特异性结合白色念珠菌中(1,3)-β-D-葡聚糖的单链DNA适配子的制作方法

本发明涉及分子微生物学和感染免疫领域，具体涉及特异性结合白色念珠菌中(1,3)-β-D-葡聚糖的单链DNA适配子。

背景技术：

深部真菌感染(invasive fungal infection,IFI)是致病型真菌侵犯皮下组织、黏膜和脏器所引起的真菌感染性疾病。目前抗生素和免疫抑制剂的不规范使用以及侵袭性医疗手段的广泛使用，医院内深部真菌的感染率呈现升高趋势，其高致死率亦引起医务人员的高度重视。而早期诊断与治疗是降低深部真菌致死率的有效手段。

真菌培养当前仍为诊断深部真菌感染的金标准，然而深部真菌取材困难以及真菌培养周期较长等因素均不利于对其快速诊断；而目前应用较为广泛的G试验仍存在一些弊端：标本的采集质量要求较高、一些药物的使用、链球菌血症等，易造成假阳性。因此临床亟待一种能够特异性鉴别真菌感染性且操作简易的新方法。

而白色念珠菌为临床最为常见的导致深部感染的真菌。而真菌细胞壁中葡聚糖约占真菌细胞壁干重的60％，且(1,3)-β-D-葡聚糖约占葡聚糖总量的84％。而真菌细胞壁内(1,3)-β-D-葡聚糖为水溶性较差的多糖类物质，而糖类抗原免疫原性较差，抗体制备较为困难，难于用常规的免疫学方法检测。

技术实现要素：

本发明的一个目的在于提出一种可以鉴别、诊断深部真菌感染的特异性结合白色念珠菌中(1,3)-β-D-葡聚糖的单链DNA适配子。

根据本发明的一种特异性结合白色念珠菌中(1,3)-β-D-葡聚糖的单链DNA适配子，该特异性结合白色念珠菌中(1,3)-β-D-葡聚糖的单链DNA适配子的核苷酸序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

根据本发明实施例的一种特异性结合白色念珠菌中(1,3)-β-D-葡聚糖的单链DNA适配子，可以鉴别、诊断深部真菌感染，为深部真菌感染的鉴别诊断提供了新的思路，具有良好的应用前景。

另外，根据本发明上述实施例的一种特异性结合白色念珠菌中(1,3)-β-D-葡聚糖的单链DNA适配子，还可以具有如下附加的技术特征：

进一步地，该特异性结合白色念珠菌中(1,3)-β-D-葡聚糖的单链DNA适配子的核苷酸序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示核苷酸序列经替换、缺失和/或插入一个或几个核苷酸形成的具有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2同等功能的序列。

进一步地，该特异性结合白色念珠菌中(1,3)-β-D-葡聚糖的单链DNA适配子的核苷酸序列以SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示核苷酸序列为核心，并向两边延长。

本发明的另一目的在于提出一种含有上述特异性结合白色念珠菌中(1,3)-β-D-葡聚糖的单链DNA适配子的试剂。

本发明的另一目的在于提出一种筛选如权1所述的特异性结合白色念珠菌中(1,3)-β-D-葡聚糖单链DNA适配子的方法。

根据本发明的一种筛选上述特异性结合白色念珠菌中(1,3)-β-D-葡聚糖单链DNA适配子的方法，包括如下步骤：S101：合成特异性引物，并通过特异性引物合成起始单链DNA文库；S102：将所述起始单链DNA文库进行不对称PCR扩增，以得到单链DNA文库和双链DNA文库；S103：提取白色念珠菌体内的(1,3)-β-D-葡聚糖作为筛选靶标；S104：以所述(1,3)-β-D-葡聚糖作为筛选靶标，通过SELEX技术进行梯度筛选，以得到特异性结合白色念珠菌中(1,3)-β-D-葡聚糖的单链DNA适配子；其中，所述特异性引物为：5’-GCGGAATTCGAACAGTCCGAGCC-3’和‘5-GCGGGATCCTATGACGCATTGACCC-3’，所述起始单链DNA文库为：5’-GCGGAATTCGAACAGTCCGAGCC-N60-GGGTCAATGCGTCATA-3’，所述起始单链DNA文库中的N60表示60个随机核苷酸序列。

