一种帕金森病诊断试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术，疾病诊断和生物医药领域，具体地说，涉及一种帕金森病诊断试剂盒及其应用。

背景技术：

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)又称震颤麻痹，是仅次于阿尔茨海默病的第二常见神经系统变性疾病。除黑质纹状体变性引起的静止性震颤、肌强直及运动迟缓等运动症状外，非运动症状如嗅觉缺失、抑郁、自主神经功能障碍、快动眼睡眠行为异常(rapid eye movement sleep behavior disorder，RBD)及认知损害等也是PD的重要组成部分。随着人口老龄化的加剧，PD的患病率呈逐年上升趋势，给患者的家庭和社会造成了严重负担。当PD患者出现临床症状时，其黑质多巴胺神经元死亡已超过60％，此时，药物治疗仅能改善患者的临床症状，并不能减缓其疾病的进展。对PD临床前期或早期的识别和诊断，是PD及其他神经变性疾病发病机制研究和新药研发的基础。

目前临床上常规的药物主要有(1)多巴胺替代药物；(2)单胺氧化酶(MAO)抑制剂；(3)儿茶酚胺氧位甲基转移酶(COMT)抑制剂；(4)抗胆碱能药物；(5)多巴胺受体激动剂等等。以上药物能够暂时缓解和改善相关症状，但不能推迟病程，也不能治愈该病。近年来，随着PD病理机制研究进一步深入，与PD有关的致病基因及调控此类基因的非编码RNA(例如miRNA)备受瞩目。

miRNA(microRNA，miR)是有21-23个核苷酸的非编码单链微小RNA，能够通过序列特异性的方式来调节靶基因表达。miRNA具有高度保守性、组织特异性、阶段特异性和时序性等特点。近期研究表明，有大量的miRNA与PD病理机制密切相关，可能为PD治疗提供新的思路。miRNA可调节与遗传性PD相关的基因，如miR-7和miR-153可以调控PD致病基因PARK1/PARK4，miR-205可以调控PARK8，miR-34b/miR-34c可以调控PARK2，miR-494可以调控PARK7等；miRNA也可以调控多种与PD发病机制相关的基因，如miR-34a、miR-132、miR-133b可以分别调控与多巴胺能神经元发育有关的基因Nurr1、Notch1、Pitx3，miR-320可以调控与突触形成有关的基因ARPP-19，miR-433可以调控与神经营养因子有关的基因FGF20等。直接调控PD致病基因的miRNA可能具有直接的治疗作用，而调节PD相关基因的miRNA可能具有辅助治疗作用。miRNA能够调控PD致病基因与相关基因的表达，是一种非常具有前景的治疗手段。因此，进一步研究miRNA在PD发病机制探索以及临床诊断中具有重要的意义。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供四种miRNAs：miR-105-5p，miR-21-5p，miR-29a-5p和miR-30e-5p的新用途。

