％。在某些实施方案中，蛋白质为共有蛋白质的96％。在某些实施方案中，蛋白质为共有蛋白质的97％。在某些实施方案中，蛋白质为共有蛋白质的98％。在某些实施方案中，蛋白质为共有蛋白质的99％。
此外，蛋白质与seqidno:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40和42具有同源性。在某些实施方案中，蛋白质具有80％同源性。在某些实施方案中，蛋白质具有90％同源性。在某些实施方案中，蛋白质具有95％同源性。在某些实施方案中，蛋白质具有96％同源性。在某些实施方案中，蛋白质具有97％同源性。在某些实施方案中，蛋白质具有98％同源性。在某些实施方案中，蛋白质具有99％同源性。
此外，蛋白质为与seqidno:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40和42具有同源性的蛋白质的片段。在某些实施方案中，蛋白质为同源蛋白质的20％。在某些实施方案中，蛋白质为同源蛋白质的20％。在某些实施方案中，蛋白质为同源蛋白质的30％。在某些实施方案中，蛋白质为同源蛋白质的40％。在某些实施方案中，蛋白质为同源蛋白质的50％。在某些实施方案中，蛋白质为同源蛋白质的60％。在某些实施方案中，蛋白质为同源蛋白质的70％。在某些实施方案中，蛋白质为同源蛋白质的80％。在某些实施方案中，蛋白质为同源蛋白质的90％。在某些实施方案中，蛋白质为同源蛋白质的95％。在某些实施方案中，p蛋白质为同源蛋白质的96％。在某些实施方案中，蛋白质为同源蛋白质的97％。在某些实施方案中，蛋白质为同源蛋白质的98％。在某些实施方案中，蛋白质为同源蛋白质的99％。
3.编码序列
本文中提供了能够在哺乳动物中引起抗一个或多个口蹄疫病毒(fmdv)亚型的免疫反应的抗原的编码序列。抗原可以是包含衣壳蛋白vp1、vp2、vp3、vp4、其共有序列、其变体、其片段或其组合的fmdv抗原。fmdv抗原可来自fmdv亚型a、asia1、c、o、sat1、sat2或sat3。fmdv抗原可包含至少一个抗原性表位，所述表位可以对于可针对其诱导免疫反应的特定fmdv免疫原是有效的。fmdv抗原的空病毒衣壳蛋白vp1-4提供了一整套存在于完整fmdv病毒中的免疫原性位点和表位。共有fmdv抗原序列可源自来自一个fmdv亚型的多种fmdv病毒的fmdv抗原序列。共有fmdv抗原可包含vp1、vp2、vp3和vp4fmdv亚型共有蛋白质序列，其可以是共有vp1-4蛋白。共有vp1-4蛋白可包含至少一个fmdv蛋白3c的切割位点。蛋白3c的切割位点可存在于共有vp1-4蛋白的每一个共有vp1、vp2、vp3和vp4序列之间。蛋白3c对共有vp1-4蛋白的切割可切割共有vp1-4蛋白以产生共有vp1-蛋白、共有vp2-蛋白、共有vp3-蛋白和共有vp4蛋白。可选择，天然蛋白水解切割位点可存在于每一个共有抗原序列之间，例如氨基酸序列：seqidno:45:rgrkrrs。
提供了包含共有vp1、vp2、vp3和vp4以及蛋白酶3c的共有序列的融合蛋白的编码序列。存在分别作为亚型a、asia1、c、o、sat1、sat2和sat3的共有序列的seqidno:1、3、5、7、9、11和132。
seqidno:15编码共有3c蛋白酶序列。
提供了包含共有vp1、vp2、vp3和vp4的融合蛋白的编码序列。存在seqidno:17、19、21、23、25、27和29，它们分别为亚型a、asia1、c、o、sat1、sat2和sat3的共有序列。
seqidno:31、33、35和37分别编码vp1亚型asia、o、a和c的共有序列。这些序列包括ige前导序列seqidno:44的编码序列，所述编码序列在每一种情况下可被不同前导序列的编码序列置换或可被缺失且仅被起始密码子置换。
seqidno:40和42为vp1的两个共有序列的融合蛋白。seqidno:40为共有vp1亚型a和vp1亚型c。seqidno:42为共有vp1亚型asia和vp1亚型o。这些序列包括ige前导序列seqidno:44，所述前导序列在每一种情况下可被不同前导序列的编码序列置换或可被缺失且仅被起始密码子置换。
此外，编码序列可编码可为seqidno:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40和42的片段的蛋白质。在某些实施方案中，编码序列编码为共有蛋白质的20％的蛋白质。在某些实施方案中，编码序列编码为共有蛋白质的30％的蛋白质。在某些实施方案中，编码序列编码为共有蛋白质的40％的蛋白质。在某些实施方案中，编码序列编码为共有蛋白质的50％的蛋白质。在某些实施方案中，编码序列编码为共有蛋白质的60％的蛋白质。在某些实施方案中，编码序列编码为共有蛋白质的70％的蛋白质。在某些实施方案中，编码序列编码为共有蛋白质的85％的蛋白质。在某些实施方案中，编码序列编码为共有蛋白质的90％的蛋白质。在某些实施方案中，编码序列编码为共有蛋白质的95％的蛋白质。在某些实施方案中，编码序列编码为共有蛋白质的96％的蛋白质。在某些实施方案中，编码序列编码为共有蛋白质的97％的蛋白质。
此外，编码序列编码与seqidno:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40和42具有同源性的蛋白质。在某些实施方案中，编码序列编码具有80％同源性的蛋白质。在某些实施方案中，编码序列编码具有90％同源性的蛋白质。在某些实施方案中，编码序列编码具有95％同源性的蛋白质。在某些实施方案中，编码序列编码具有96％同源性的蛋白质。在某些实施方案中，编码序列编码具有97％同源性的蛋白质。在某些实施方案中，编码序列编码具有98％同源性的蛋白质。在某些实施方案中，编码序列编码具有99％同源性的蛋白质。
此外，编码序列编码作为与seqidno:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40和42具有同源性的蛋白质的片段的蛋白质。在某些实施方案中，编码序列编码为同源蛋白质的20％的蛋白质。在某些实施方案中，编码序列编码为同源蛋白质的30％的蛋白质。在某些实施方案中，编码序列编码为同源蛋白质的40％的蛋白质。在某些实施方案中，编码序列编码为同源蛋白质的50％的蛋白质。在某些实施方案中，编码序列编码为同源蛋白质的60％的蛋白质。在某些实施方案中，编码序列编码为同源蛋白质的70％的蛋白质。在某些实施方案中，编码序列编码为同源蛋白质的80％的蛋白质。在某些实施方案中，编码序列编码为同源蛋白质的90％的蛋白质。在某些实施方案中，编码序列编码为同源蛋白质的95％的蛋白质。在某些实施方案中，编码序列编码为同源蛋白质的96％的蛋白质。在某些实施方案中，编码序列编码为同源蛋白质的97％的蛋白质。在某些实施方案中，编码序列编码为同源蛋白质的98％的蛋白质。在某些实施方案中，编码序列编码为同源蛋白质的99％的蛋白质。