进一步地，在S103步骤中，提取分子量为1.3kD～1.5kD的(1,3)-β-D-葡聚糖作为筛选靶标。

进一步地，在步骤S102中，在进行不对称PCR扩增过程中包括单链DNA文库的变性、单链DNA文库的退火和单链DNA文库的延伸，并将所述单链DNA文库的退火过程循环预定次数，以得到双链DNA文库，并以所述双链DNA文库为模板，扩增出下一轮筛选的单链DNA文库，其中，每一轮扩增过程中，所述单链DNA文库的退火过程的循环次数都不同。

进一步地，在步骤S104中，所述梯度筛选的具体过程为：在第1轮～第3轮筛选时取1μg/mL的(1,3)-β-D-葡聚糖作为筛选靶标，在第4轮～第6轮筛选时取0.1μg/mL的(1,3)-β-D-葡聚糖作为筛选靶标，在第7轮～第9轮筛选时取0.01μg/mL的(1,3)-β-D-葡聚糖作为筛选靶标，在第10轮～第12轮筛选时取0.001μg/mL的(1,3)-β-D-葡聚糖作为筛选靶标，并从第6轮筛选开始到第12轮筛选通过健康人体的血浆和聚苯乙烯微孔进行反向筛选。

进一步地，在第12轮筛选过后，回收双链DNA，并用EcoRI和BamHI对所述双链DNA进行双酶切，以得到酶切产物。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1A是酶解后(1,3)-β-D-葡聚糖行SDS-PAGE后经糖原染色鉴定示意图；

图1B是酶解后(1,3)-β-D-葡聚糖行波长扫描鉴定；

图1C和图1D是气相色谱法鉴定酶解后(1,3)-β-D-葡聚糖；

图2是双链DNA文库的扩增；

图3是12轮PCR扩增单链文库；

图4A是不同适配子文库相对结合力的比较；

图4B是第12轮适配子文库中30个单克隆适配子相对结合力的比较；

图5A是适配子AD1的二级结构；

图5B是适配子AU1的二级结构；

图5C是适配子AU1与AD1对靶标表位的竞争检测；

图6是双适配子夹心法检测深部真菌患者血浆中(1,3)-β-D-葡聚糖；

图7是双适配子夹心法检测法的ROC曲线。

具体实施方式

下面结合实验数据和具体实施例进一步阐述本发明。需要说明的是，这些实施例仅用于解释本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1：材料的选择

试剂和仪器：

白色念珠菌ATCC10231购于武汉大学培养物典藏中心；白色念珠菌培养基购于青岛海博生物技术公司；pUC19质粒、DH5α菌种由本实验室冻存；用于克隆构建的主要试剂BamH I、EcoR I、T4DNA连接酶购自Fermentas公司；蛋白marker(Cat:SM1861)购于宝柯生物公司；DNA marker购于东盛生物公司；AxyPrep质粒DNA小量试剂盒购于AXYGEN公司；DNA凝胶回收试剂盒购自AxyPrep公司；PCR mix购于TIANGEN公司；波长扫描仪(贝克曼-库尔特)；核酸蛋白检测仪(德国EPPENDORF公司)；紫外透射仪(Bioimaging System美国UVP公司)；台式离心机、PCR仪(德国EPPENDORF公司)；单链DNA文库及引物由Invitrogen公司合成；化学试剂均为分析纯，购自国药化工。

