一种抑制人黑色素瘤RBM3基因表达的siRNA及其质粒载体的制作方法

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种抑制人黑色素瘤rbm3基因表达的sirna及其质粒载体。

背景技术：

黑色素瘤，又称恶性黑色素瘤，是来源于黑色素细胞的一类恶性肿瘤，常见于皮肤，亦见于黏膜、眼脉络膜等部位。它是一种由来源于神经脊的黑色素细胞异常增生而产生的恶性皮肤肿瘤，具有极高的转移性，而且对一般化疗有抗性。因此尽管黑色素瘤的发病率在皮肤癌中只排第三位，但它的致死率却是最高的，在所有皮肤癌致死的病人中，有近80％的病人死于黑色素瘤。黑色素瘤是皮肤肿瘤中恶性程度最高的瘤种，有效阻断黑色素瘤细胞增殖可为黑色素瘤的治疗提供大力帮助。

rna干涉(rnainterfering，rnai)技术是近几年发展起来的一种抑制基因表达的最有力的工具之一。此技术采用19-23个碱基或发夹状不同长度的双链rna(sirna)可使不同类型细胞的靶向基因表达明显降低，因此，rnai技术可使基因表达下调。这是一种典型的转录后基因调控方法，又称转录后基因沉默。这种新兴的生物技术为疾病分子水平的治疗提供了新的技术和方法，在哺乳动物细胞中建立rna干涉技术，可以用于研究某些特定基因的功能，从而可以解决某些疾病的发病机制，同时对疾病尤其是对肿瘤的治疗也有一定的应用价值，并且rna干涉技术所使用的剂量仅为反义寡核苷酸剂量的万分之一左右。另一方面，若小双链rna中改变1个核苷酸，就可使该rnai靶向基因沉默作用消失，这样，就有可能将这一技术用于抑制某些过度表达基因的表达，而不影响正常基因的表达，因此，利用rna干扰技术制备基因药物将是一种有效的途径。

在环境温度发生明显改变时(如冬眠)，生物体会产生某种蛋白来调节机体功能，以适应温度变化。比如，在环境温度降低时机体会在低温的刺激下产生一些蛋白来适应环境变化，该类蛋白统称为“冷休克蛋白”(coldshockproteins)。rna结合蛋白rbm3是一种十分重要的冷休克蛋白，其分子量约17kda。目前研究显示，除低温外，其他压力因素如低氧亦可刺激细胞表达rbm3蛋白。肿瘤组织中，低氧水平致使rbm3编码的蛋白的总量上升，从而导致肿瘤细胞的增殖不受控制，并最终加速肿瘤的形成，如乳腺癌、胰腺癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌及前列腺癌等，因此rbm3还被认为是一种癌基因。研究者采用sirna技术来“沉默”rbm3的基因表达，来降低肿瘤细胞内rbm3的水平，进而来抑制肿瘤细胞的增殖。但癌基因rbm3是否影响黑色素瘤细胞的增殖能力尚不清楚，同时目前尚无专门用于抑制人黑色素瘤rbm3基因表达的rnai技术。

技术实现要素：

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种抑制人黑色素瘤rbm3基因表达的sirna，同时还提供了该sirna表达质粒载体的构建方法及其应用，并发现癌基因rbm3表达水平下调可显著抑制人黑素瘤细胞的体外增殖。

本发明具体通过以下技术方案实现：

一种抑制人黑色素瘤rbm3基因表达的sirna，所述sirna能够抑制人黑色素瘤rbm3基因的表达，正义链序列为seqno.1、seqno.2、seqno.3、seqno.4或seqno.5中任意一个所示的序列。

进一步地，所述sirna正义链序列为seqno.1或seqno.5中任意一个所示的序列。

一种抑制人黑色素瘤rbm3基因表达的sirna的质粒载体，所述质粒载体包含能够抑制人rbm3基因表达的sirna；所述sirna的正义链序列为seqno.1、seqno.2、seqno.3、seqno.4或seqno.5中任意一个所示的序列。

进一步地，所述sirna正义链序列为seqno.1或seqno.5中任意一个所示的序列。

一种抑制人黑色素瘤rbm3基因表达的sirna的质粒载体的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：