此外，编码序列可以为seqidno:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39和41的片段、在某些实施方案中，片段为seqidno:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39和41的20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
此外，编码序列可以与seqidno:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39和41同源。在某些实施方案中，编码序列与seqidno:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39和41具有80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性。
此外，编码序列可以与seqidno:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39和41的片段同源。在某些实施方案中，片段为seqidno:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39和41的20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，并且所述编码序列与seqidno:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39和41的片段具有80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性。
4.质粒
本文中提供了能够以有效地引起哺乳动物的免疫反应的量在哺乳动物的细胞中表达一种或多种fmdv抗原的载体。所述载体可包括编码fmdv抗原的异源核酸。载体可以为质粒。所述质粒对于利用编码fmdv抗原的核酸转化细胞是有用的，培养所述转化的宿主细胞，将其维持在其中fmdv抗原的表达发生的条件下。
所述质粒可包含编码选自seqidno:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40和42的fmdv抗原、其片段、其同源序列和同源序列的片段的核酸。所述质粒还可包含起始密码子或前导序列(所述密码子和序列可位于编码序列的上游)和终止密码子(其可位于编码序列的下游)。起始和终止密码子可与编码序列在框内。
质粒还可包含有效地连接于编码序列的启动子。有效地连接于编码序列的启动子可以是来自猿猴病毒40(sv40)的启动、小鼠乳腺瘤病毒(mmtv)启动子、人免疫缺陷病毒(hiv)启动子例如牛免疫缺陷病毒(biv)长末端重复(ltr)启动子、莫洛尼病毒启动子、禽类白血病病毒(alv)启动子、巨细胞病毒(cmv)启动子例如cmv立即早期启动子、eb病毒(epsteinbarrvirus)(ebv)启动子或劳斯肉瘤病毒(rsv)启动子。启动子还可以是来自人基因例如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸或人金属硫蛋白的启动子。启动子还可以是组织特异性启动子，例如肌肉或皮肤特异性启动子(天然或合成的)。此类启动子的实例描述于第us20040175727号美国专利申请公布(将其内容通过引用整体并入本文)中。
质粒还可包括多腺苷酸化信号，其可位于编码区的下游。多腺苷酸化信号可以是sv40多腺苷酸化信号、ltr多腺苷酸化信号、牛生长激素(bgh)多腺苷酸化信号、人生长激素(hgh)多腺苷酸化信号或人β-珠蛋白多腺苷酸化信号。sv40多腺苷酸化信号可以是来自pcep4质粒(invitrogen,sandiego,ca)的多腺苷酸化信号。
质粒还可包括编码序列的上游增强子。增强子可以为人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸或病毒增强子例如来自cmv、fmdv、rsv或ebv的增强子。多核苷酸功能增强描述于美国专利no.5,593,972、5,962,428和wo94/016737(将每一个专利的内容通过引用整体并入本文)中。
质粒还包括哺乳动物复制起始点以在细胞中染色体外维持质粒和产生多拷贝的质粒。质粒可以是来自invitrogen(sandiego,ca)的pvax1、pcep4或prep4，其可包括eb病毒的复制起始点和细胞核抗原ebna-1编码区，其可产生高拷贝附加型复制而无需整合。质粒的主链可以是pav0242。质粒可以是复制缺陷型腺病毒5型(ad5)质粒。
质粒还可包含调控序列，其可以十分适合在已将质粒施入其中的细胞中进行基因表达。编码序列可包含密码子，所述密码子可以允许编码序列在宿主细胞中更高效地转录。
编码序列可包含ig前导序列。所述前导序列可位于编码序列的5’。由该序列编码的共有蛋白质可包含n-末端ig前导序列，然后共有蛋白质。n-末端ig前导序列可以为ige或igg。
质粒可以是pse420(invitrogen,sandiego,calif.)，可将其用于在大肠杆菌(escherichiacoli)(e.coli)中进行蛋白质生产。质粒还可以是pyes2(invitrogen,sandiego,calif.)，可将其用于在酵母的酿酒酵母菌(saccharomycescerevisiae)株中进行蛋白质生产。质粒还可具有maxbactm完整杆状病毒表达系统(invitrogen,sandiego,calif.)，可将其用于在昆虫细胞中进行蛋白质生产。质粒还可以是pcdnai或pcdna3(invitrogen,sandiego,calif.)，可将其用于在哺乳动物细胞例如中国仓鼠卵巢(cho)细胞中进行蛋白质生产。
质粒可包含一个或多个编码序列，所述编码序列编码来自一个或多个亚型例如asia、a、o、c、sat1、sat2和sat3的vp1、vp2、vp3、vp4和3c中的一个或多个。