随机单链DNA(ssDNA)文库的构建和引物合成：

该文库为长度为99碱基的ssDNA文库，两端为固定序列，中间60个核苷酸为随机序列，库容量约为1014～1015。两个引物中分别含EcoR I和BamH I的酶切位点,随机ssDNA文库和引物由invitrogen公司合成。随机ssDNA文库:5’-GCGGAATTCGAACAGTCCGAGCC-N60-GGGTCAATGCGTCATA-3’。引物1:5’-GCGGAATTCGAACAGTCCGAGCC-3’(划线部分为EcoRI酶切位点)；引物2:‘5-GCGGGATCCTATGACGCATTGACCC-3’(划线部分为BamHI酶切位点)。

标本来源：

深部真菌感染血浆由武汉市医疗救治中心和中南医院提供，健康人血清标本均由中南医院体检中心提供。其中深部真菌感染病人诊断标准：1)痰液或血液培养真菌培养为阳性；2)G试验阳性；3)使用抗真菌药物后有显著效果，至少符合以上两条。实验共收集40例确诊呼吸系统深部真菌感染患者血浆(17例肿瘤患者、11例艾滋病患者、9例重度烧伤患者、胸部外科术后患者3例)、12例中心静脉导管留置后的真菌血症患者，且真菌种类分均为白色念珠菌；同时收集单纯呼吸系统、循环系统、泌尿系统细菌感染患者28例((金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌)连续三次，每次间隔一天同时使用真菌培养基鉴定均无真菌生长)和34例健康人血浆作为对照组。

实施例2：提取方法

(1,3)-β-D-葡聚糖的提取和鉴定：

收集固体培养基上白色念珠菌菌体，加入少量PBS洗涤后离心冷冻干燥，取5克干燥菌体加入100mL 1M氢氧化钠重悬后于90℃水浴中反应3小时；离心后纯水洗涤沉淀3次，再用4％的醋酸溶液在37℃处理3小时，离心后沉淀物用纯水洗涤3次，再用无水乙醇洗涤3次，乙醚脱水后氮气吹干即得产品，通过气相色谱法鉴定后冷冻保存备用。用(1,3)-β-葡聚糖酶对其进行酶解增加其水溶性，切胶回收分子量于1.4kD左右的低聚合度的水溶性(1,3)-β-D-葡聚糖作为筛选靶标。

单链DNA(ssDNA)文库及双链DNA(dsDNA)的扩增：

将合成的ssDNA文库扩增为dsDNA文库：95℃预变性5分钟,再进行95℃，36s、60℃，36s，72℃，30s，共15个循环，72℃延伸5分钟，行3％琼脂糖凝胶电泳鉴定；并以扩增所得dsDNA文库为模板，上游引物P1不对称扩增出下一轮筛选的ssDNA文库。反应条件:95℃5m in,95℃36s，60℃36s,72℃30s,循环数每轮各不相同，然后在72℃下延伸7min。向PCR产物中加入1/10体积预冷的3M的NaCl，混匀后，再向体系中加入2倍体积的冰预冷的无水乙醇，充分混匀后，置于-80℃沉淀4小时，低温离心即获得。

SELEX筛选：

取1μg/mL可溶性(1,3)-β-D-葡聚糖50μL包被于96孔板中，37℃环境中加入鲑鱼精DNA封闭2h，PBS洗涤后加入含1000pM单链文库溶解于50μL筛选缓冲液(20mM HEPES(pH＝7.4),120mM NaCl，5mM KCl，1mM CaCl2，1mM MgCl2·6H2O)，37℃孵育1小时；离心弃去液体，加入筛选缓冲液洗涤5次后，加入100μL灭菌双蒸水，于95℃加热5分钟；吸取孔中上清为模板做常规PCR，作为下一轮筛选的dsDNA文库。为了提高筛选适配子的亲和力，采用梯度筛选的方式进行，即第1至第3轮用1μg/mL的(1,3)-β-D-葡聚糖作为靶标，第4至第6轮用0.1μg/mL，第7至第9轮用0.01μg/mL；第10到第12轮用0.001μg/mL，并且从第6轮筛选开始通过健康人血浆和聚苯乙烯微孔进行反向筛选。回收第12轮dsDNA库和pUC19质粒用EcoR I和BamH I进行双酶切，纯化回收酶切产物，使用T4连接酶进行连接反应置于16℃，作用16小时。将连接产物转化至DH5α中，挑取单克隆，提取质粒并进行酶切鉴定后通过ELONA直接法测定相对结合力大小，并选取相对结合力最高的两个适配子测序，作为候选检测工具，同时使用Mfold预测其二级结构，并使用竞争法验证其是否结合同一位点。