1)sirna对应的dna序列的合成

根据序列表中任何一个sirna的正义链序列，设计其对应的dna序列，序列两端引入酶切位点，所述dna序列为两条单链，并且两条单链是一对互补序列，设计好的序列经合成后，通过退火形成双链dna；

2)psilencer3.1-puro-sirna载体的构建

将psilencer3.1-puro载体使用步骤1)中所述的两个限制性内切酶ecori和hindiii进行双酶切，回收目的片段，然后将回收的目的片段与步骤1)中形成的双链dna序列连接，并转化感受态细胞，筛选得到阳性菌落，提取质粒，进行双酶切验证，即可，将经验证正确的重组质粒命名为psilencer3.1-puro-sirna载体。

一种抑制人黑色素瘤rbm3基因表达的sirna的质粒载体在抑制黑色素瘤增殖药物方面的应用，所述质粒载体含有能够产生特异性抑制人rbm3基因表达的sirna；所述的sirna的正义链序列为seqno.1、seqno.2、seqno.3、seqno.4和seqno.5中任意一个所示的序列。

有益效果：与现有技术相比，本发明提供的抑制人黑色素瘤细胞中rbm3基因表达的sirna，可以有效抑制黑色素瘤细胞的体外增殖，为黑色素瘤的药物治疗提供新的靶点，为治疗黑色素瘤提供了一定的理论基础和可行的药物。

附图说明

图1为sirna表达质粒对rbm3的基因沉默效果分析；

图2为rbm3基因沉默对人黑色素瘤细胞体外增殖的影响。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步阐述。

一种抑制人黑色素瘤rbm3基因表达的sirna，所述sirna能够抑制人黑色素瘤rbm3基因的表达，正义链序列为seqno.1、seqno.2、seqno.3、seqno.4或seqno.5中任意一个所示的序列。

进一步地，所述sirna正义链序列为seqno.1或seqno.5中任意一个所示的序列。

一种抑制人黑色素瘤rbm3基因表达的sirna的质粒载体，所述质粒载体包含能够抑制人rbm3基因表达的sirna；所述sirna的正义链序列为seqno.1、seqno.2、seqno.3、seqno.4或seqno.5中任意一个所示的序列。

进一步地，所述sirna正义链序列为seqno.1或seqno.5中任意一个所示的序列。

一种抑制人黑色素瘤rbm3基因表达的sirna的质粒载体的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：

1)sirna对应的dna序列的合成

根据序列表中任何一个sirna的正义链序列，设计其对应的dna序列，序列两端引入酶切位点，所述dna序列为两条单链，并且两条单链是一对互补序列，设计好的序列经合成后，通过退火形成双链dna；

2)psilencer3.1-puro-sirna载体的构建

将psilencer3.1-puro载体使用步骤1)中所述的两个限制性内切酶ecori和hindiii进行双酶切，回收目的片段，然后将回收的目的片段与步骤1)中形成的双链dna序列连接，并转化感受态细胞，筛选得到阳性菌落，提取质粒，进行双酶切验证，即可，将经验证正确的重组质粒命名为psilencer3.1-puro-sirna载体。

一种抑制人黑色素瘤rbm3基因表达的sirna的质粒载体在抑制黑色素瘤增殖药物方面的应用，所述质粒载体含有能够产生特异性抑制人rbm3基因表达的sirna；所述的sirna的正义链序列为seqno.1、seqno.2、seqno.3、seqno.4和seqno.5中任意一个所示的序列。

图1为sirna表达质粒对rbm3的基因沉默效果分析。将5种人rbm3基因特异性的sirna表达质粒转染至人黑色素瘤细胞系(a375)，2天后将细胞裂解取全蛋白进行western印迹分析，β-actin作为内参。结果显示编号为seqno.1和seqno.5的sirna可强烈抑制rbm3基因在黑色素瘤细胞中的表达。

图2为rbm3基因沉默对人黑色素瘤细胞体外增殖的影响。将2种人rbm3基因特异性的sirna表达质粒转染至人黑色素瘤细胞系(a375)，分别于第1天，第2天，第3天和第4天用mtt法测量rbm3基因沉默对细胞增殖的影响。结果显示这两种sirna表达质粒均可以有效地抑制人黑色素瘤细胞的体外增殖。