在某些实施方案中，质粒包含来自亚型asia、a、o、c、sat1、sat2或sat3的多个不同的共有fmdv抗原vp1、vp2、vp3、vp4和3c的编码序列。
在某些实施方案中，质粒包含来自亚型asia、a、o、c、sat1、sat2或sat3的多个不同的共有fmdv抗原vp1、vp2、vp3和vp4的编码序列。
在某些实施方案中，质粒包含来自亚型asia、a、o和c中的两个亚型的两个不同的共有fmdv抗原vp1，例如来自亚型asia的vp1和来自亚型o的vp1或来自t亚型a的vp1和来自亚型c的vp1。
在某些实施方案中，质粒包含共有fmdv抗原vp1例如vp1亚型asia、vp1亚型a、vp1亚型o或vp1亚型c的编码序列。
编码序列可由全部由有效连接的启动子调控的不同dna质粒例如具有由一个或多个启动子调控的编码序列(所述编码序列包含多种共有fmdv抗原)的dna质粒编码。
5.疫苗
然而不受科学理论束缚，可用于引起广泛抗fmdv的免疫反应(体液、细胞或两者)的疫苗可包含上文中所示的一个或多个编码序列，即编码一种或多种来自亚型(选自fmdv亚型例如a、asia1、c、o、sat1、sat2、sat3或其组合)的蛋白质vp1、vp2、vp3、cvp4和3c的核酸序列。编码序列还可包括包含同源序列、片段和片段的同源序列的那些编码序列。可选择地或此外，诱导抗fmdv免疫反应的组合物还可包括一种或多种选自fmdv亚型例如a、asia1、c、o、sat1、sat2、sat3或其组合的蛋白质。
本文中提供了能够在哺乳动物中产生抗一个或多个fmdv亚型的免疫反应的疫苗。所述疫苗可包含上述质粒。疫苗可包含多种各自针对一个或多个fmdv亚型例如a、asia1、c、o、sat1、sat2、sat3或其组合的质粒。疫苗还可包含本身针对一个或多个fmdv亚型例如a、asia1、c、o、sat1、sat2、sat3或其组合的fmdv抗原。疫苗还可包括针对来自世界的特定区域例如亚洲、欧洲和南非(sub-africa)的fmdv亚型的质粒。可选择地或此外，疫苗还可包括一个或多个fmdv亚型例如a、asia1、c、o、sat1、sat2、sat3或其组合的蛋白质。疫苗还可包括本身针对一个或多个fmdv亚型例如a、asia1、c、o、sat1、sat2、sat3或其组合的fmdv抗原。疫苗还可包括针对来自世界的特定区域例如亚洲、欧洲和南非的fmdv亚型的质粒和/或蛋白质。可提供疫苗以诱导治疗性或预防性免疫反应。
疫苗还可包含编码fmdvc3蛋白酶的核酸，其可以是共有c3蛋白酶核酸。共有蛋白质3c核酸可以是蛋白3c编码序列。可选择地或此外，疫苗还可包含fmdvc3蛋白酶，例如共有c3蛋白酶例如蛋白3c。疫苗还可包含编码全长或部分vp1-4编码序列和全长或部分c3编码序列的嵌合基因。可选择地或此外，疫苗还可包含含有全长或部分vp1-4以及全长或部分c3的融合蛋白。
本文中提供了根据本发明的药物组合物，所述药物组合物包含约1纳克至约10mg的dna。在某些实施方案中，根据本发明的药物组合物包含：1)至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100纳克，或至少1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95,100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895.900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995或1000微克，或至少1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10mg或更多；和2)达到并且包括15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100纳克，或达到并且包括1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95,100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895.900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995或1000微克，或达到并且包括1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10mg之间的dna。在某些实施方案中，根据本发明的药物组合物包含约5纳克至约10mg的dna。在某些实施方案中，根据本发明的药物组合物包含约25纳克至约5mg的dna。在某些实施方案中，药物组合物包含约50纳克至约1mg的dna。在某些实施方案中，药物组合物包含约0.1至约500微克的dna。在某些实施方案中，药物组合物包含约1至约350微克的dna。在某些实施方案中，药物组合物包含约5至约250微克的dna。在某些实施方案中，药物组合物包含约10至约200微克的dna。在某些实施方案中，药物组合物包含约15至约150微克的dna。在某些实施方案中，药物组合物包含约20至约100微克的dna。在某些实施方案中，药物组合物包含约25至约75微克的dna。在某些实施方案中，药物组合物包含约30至约50微克的dna。在某些实施方案中，药物组合物包含约35至约40微克的dna。在某些实施方案中，药物组合物包含约100至约200微克dna。在某些实施方案中，药物组合物包含约10微克至约100微克的dna。在某些实施方案中，药物组合物包含约20微克至约80微克的dna。在某些实施方案中，药物组合物包含约25微克至约60微克的dna。在某些实施方案中，药物组合物包含约30纳克至约50微克的dna。在某些实施方案中，药物组合物包含约35纳克至约45微克的dna。在某些优选实施方案中，药物组合物包含约0.1至约500微克的dna。在某些优选实施方案中，药物组合物包含约1至约350微克的dna。在某些优选实施方案中，药物组合物包含约25至约250微克的dna。在某些优选实施方案中，药物组合物包含约100至约200微克dna。
根据待使用的施用模式配制根据本发明的药物组合物。在其中药物组合物为可注射药物组合物的情况下，它们是无菌、无热源和无微粒的。优选使用等渗制剂。通常地，用于等渗性的添加剂可包括氯化钠、葡萄糖、甘露醇、山梨醇和乳糖。在某些情况下，等渗溶液例如磷酸缓冲盐溶液是优选的。稳定剂包括明胶和白蛋白。在某些实施方案中，向制剂中加入血管收缩剂。