对临床血浆标本的检测：

96微孔板紫外照射2小时，包被适配子AD1于96微孔板，每孔40pmol，37℃孵育1小时；10μg/mL鲑鱼精DNA封闭微孔板，37℃孵育1小时；加入待测血浆37℃孵育1小时；再加入生物素标记的适配子AU1，每孔40pmol，37℃孵育1小时，最后加入辣根过氧化物酶耦联的链霉亲和素，37℃孵育30min，加入TMB显色底物，1分钟左右，2M H2SO4终止反应后通过酶标仪读数。

统计学分析

本发明数据使用Mean±SD表示，并使用SAS 8.0软件对数据进行处理。组间比较使用t检验，以P<0.05为具有统计学差异。

实施例3：结果

(1,3)-β-D-葡聚糖的提取、纯化和鉴定：

从白色念珠菌中提取(1,3)-β-D-葡聚糖，经(1,3)-β-D-葡聚糖酶处理后上清，行SDS-PAGE电泳后经糖原染色，发现主要集中在三个区域，<1.7kD，4.6kD附近，以及10kD～15kD之间，且呈现连续分布，如图1A所示，箭头所示为本次研究的靶标物质；本试验主要通过切胶回收分子量<1.7kD的低聚合度(1,3)-β-D-葡聚糖为筛选靶标；回收所得低聚合度(1,3)-β-D-葡聚糖经190nm～900nm连续波长扫描，在196nm处可见一明显吸收峰，而260nm和280nm处均无明显吸收峰，提示所提物质为较为纯净的碳水化合物，如图1B所示，箭头所示为196nm处最高吸收峰；图1C中箭头所示从左向右依次为：鼠李糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖和木糖标准品，图1D中箭头所示为水解后的单糖。对回收物质物质通过酸解、还原、酰化衍生后行气相色谱法检测，仅在保留时间5.896min有单一峰值(其余为杂峰)，如图1D所示，根据图1C中标准品气相色谱结果的比对，葡萄糖标准品保留时间为6.07min，两者接近，其微小差异可能为水解衍生后的单糖构象与葡萄糖标准品单体构象的差异导致。

DNA文库及筛选产物的PCR扩增：

化学合成的起始ssDNA随机文库经不对称PCR扩增得到的ssDNA随机文库，结果显示dsDNA库片段大小在DNA marker分子100bp附近，与预期片段大小(108bp)相符，如图2A所示，1泳道为无模板对照，M为DNA marker，2泳道为双链DNA文库。通过SELEX筛选技术筛选获得特异性结合(1,3)-β-D-葡聚糖的12轮ssDNA适配子库，将各轮单链适配子库行3％的DNA琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果显示，前8轮ssDNA文库大小在150bp～200bp之间，第9～12轮ssDNA适配子可能由于结构变化原因导致大小发生变化如图2B所示，第1至第12轮ssDNA文库，M为DNA marker，L为初始ssDNA文库，1～12泳道分别为第1轮至第12轮的筛选ssDNA文库。

每一轮适配子库及不同克隆单适配子亲合力的检测：

包被水溶性(1,3)-β-D-葡聚糖，分别使用生物素化的每一轮的ssDNA文库与之结合，根据A450nm比较相对结合力的大小，数据显示随着筛选轮数的增加，相同物质量的适配子结合能力明显升高，在第6轮却显著降低，可能与加入了血浆反筛的结果，但随后仍持升高趋势，在第11轮时其结合力已达最高值，第12轮趋于平台期，如图4A所示，其中，B为空白对照，L为起始文库。将第12轮dsDNA文库克隆至pUC19质粒，挑取单克隆后测定单克隆适配子与靶标物质的相对结合力，数据显示第11号适配子(命名为AD1)与第20号适配子(命名为AU1)具有较高的结合力，如图4B所示，其中，B为空白对照，C为无关适配子对照。