实施例1

一种抑制人黑色素瘤rbm3基因表达的sirna，所述sirna能够抑制人黑色素瘤rbm3基因的表达，正义链序列为seqno.1所示的序列。

一种抑制人黑色素瘤rbm3基因表达的sirna的质粒载体，所述质粒载体包含能够抑制人rbm3基因表达的sirna；所述sirna的正义链序列为seqno.1所示的序列。

一种抑制人黑色素瘤rbm3基因表达的sirna的质粒载体的构建方法，其特征在于：所述构建方法包括以下步骤：

1)sirna对应的dna序列的合成

根据序列表中sirna的正义链序列seqno.1，设计其对应的dna序列，序列两端引入酶切位点，所述dna序列为两条单链，并且两条单链是一对互补序列，设计好的序列经合成后，通过退火形成双链dna；

2)psilencer3.1-puro-sirna载体的构建

将psilencer3.1-puro载体使用步骤1)中所述的两个限制性内切酶ecori和hindiii进行双酶切，回收目的片段，然后将回收的目的片段与步骤1)中形成的双链dna序列连接，并转化感受态细胞，筛选得到阳性菌落，提取质粒，进行双酶切验证，即可，将经验证正确的重组质粒命名为psilencer3.1-puro-sirna载体。

一种抑制人黑色素瘤rbm3基因表达的sirna的质粒载体在抑制黑色素瘤增殖药物方面的应用，所述质粒载体含有能够产生特异性抑制人rbm3基因表达的sirna；所述的sirna的正义链序列为seqno.1所示的序列。

试验结果表明：1)rbm3sirna抑制基因表达分析

参考图1，seqno.1的sirna表达质粒转染人黑色素瘤细胞系(a375)后2天，westernblot分析其对rbm3基因表达的抑制效果。结果显示seqno.1几乎完全抑制rbm3基因的表达。

2)rbm3sirna对人黑色素瘤细胞体外增殖的影响

参考图2，seqno.1的sirna表达质粒转染人黑色素瘤细胞系(a375)后1-4天，用mtt法检测其对细胞增殖的影响。结果显示seqno.1的sirna可显著抑制人黑色素瘤细胞的体外增殖。

实施例2

一种抑制人黑色素瘤rbm3基因表达的sirna，所述sirna能够抑制人黑色素瘤rbm3基因的表达，正义链序列为seqno.5所示的序列。

一种抑制人黑色素瘤rbm3基因表达的sirna的质粒载体，所述质粒载体包含能够抑制人rbm3基因表达的sirna；所述sirna的正义链序列为seqno.5所示的序列。

一种抑制人黑色素瘤rbm3基因表达的sirna的质粒载体的构建方法，其特征在于：所述构建方法包括以下步骤：

1)sirna对应的dna序列的合成

根据序列表中sirna的正义链序列seqno.5，设计其对应的dna序列，序列两端引入酶切位点，所述dna序列为两条单链，并且两条单链是一对互补序列，设计好的序列经合成后，通过退火形成双链dna；

2)psilencer3.1-puro-sirna载体的构建

将psilencer3.1-puro载体使用步骤1)中所述的两个限制性内切酶ecori和hindiii进行双酶切，回收目的片段，然后将回收的目的片段与步骤1)中形成的双链dna序列连接，并转化感受态细胞，筛选得到阳性菌落，提取质粒，进行双酶切验证，即可，将经验证正确的重组质粒命名为psilencer3.1-puro-sirna载体。

一种抑制人黑色素瘤rbm3基因表达的sirna的质粒载体在抑制黑色素瘤增殖药物方面的应用，所述质粒载体含有能够产生特异性抑制人rbm3基因表达的sirna；所述的sirna的正义链序列为seqno.5所示的序列。

试验结果表明：

1)rbm3sirna抑制基因表达分析

参考图1，seqno.5的sirna表达质粒转染人黑色素瘤细胞系(a375)后2天，western印迹分析其对rbm3基因表达的抑制效果，结果显示seqno.5可显著抑制rbm3基因的表达，抑制率大于85％。

2)rbm3sirna对人黑色素瘤细胞体外增殖的影响

参考图2，seqno.5的sirna表达质粒转染人黑色素瘤细胞系(a375)后1-4天，用mtt法检测其对细胞增殖的影响，结果显示seqno.5的sirna可显著抑制人黑色素瘤细胞的体外增殖，抑制率大于95％。

所述sirna的正义链序列可以用seqno.2、seqno.3、seqno.4的序列进行替换。