优选地药物组合物为疫苗，更优选为dna疫苗。
所述疫苗可以是dna疫苗。dna疫苗可包含多个相同或不同的质粒，所述质粒包含一种或多种共有前列腺抗原的核酸编码序列。dna疫苗可包含一种或多种核酸序列，所述核酸序列编码一种或多种共有前列腺抗原。当dna疫苗包含超过一种共有前列腺抗原的编码序列时，所有此类序列可存在于单个质粒上，或每一种此类序列可存在于不同质粒上。
在某些实施方案中，疫苗可包含编码与一种或多种共有前列腺抗原组合的一种或多种共有前列腺抗原的核酸序列。
dna疫苗公开于美国专利no.5,593,972、5,739,118、5,817,637、5,830,876、5,962,428、5,981,505、5,580,859、5,703,055和5,676,594(将所述专利通过引用整体并入本文)中。dna疫苗还可包含抑制其整合入染色体的元件或试剂。疫苗可以是前列腺抗原的rna。可将rna疫苗引入细胞。
疫苗可以是包含上述基因构建体或抗原的重组疫苗。疫苗还可包含一种或多种共有前列腺抗原，所述抗原以一种或多种蛋白质亚单位或一种或多种包含一种或多种共有抗原的减毒病毒颗粒的形式存在。减毒疫苗可以是减毒活疫苗、杀死的疫苗和使用重组载体递送编码一种或多种共有前列腺抗原的外源基因的疫苗，以及亚单位和蛋白质疫苗。减毒活疫苗的实例，使用重组载体递送前列腺抗原的那些疫苗、亚单位疫苗和糖蛋白疫苗，描述于美国专利no.:4,510,245；4,797,368；4,722,848；4,790,987；4,920,209；5,017,487；5,077,044；5,110,587；5,112,749；5,174,993；5,223,424；5,225,336；5,240,703；5,242,829；5,294,441；5,294,548；5,310,668；5,387,744；5,389,368；5,424,065；5,451,499；5,453,364；5,462,734；5,470,734；5,474,935；5,482,713；5,591,439；5,643,579；5,650,309；5,698,202；5,955,088；6,034,298；6,042,836；6,156,319和6,589,529(将所述专利各自通过引用并入本文)中。疫苗可包含与其它疫苗组分例如fmdv蛋白或编码蛋白质的表达载体组合的质粒。
可将提供的疫苗用于诱导免疫反应，包括治疗性或预防性免疫反应。可产生针对共有前列腺抗原的抗体和/或杀伤t细胞。可分离此类抗体和细胞。
疫苗还可包含药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂可以是功能分子如媒介物、佐剂、载体或稀释剂。药学上可接受的赋形剂可以是转染促进剂，其可包括表面活性剂，例如免疫刺激复合物(iscoms)、弗氏不完全佐剂、lps类似物(包括单磷酰脂质a)、胞壁酰肽、醌类似物、媒介物(vesicle)例如角鲨烯和角鲨烯、透明质酸、脂质、脂质体、钙离子、病毒蛋白质、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒或其它已知的转染促进剂。
转染促进剂为聚阴离子、聚阳离子，包括聚-l-谷氨酸(lgs)或脂质。转染促进剂为聚-l-谷氨酸，更优选地，聚-l-谷氨酸以低于6mg/ml的浓度存在于疫苗中。转染促进剂还可包括表面活性剂例如免疫刺激复合物(iscoms)、弗氏不完全佐剂、lps类似物(包括单磷酰脂质a)、胞壁酰肽、醌类似物以及媒介物(vesicle)例如角鲨烯和角鲨烯，还可将透明质酸与基因构建体结合施用。在某些实施方案中，dna质粒疫苗还可包括转染促进剂例如脂质、脂质体(包括卵磷脂脂质体或本领域已知的其它脂质体)如dna-脂质体复合物(参见例如w09324640)、钙离子、病毒蛋白质、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒或其它已知的转染促进剂。优选地，转染促进剂为聚阴离子、聚阳离子(包括聚-l-谷氨酸(lgs)或脂质)。疫苗中转染剂的浓度低于4mg/ml，低于2mg/ml，低于1mg/ml，低于0.750mg/ml，低于0.500mg/ml，低于0.250mg/ml，低于0.100mg/ml，低于0.050mg/ml或低于0.010mg/ml。
药学上可接受的赋形剂可以是佐剂。所述佐剂可以是在替代质粒中表达或作为与疫苗的上述质粒组合的蛋白质进行递送的其它基因。佐剂可选自：α-干扰素(ifn-α)、β-干扰素(ifn-β)、γ-干扰素、血小板衍生生长因子(pdgf)、tnfα、tnfβ、gm-csf、表皮生长因子(egf)、皮肤t细胞虏获趋化因子(cutaneoustcell-attractingchemokine)(ctack)、上皮胸腺表达趋化因子(epithelialthymus-expressedchemokine)(teck)、粘膜结合上皮趋化因子(mucosae-associatedepithelialchemokine)(mec)、il-12、il-15、mhc、cd80、cd86(包括具有缺失信号序列和任选地包含来自ige的信号肽的il-15)。佐剂可以为il-12、il-15、ctack、teck、血小板衍生生长因子(pdgf)、tnfα、tnfβ、gm-csf、表皮生长因子(egf)、il-1、il-2、il-4、il-5、il-6、il-10、il-12、il-18或其组合。
可用作佐剂的其它基因包括这样的基因，所述基因编码：mcp-1、mip-la、mip-1p、il-8、rantes、l-选择蛋白、p-选择蛋白、e-选择蛋白、cd34、glycam-1、madcam-1、lfa-1、vla-1、mac-1、pl50.95、pecam、icam-1、icam-2、icam-3、cd2、lfa-3、m-csf、g-csf、il-4、il-18的突变形式、cd40、cd40l、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、il-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、fas、tnf受体、flt、apo-1、p55、wsl-1、dr3、tramp、apo-3、air、lard、ngrf、dr4、dr5、killer、trail-r2、trick2、dr6、天胱酶ice、fos、c-jun、sp-1、ap-1、ap-2、p38、p65rel、myd88、irak、traf6、ikb、无活性nik、sapk、sap-1、jnk、干扰素应答基因、nfkb、bax、trail、trailrec、trailrecdrc5、trail-r3、trail-r4、rank、rank配体、ox40、ox40ligand、nkg2d、mica、micb、nkg2a、nkg2b、nkg2c、nkg2e、nkg2f、tap1、tap2及其功能片段。