筛选适配子二级结构及结合位点的验证：

使用http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/对测序得两条适配子进行二级结构进行预测，如图5A和5B所示；同时使用两条ssDNA适配子与水溶性(1,3)-β-D-葡聚糖竞争结合，数据显示AU1适配子的加入对AD1适配子结合靶标无明显抑制作用，提示两适配子非结合同一位点，如图5C所示，其中，Bio-代表生物素标记；ctrl为无关适配子，Blank为空白对照。

适配子夹心法检测血浆标本：

包被AD1适配子，AU1适配子作为检测适配子，结果显示该方法能够很好的区分不同部位深部真菌感染与细菌感染人群和健康人群(p<0.01)，如图6所示；对62例非深部真菌感染组成员和52例深部真菌感染组患者检测结果使用ROC曲线进行分析，可知本研究建立的ELONA夹心法其敏感度为：92.31％(95％CI：81.46％-97.86％)，特异度为：91.94％，(95％CI:82.17％-97.33％)，显示出较好的区分效果，如图7所示。

结论：

近年来深部真菌发病率逐年攀升，快速并特异地检测真菌感染的方法对于降低真菌致死率有重大意义。现行深部真菌感染诊断方法以G实验为主，且存在一些不足，而基层医院仍以经验为主导。深部真菌感染后，机体对其进行免疫过程中产生不同聚合度的(1,3)-β-D-葡聚糖，而一些革兰氏阴性菌以及机体内自身亦存在一定浓度的(1,3)-β-D-葡聚糖。而G试验无法区分这类物质中微小的差别，因此该方法亦受多重因素影响。本发明通过提取白色念珠菌细胞壁特异性的(1,3)-β-D-葡聚糖，并体外模拟该聚糖被(1,3)-β-D-葡聚糖酶消化的过程，从而较为真实的以白色念珠菌特有的该聚糖作为筛选靶标。鉴于糖类抗原免疫原性较差，因此本发明根据SELEX技术的特点，利用该技术筛选能够与白色念珠菌细胞壁葡聚糖结合的ssDNA适配子，并且在第6轮以人血浆作为反筛物质，经过12轮的正向筛选与6轮的反向筛选，从而排除了人血浆中(1,3)-β-D-葡聚糖类的干扰以及检测器材的干扰，得到相对亲和力和特异度较高的适配子AD1和AU1。并通过Mfold对其二级结构进行分析，推测其可能结合于不同的靶点，随后并通过竞争结合实验验证得出该结论。

本发明利用双适配子夹心法对深部真菌感染患者血浆以及健康人血浆进行了初步检测，结果显示该方法能够明显的区分深部真菌感染。对于该次检验结果分析，其灵敏度和特异度均优于现行G实验和形态学检查。数据表明该方法对深部真菌感染血浆检测具有良好的区分能力。而核酸适配子作为一类新型的识别分子，其具有分子量较低，可通过化学合成制备及结构改造，并且能够进行荧光、生物素等多种功能标记，化学稳定性好，能可逆的变性与复性，可在常温下保存和运输等优点。这些优点使适配子在临床诊断及治疗中具有良好的应用前景。

而本发明仅针对了呼吸系统和循环系统白色念珠菌感染患者进行了检测，而其在深部真菌感染患者其它体液及其它种属真菌的检测工作以及该适配子与生物传感器的结合期望进一步提高灵敏度等工作即将开展。

综上所述，本发明运用SELEX技术成功地筛选到高亲和力及高特异性结合白色念珠菌细胞壁葡聚糖的ssDNA适配子，为深部真菌感染的鉴别诊断提供了新的思路，具有良好的应用前景。

在本发明的描述中，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个以上，除非另有明确具体的限定。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。