疫苗还可包括1994年4月1日提交的美国专利no.021,579(将其通过引用整体并入本文)中描述的基因疫苗促进剂。
可根据待使用的施用模式配制疫苗。可注射疫苗药物组合物可以是无菌、无热源和无微粒的。可使用等渗制剂或溶液。用于等渗性的添加剂可包括氯化钠、葡萄糖、甘露醇、山梨醇和乳糖。疫苗可包含血管收缩剂。等渗溶液可包含磷酸缓冲盐溶液。疫苗还可包含稳定剂(包括明胶和白蛋白)。稳定化可允许制剂在室温下或环境温度下长期稳定，例如向疫苗制剂中加入lgs或聚阳离子或聚阴离子。
6.递送疫苗的方法
本文中提供了用于递送疫苗以提供fmdv抗原的基因构建体和蛋白质的方法，所述fmdv抗原包含使它们特别有效地抗fmdv的免疫原(可诱导针对其的免疫反应)的表位。可提供递送疫苗或接种的方法以诱导治疗性和预防性免疫反应。接种方法可在哺乳动物中产生抗多个fmdv亚型的免疫反应。可将疫苗递送至个体以调节哺乳动物的免疫系统的活性和增强免疫反应。疫苗的递送可以是以核酸分子的形式转染fmdv抗原，所述核酸在细胞中表达并且被递送至细胞的表面，然后免疫系统识别所述抗原并且诱导细胞、体液或细胞及体液反应。通过给哺乳动物施用上述疫苗，可将疫苗的递送用于在哺乳动物中诱导或引起抗多种fmdv病毒的免疫反应。
在将疫苗和质粒递送入哺乳动物的细胞后，转染的细胞将表达和分泌从疫苗注射的每一种质粒的共有衣壳。这类分泌的衣壳蛋白将被免疫系统识别为外来物，并且将产生抗它们的抗体。这类抗体将由免疫系统维持并且允许快速清除随后的fmdv攻击。
可给哺乳动物施用疫苗以引起哺乳动物的免疫反应。哺乳动物可以是人、灵长类动物、非人灵长类动物、母牛、牛、绵羊、山羊、羚羊、野牛、水牛、野牛、牛科动物(bovid)、鹿、豪猪、大象、骆马、羊驼、小鼠、大鼠和鸡。
a.联合治疗
可将疫苗与其它蛋白质或基因组合施用，所述基因编码α-干扰素、γ-干扰素、血小板衍生生长因子(pdgf)、tnfα、tnfβ、gm-csf、表皮生长因子(egf)、皮肤t细胞虏获趋化因子(ctack)、上皮胸腺表达趋化因子(teck)、粘膜结合上皮趋化因子(mec)、il-12、il-15、mhc、cd80、cd86(包括具有缺失信号序列和任选地包含来自ige的信号肽的il-15)、il-12、il-15、ctack、teck、血小板衍生生长因子(pdgf)、tnfα、tnfβ、gm-csf、表皮生长因子(egf)、il-1、il-2、il-4、il-5、il-6、il-10、il-12、il-18、mcp-1、mip-la、mip-1p、il-8、rantes、l-选择蛋白、p-选择蛋白、e-选择蛋白、cd34、glycam-1、madcam-1、lfa-1、vla-1、mac-1、pl50.95、pecam、icam-1、icam-2、icam-3、cd2、lfa-3、m-csf、g-csf、il-4、il-18的突变形式、cd40、cd40l、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、il-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、fas、tnf受体、flt、apo-1、p55、wsl-1、dr3、tramp、apo-3、air、lard、ngrf、dr4、dr5、killer、trail-r2、trick2、dr6、天胱酶ice、fos、c-jun、sp-1、ap-1、ap-2、p38、p65rel、myd88、irak、traf6、ikb、来活的nik、sapk、sap-1、jnk、干扰素应答基因、nfkb、bax、trail、trailrec、trailrecdrc5、trail-r3、trail-r4、rank、rank配体、ox40、ox40ligand、nkg2d、mica、micb、nkg2a、nkg2b、nkg2c、nkg2e、nkg2f、tap1、tap2及其功能片段或其组合。还可将疫苗与ctack蛋白、teck蛋白、mec蛋白或其功能片段组合施用。
可通过不同途径(包括口服、胃肠外、舌下、经皮肤、经直肠、转粘膜、局部、通过吸入、通过颊部施用、胸膜内、静脉内、动脉内、腹膜内、皮下、肌内、鼻内、硬膜内和关节内途径或其组合)施用疫苗。为了进行兽医学使用，可按照标准兽医实践将组合物配制为适当地可接受的制剂。兽医可容易地确定最适合于具体动物的给药方案和施用途径。可以通过常规注射器、无针注射装置、“微粒轰击基因枪(microprojectilebombardmentgoneguns)”或其它物理方法例如电穿孔(“ep”)、“水动力学法(hydrodynamicmethod)”或超声波来施用疫苗。
可利用几个公知的技术将疫苗的质粒递送至哺乳动物，所述技术包括利用和不利用体内电穿孔的、脂质体介导的、纳米颗粒促进的重组载体例如重组腺病毒、重组腺病毒相关病毒和重组牛痘的dna注射(也称为dna接种)。可通过dna注射以及体内电穿孔来递送fmdv抗原。
b.电穿孔
可使用电穿孔装置来实现通过疫苗的质粒的电穿孔进行的疫苗施用，所述电穿孔装置被构造用来将脉冲能量(所述脉冲能量产生与由用户输入的预设电流相似的恒定电流)递送至哺乳动物的期望的组织。电穿孔装置可包括电穿孔组件和电极总成(electrodeassembly)或把手总成(handleassembly)。电穿孔组件可包括并且整合有电穿孔装置的各种元件中的一个或多个元件，包括：控制器、电流波形发生器、阻抗测试仪、波形记录器、输入元件、状态报告元件、通信端口、存储组件(memorycomponent)、电源和电源开关。电穿孔可使用帮助利用质粒转染细胞的vgxpcellectratm系统来实现。
电穿孔组件可用作电穿孔装置的一个元件，并且其它元件是与电穿孔组件通信的分开的元件(或组件)。电穿孔组件可用作电穿孔装置的超过一个元件，其仍然可与电穿孔装置的与所述电穿孔组件分开的其它元件通信。作为一个电机或机械装置的部分存在的电穿孔装置的元件可以不限为可用作一个装置的元件或彼此通信的分开的元件。电穿孔组件可以能够递送在期望的组织中产生恒定电流的脉冲能量，并且包括反馈机制。电极总成可包括将多个电极按空间排布的电极阵列，其中电极总成接收来自电穿孔组件的脉冲能量，并且通过电极将所述脉冲递送至期望的组织。多个电极中的至少一个在递送脉冲能量的过程中是中性的，并且测量期望的组织中的阻抗，以及将所述阻抗传达给电穿孔组件。反馈机制可接收测量的阻抗并且可调整通过电极组件递送的脉冲能量以维持恒定电流。
多个电极可以以分散模式递送脉冲能量。多个电极可通过处于程控次序(programmedsequence)下的电极的控制以分散模式递送脉冲能量，所述程控次序由用户输入至电穿孔组件。程控次序可包括多个按次序递送的脉冲，其中通过至少两个有效电极和一个测量阻抗的中性电极递送多个脉冲的每一个脉冲，并且其中通过至少两个有效电极中的不同一个和测量阻抗的一个中性电极递送多个脉冲的随后的脉冲。
可通过硬件或软件来进行反馈机制。可通过模拟闭环回路来进行反馈机制。反馈可每50μs、20μs、10μs或1μs发生一次，但优选为实时反馈或瞬时反馈(即，大体上即时，如通过用于测定响应时间的可用技术测定的)。中性电极可测量期望的组织中的阻抗并且将所述阻抗传达给反馈机制，然后反馈机制响应于该阻抗并且调整脉冲能量以将恒定电流维持在与预设电流相似的值上。反馈机制可在脉冲能量的递送过程中连续且即时地维持恒定电流。
可帮助递送本发明的dna疫苗的电穿孔装置和电穿孔方法的实例包括属于draghia-akli等人的美国专利no.7,245,963、由smith等人提交的美国专利公布no.2005/0052630(将所述专利和专利公布的内容通过引用整体并入本文)中描述的那些装置和方法。可用于帮助递送dna疫苗的其它电穿孔装置和电穿孔方法包括2007年10月17日提交的共同未决和共同拥有的美国专利申请no.1/874072(所述申请根据35usc119(e)要求2006年10月17日提交的美国临时申请no.60/852,149的利益)和2007年10月10日提交的美国临时申请no.60/978,982(将全部所述专利申请通过引用整体并入本文)中提供的那些装置和方法。
draghia-akli等人的美国专利no.7,245,963描述了标准电极系统以及它们用于帮助将生物分子引入身体或植物内的选定组织的细胞中的用途。标准电极系统可包括多个针电极；皮下注射针；提供从程序控制的恒定电流脉冲控制器至多个针电极的导电连接的电连接器；和电源。操作员可紧握多个被安装在支持结构上的针电极并且将它们牢固地插入身体或植物内的选定组织。随后通过皮下注射针将生物分子递送到选定组织。启动程序控制的恒定电流脉冲控制器，将恒定电流电脉冲施加至多个针电极。所施加的恒定电流电脉冲帮助将生物分子引入多个电极之间的细胞。将美国专利no.7,245,963的全部内容通过引用并入本文。
由smith等人提交的美国专利公布2005/0052630描述了可用于有效地促进将生物分子引入身体或植物内的选定组织的细胞的电穿孔装置。电穿孔装置包括电动装置(“ekd装置”)，其操作由软件或固件指定。ekd装置基于用户控制和脉冲参数的输入在阵列中的电极之间产生一系列程序控制的恒定电流脉冲模式，并且允许存储和获取电流波形数据。电穿孔装置还包括具有针电极的阵列的可替换电极盘、用于注射针的中央注射通道和可移动的导盘。将美国专利公布2005/0052630的整体内容通过引用并入本文。
美国专利no.7,245,963和美国专利公布2005/0052630中描述的电极阵列和方法可适合于不仅深渗透到组织例如肌肉，而且还深渗透到其它组织或器官中。由于电极阵列的构型的原因，还可将注射针(递送选择的生物分子)完全插入靶器官中，将注射垂直于靶组织施用至利用电极预先描绘的区域中。美国专利no.7,245,963和美国专利公布2005/005263中描述的电极优选为20mm长和21规格。
此外，预期在某些整合电穿孔装置和其用途的实施方案中，存在下列专利中描述的电穿孔装置：1993年12月28日公布的美国专利5,273,525，2000年8月29日公布的美国专利6,110,161，2001年7月17日公布的6,261,281和2005年10月25日公布的6,958,060，以及2005年9月6日公布的美国专利6,939,862。此外，在本文中预期涵盖2004年2月24日公布的美国专利6,697,669(其涉及使用多种装置的任一种递送dna)和2008年2月5日公布的美国专利7,328,064(涉及注射dna的方法)中提供的主题的专利。将上述专利通过引用整体并入本文。
c.制备疫苗的方法
本文中提供了用于制备疫苗的方法。在某些实施方案中，所述方法为制备包含dna质粒的疫苗的方法。在最终通过亚克隆步骤克隆入哺乳动物表达质粒后，可使用本领域已知的方法将dna质粒用于在大规模发酵罐中接种细胞培养物。将质粒转化入可相容的宿主细胞，在其中fmdv抗原的表达发生的条件下培养和维持所述细胞。可通过裂解细胞从培养物或从培养基回收fmdv抗原，分离抗原。可将分离的vp1-4共有蛋白质用于作为抗体的天然来源用于疫苗。可使用自动化合成仪，通过重组技术产生fmdv抗原，也可将所述fmdv抗原用于产生分离的基本上纯的fmdv抗原。这些技术可用于引入fmdv的特定亚型的fmdv抗原的变体。
可使用已知装置和技术的组合配制或制备与本发明的ep装置一起使用的dna质粒，但优选地使用最优化的质粒制备技术制备它们，所述技术描述于2007年5月23日提交的得到许可的共同未决的美国临时申请no.60/939,792中。在某些实施例中，可以以大于或等于10mg/ml的浓度配制用于这些研究的dna质粒。除了2007年7月3日公布的美国专利no.60/939792中描述的那些装置和方案(包括得到许可的美国专利no.7,238,522中描述的那些装置和方法)外，制备技术还包括或整合对于本领域技术人员来说是公知的不同装置和方案。将上文中提及的申请和专利(美国专利no.60/939,792和美国专利no.7,238,522)分别地通过引用整体并入本文。
d.用于制备vp1-4表达构建体的方法
通过首先使用来自fmdv亚型asia、o、a、c、sat1、sat2和sat3的至少10个不同序列最优化所述fmdv亚型之一的vp1、vp2、vp3和vp4氨基酸序列来构建多靶向性fmdvdna疫苗。产生各自编码亚型最优化的vp1-4蛋白的核酸。将亚型最优化的vp1-4核酸序列克隆为连接编码序列，vp通过间插fmdv蛋白3c蛋白酶切割位点分隔。在操纵子的控制下将最优化的vp1-4编码序列插入表达载体pvax或pav0242。将ige前导序列置于最优化的vp1-4编码序列的上游以便编码的蛋白质包括n末端ige前导序列。将两个终止密码子置于vp1-4编码序列的3’末端。
此外，通过使用来自fmdv亚型asia1、o、a、c、sat1、sat2和sat3的至少10个不同序列最优化所述fmdv亚型之一的3c核酸序列来构建编码fmdv蛋白3c的核酸。产生编码亚型最优化的3c蛋白的核酸，将其克隆入pvax或pav0242质粒。
e.使用疫苗作为标记的方法
本文中还提供了区分用疫苗接种的哺乳动物与被fmdv感染的哺乳动物的方法。所述方法可包括从哺乳动物取样，从所述样品分离哺乳动物的抗体。已用疫苗接种的哺乳动物可具有仅特异于fmdv抗原的空衣壳蛋白即针对fmdv亚型a、asiai、o、c、sat1、sat2、sat3或其组合的病毒外壳蛋白vp1-4的抗体。已被fmdv感染的哺乳动物将具有抗特定fmdv亚型例如a、asia1、o、c、sat1、sat2或sat3的fmdv病毒外壳蛋白vp1-4的抗体和此外抗fmdv的非结构(ns)蛋白的抗体。fmdv的ns蛋白可包括蛋白酶3c蛋白酶以及fmdv蛋白2c、3a、3b和3d(聚合酶)。所述方法可包括鉴定抗fmdv的ns蛋白例如高度抗原性3d蛋白的抗体。所述方法还包括比较接种的哺乳动物的血清样品以确定fmdvns蛋白的存在或不存在。感染的哺乳动物具有抗fmdv的ns蛋白的抗体，然而接种的哺乳动物不具有抗ns蛋白的抗体，因为该哺乳动物具有充足的抗fmdv感染的免疫力。所述方法可包括区分具有针对vp1-4的抗体的哺乳动物与具有针对fmdv的vp1-4和3d聚合酶的抗体的哺乳动物。
通常，可使用试剂。试剂可以是vp1-4或ns蛋白例如3d聚合酶。利用fmdv抗体分离来自哺乳动物的样品，将其与所述试剂反应以鉴定fdmv抗体的特异性。
可从哺乳动物分离所述方法的样品，其可包括来自血液的血清样品、唾液、眼泪、脑脊髓液、眼房水、胸膜液、心包液、淋巴结液、chime、乳糜、胆汁、尿、滑液、呕吐物、腹膜液、粪便水(stoolwater)、精液、羊水、奶、血清、间质液和胰液。
用于进行诊断测试的方法包括对特定fmdv蛋白例如vp1-4和3d聚合酶进行利用来自哺乳动物的[35s]甲硫氨酸-标记的细胞裂解物的免疫沉淀、蛋白质印迹和免疫印迹。
可以以多种公知的检测系统执行本文中描述的检测方法以确定针对fmdvvp1-4或3d聚合酶的抗体在测试样品或对照样品中的存在。检测系统可包括从结合至特定fmdv蛋白例如vp1-4和3d聚合酶的检测标记产生的信号与预定值之间的荧光或其它方式的比较以确定针对fmdvvp1-4或3d聚合酶的抗体在测试样品中的存在或不存在。预定值可以是从测试样品测量的信号对从对照样品测量的信号的比率。通常，测试样品产生高于从对照样品测量的平均信号3个标准差的信号，所述对照样品不包含可被认为是fmdv3d聚合酶阳性并由此被认为是感染的哺乳动物的fmdv3d聚合酶抗体。
可选择地，可将仪器例如密度计用于测量可检测标记的数值。可使用sackett等人，clinicalepidemiology:abasicscienceforclinicalmedicine,p.106-107(littlebrownandco.,1985)的方法，利用接受操作者曲线(receiveoperatorcurve)(“roc”)测定预定值。预定值可基于通过荧光成像仪或上述其它方法产生的相对光单位。简而言之，可从对应于诊断测试结果的每一个可能值的真阳性率(即，灵敏度)和假阳性率(即，100％特异性)对的曲线测定预定值。与左上角最接近的曲线上的预定值(即，包围最大面积的值)是最精确的预定值，并且产生比通过此方法测定的预定值更高的信号的样品被认为是阳性的。可选择地，可将预定值沿着曲线向左偏移以使假阳性率降至最低。
(a)免疫印迹法
可将检测方法用于免疫印迹检测系统以在测试样品或对照样品中检测针对fmdvvp1-4或3d聚合酶的抗体。免疫印迹法可使用固体支持物以固定试剂。
免疫印迹法可使用两个分别的对照样品(即，第一对照和第二对照)，可将所述样品固定在固体支持物上。免疫印迹法可使用3个分开的、不连续对照样品(即，第一对照、第二对照和第三对照)。如果存在超过一种的对照样品，则对照可以彼此相同或彼此不同。对照样品中的两种样品可以相同(例如，第一对照与第二对照)。如果对照样品中的两种样品相同，则对照样品之一的浓度(第一对照或第二对照或如果存在3种对照，则第一对照或第三对照或第二对照或第三对照的水平)可高于(或大于)其它对照。对照样品可在浓度上高于另一种对照，并且可被称为“高对照”。以比高对照更低的浓度固定在条带、盘或薄板上的对照可被称为“低对照”。低对照对高对照的浓度比可以为约1:2至约1:10，优选约1:5至约1:6。例如，第一对照可以为低对照并且第二对照可以为高对照。可选择地，第一对照可以为高对照并且第二对照可以为低对照。以另一个例子为例，3个对照检测系统可包括低对照和高对照以及第三对照(其可被用于例如验证样品添加)。低对照和高对照可以为人血浆(其中低对照对高对照的比率为约1:2至约1:10)并且第三对照可以为sdbchagas或人血浆。
在流过式分析形式(flow-throughformat)中，可将固体支持物上的固定的试剂浸入含有测试样品的溶液中。可选择地，可将固体支持物与稀释剂一起置于反应盘(reactiontray)中，然后向反应盘中加入测试样品。使用本文中先前描述的相同时间和技术将测试样品和试剂温育充足的时间。可使用本文中先前描述的技术除去未结合的测试样品。在该形式中，当测试样品通过膜时，测试样品中针对vp1-4或ns结构蛋白例如3d聚合酶的抗fdmv抗体可结合固定的试剂(和至少一种对照)。可加入至少一种检测试剂(例如本文中先前描述的包含可检测标记的检测试剂)。至少一种检测试剂可结合每一个试剂-抗体复合物(当含有检测试剂的溶液流过条带时形成的)。为了确定针对vp1-4或ns结构蛋白例如3d聚合酶的抗fdmv抗体在测试样品中的存在或不存在，可如上所述使用截断值或如下更详细地论述的通过比较由一个或多个对照产生的一个或多个信号的强度来检测结合的检测试剂。
当可将上述低对照和高对照用于流过式分析形式中时，可通过鉴定来自可检测标记的信号在每一个试剂的测试条带(或斑或点)上的存在来确定针对vp1-4或ns结构蛋白例如3d聚合酶的抗fdmv抗体在测试样品中的存在或不存在。如果信号在试剂的测试条带上得到鉴定，那么使用0至4+的等级将该检测到的信号的强度与来自低对照条带(或斑或点)和高对照条带(或斑或点)的信号的强度相比较。当无条带可见时读数为0。可将低对照条带和高对照条带的强度分别确定为1+(对于低对照)和3+(对于高对照)。具有可与低对照的强度相比较的强度的测试条带可被评级为1+。具有低对照的强度与高对照的强度之间的强度的条带可被评级为2+。具有可与高对照的强度相比较的强度的条带可被评级为3+。高于高对照的条带强度的条带强度可被评级为4+。
(b)竞争性测定
可将检测方法用于竞争性检测系统来鉴定具有针对vp1-4或ns结构蛋白例如3d聚合酶的抗fdmv抗体的测试样品。可将所述试剂固定在上述固体支持物上。随后可将固定的试剂与被可检测标记的竞争性抗体接触，已知所述竞争性抗体结合所述试剂并且与测试样品中的针对vp1-4或ns结构蛋白例如3d聚合酶的抗fdmv抗体竞争。还可将固定的试剂与测试样品接触。来自可检测地标记的抗体的信号在含有针对vp1-4或ns结构蛋白例如3d聚合酶的抗fdmv抗体的测试样品中可能更低，因为两组抗体都竞争所述固定的试剂。
f.诊断试剂盒
本文中提供了用于进行鉴定已用疫苗接种的哺乳动物与被fmdv感染的哺乳动物的诊断方法的试剂盒。所述试剂盒提供了材料，所述材料允许鉴定已被fmdv感染的哺乳动物以鉴定抗fs蛋白(包括fmdv的3d聚合酶蛋白)的抗体对仅针对接种的哺乳动物的空衣壳蛋白vp1-4的抗体。测试试剂盒可包括一种或多种试剂例如用于实施一个或多个根据本发明的免疫测定的试剂。测试试剂盒通常包括具有一个或多个容器的包装，所述容器装有试剂如一种或多种分开的组合物或任选地其中允许试剂的相容性的混合物。测试试剂盒还可包括从用户的角度来看可能是想要的其它材料，例如缓冲液、稀释液、标准和/或用于样品处理、洗涤或进行测定的任何其它步骤的任何其它材料。
根据本发明的试剂盒可包括固相和附着至固体支持物的试剂。可将试剂盒用于进行夹心免疫测定法，且试剂盒可包括标记的检测抗体。标记的检测抗体可以是抗人igg标记抗体。所述试剂盒还可包括可检测的标记物。
测试试剂盒可包括至少一种直接标记物例如吖啶-9-甲酰胺。根据本发明的测试试剂盒还可包括至少一种间接标记物。如果所使用的标记物通常需要指示剂来产生可检测的信息，那么测试试剂盒可包括一种或多种适当的指示剂。
测试试剂盒可包括用于进行本发明的一个或多个免疫测定法的说明书。可将本发明的试剂盒中包括的说明书粘贴至包装材料或可将其以包装说明书的形式包括在试剂盒中。虽然说明书通常是书写或印刷的材料，但它们不限于此。本发明涉及能够存储此类说明书并且将它们传送至终端用户的任何介质。这样的介质包括但不限于电子存储介质(例如，磁盘、磁带、盒式贮存器(cartridge)、芯片)、光学介质(例如，cdrom)等。如本文中所使用的，术语“说明书”可包括提供该说明书的互联网站的地址。
实施例
实施例1
重组vp1-4的表达
通过使用上述最优化的vp1-4和3c表达质粒进行体内翻译测定来表达亚型最优化的vp1-4蛋白和最优化的3c蛋白。此类蛋白的翻译在sds-page凝胶上产生预期的条带。
为了确认vp1-4蛋白的表达，将编码亚型最优化的vp1-4蛋白和n末端ige前导序列的核酸克隆入his-标记细菌表达载体。也将编码亚型最优化的3c蛋白的核酸克隆入his-标记细菌表达载体。使用细菌表达系统表达最优化的vp1-4和3c蛋白，使用镍柱分离来进行亲和层化。使用sds-page凝胶分析纯化的蛋白质。sds-page显示预期的条带。
实施例2
接种方法
为了测试dna质粒的功效，用最优化的vp1-4-和3c-编码pvax质粒免疫balb/c小鼠。将空pvax和人il-15-编码pvax载体用作对照。在第0、14和28天每天免疫小鼠3次。在最后一次免疫后3天处死免疫小鼠。收集小鼠的血清，分析其抗-vp1、-vp2、-vp3和-vp4elisa。将来自实施例1的his-标记的重组蛋白用作捕捉抗原。pvax对照的血清不能识别任何亚型最优化的vp1-4。相反地，用亚型最优化的vp1-4dna疫苗免疫的小鼠产生针对亚型最优化的vp1、-2、-3和-4的抗体，这表明最优化的vp1-4融合疫苗正引起小鼠产生抗所有4种vp的免疫反应。
实施例3
制备表达构建体
构建多靶向性fmddna疫苗。首先用来自每一个亚型的至少10个不同的序列对来自亚型asia1、o、a、c、sat1、sat2和sat3的vp1序列进行共有序列最优化。然后，将两个vp1序列插入在一个启动子下，并且通过两个连续切割位点分隔。
将ige前导序列插入在第一orf之前，将两个终止密码子插入在第二orf之后。第一质粒编码asia和ovp1，其为1362bp。
编码a和cvp1的第二质粒为1356bp。第三和第四质粒靶向具有第一编码sat1和sat2vp1以及第二编码sat3vp1的南非亚型。
实施例4
重组vp1-4的表达
随后利用体外翻译测定法表达克隆的质粒。所有单个vp1构建体–a、asia、c和o的翻译–产生预期的条带[约24.5kda]并且a+cvp1和asia+ovp1结构域产生更高的二聚体条带。它们构建件体具有用于免疫沉淀中的flag-表位。
实施例5
接种方法
为了确认抗fmd的免疫反应，我们从所有4种vp1亚型(a、asia、c和o)重组共有fmdvvp1序列(在n端以下划线标示ige前导序列)产生重组fmdvp1蛋白。将蛋白质克隆入his-标记的细菌表达载体，然后表达载体。通过镍柱分离来纯化蛋白质，以箭头标示表达的蛋白质。
然后为了测试dna质粒的功效，免疫balb/c小鼠。使用cellectra电穿孔利用每次免疫15μgdna来免疫小鼠。存在7个免疫组：
1.pvax
2.pvax-fmdvvp1a+pvax1-il-15
3.pvax-fmdvvp1asia+pvax1-il-15
4.pvax-fmdvvp1c+pvax1-il-15
5.pvax-fmdvvp1o+pvax1-il-15
6.pvax-fmdvvp1a-c+pvax1-il-15
7.pvax-fmdvvp1asia-o+pvax1-il-15
在第0、14和28天免疫小鼠3次，在最后一次免疫后3天处死小鼠。收集小鼠的血清，分析其抗vp1elisa。将重组蛋白质用作捕捉抗原。来自pvax对照小鼠的血清不能识别a、asia、c和ovp1蛋白。相反地，用a、asia、c和odna疫苗免疫的小鼠产生分别针对a、asia、c和ovp1蛋白的抗体。更重要地，用vp1a-c或ap1asia-o疫苗免疫的小鼠产生针对所有4种vp1亚型的抗体，这表明共有-vp1融合疫苗正产生抗所有4种亚洲-欧洲fmd亚型的免疫反应。