第一方面，本发明提供了miRNA在制备诊断帕金森病的试剂中的应用，所述的miRNA选自下列中的任一种：

a)miR-105-5p，

b)miR-21-5p，

c)miR-29a-5p，

d)miR-30e-5p，

e)miR-105-5p，miR-21-5p，miR-29a-5p和miR-30e-5p中任两种或任几种的组合。

第二方面，本发明提供了检测血浆中miRNA表达水平的试剂在制备诊断帕金森病的试剂中的应用，所述的miRNA选自下列中的任一种：

a)miR-105-5p，

b)miR-21-5p，

c)miR-29a-5p，

d)miR-30e-5p，

e)miR-105-5p，miR-21-5p，miR-29a-5p和miR-30e-5p中任两种或任几种的组合。

作为本发明的一种具体实施方式，所述的试剂为检测miRNA的引物。

第三方面，本发明提供了一种帕金森病诊断试剂盒，所述的试剂盒含有检测血浆中miRNA表达水平的试剂，所述的miRNA选自下列中的任一种：

a)miR-105-5p，

b)miR-21-5p，

c)miR-29a-5p，

d)miR-30e-5p，

e)miR-105-5p，miR-21-5p，miR-29a-5p和miR-30e-5p中任两种或任几种的组合。

第四方面，本发明提供了miR-105-5p，miR-21-5p，miR-29a-5p或miR-30e-5p的抑制剂在制备治疗帕金森病的药物中的应用。

第五方面，本发明提供了miR-21-5p在制备筛选治疗帕金森病的药物中的应用。

本文中，各miRNA具有如下序列：

miR-105-5p：UCAAAUGCUCAGACUCCUGUGGU(SEQ ID NO.1)，

miR-21-5p：UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA(SEQ ID NO.2)，

miR-29a-5p：ACUGAUUUCUUUUGGUGUUCAG(SEQ ID NO.3)，

miR-30e-5p：UGUAAACAUCCUUGACUGGAAG(SEQ ID NO.4)。

本发明优点在于：

本发明对263例帕金森病患者和242例年龄性别匹配的健康对照组血浆中的miR-105-5p，miR-21-5p，miR-29a-5p，miR-30e-5p表达水平进行单盲检测，发现这4种miRNAs在帕金森病患者和健康人群血浆中有明显差异，提示四种miRNAs包括miR-105-5p，miR-21-5p，miR-29a-5p，miR-30e-5p可作为诊断分子标志物用于制备诊断帕金森病的试剂盒，或用于制备治疗帕金森病的药物。同时，我们发现服药情况对miR-21-5p有显著影响，提示其可用于筛选治疗帕金森病的药物。本发明对进一步研究miRNAs在帕金森病发病以及临床诊断和治疗中的功能具有重要的意义。

附图说明

图1.miRNAs在帕金森病患者血浆中的表达。荧光定量RT-PCR方法检测健康对照(n＝242)和帕金森病患者(n＝263)血浆中miR-105-5p，miR-21-5p，miR-29a-5p，miR-30e-5p的表达。HC：健康对照；PD：帕金森病患者。

图2.服药情况对帕金森病患者血浆中miRNAs的影响。分析与健康对照相比，帕金森病患者未服药(n＝66)，服用左旋多巴(n＝65)，服用左旋多巴与多巴胺受体激动剂联合用药(n＝71)对血浆中miR-105-5p，miR-21-5p，miR-29a-5p，miR-30e-5p表达的影响。ctrl：健康对照；naive：帕金森病患者未服药组；L-dopa：帕金森病患者服用左旋多巴组；L-dopa+DR：帕金森病患者服用左旋多巴与多巴胺受体激动剂联合用药组。与健康对照组相比，^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001。与帕金森病患者未服药组相比，^###p<0.001。

图3.年龄对帕金森病患者血浆中miRNAs的影响。将入组帕金森病患者分为四个年龄段40～59岁(HC组n＝34；PD组n＝58)、60～69岁(HC组n＝101；PD组n＝85)、70～79岁(HC组n＝76；PD组n＝87)和80～89岁(HC组n＝30；PD组n＝27)，分析比较健康对照组和帕金森病患者在不同年龄段血浆中miR-105-5p，miR-21-5p，miR-29a-5p，miR-30e-5p表达水平变化。HC：健康对照；PD：帕金森病患者。与健康对照组相比，^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001。

图4.性别对帕金森病患者血浆中miRNAs的影响。分析比较不同性别健康对照组和帕金森病患者血浆中miR-105-5p，miR-21-5p，miR-29a-5p，miR-30e-5p表达水平变化。与健康对照组相比，^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001。

图5.病程对帕金森病患者血浆中miRNAs的影响。将入组帕金森病患者病程分为四个阶段1～3年(n＝86)、4～6年(n＝65)、7～9年(n＝57)和10～20年(n＝39)，分析与健康对照组相比，帕金森病患者在病程不同阶段血浆中miR-105-5p，miR-21-5p，miR-29a-5p，miR-30e-5p表达水平变化。与健康对照组相比，^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1

一、材料与方法

1.样本收集和miRNA提取

实验共收集了748例血浆样本，其中包括242个健康对照者，263个帕金森病患者和243个神经系统其他疾病患者。经卡方检验，三组人群在性别年龄方面没有显著差异。每个个体采2mL抗凝血，采集完成后送入实验室，3000rpm常温离心15min后分离血浆分装到灭菌的离心管中，-80℃保存。采用miRcute miRNA提取分离试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取miRNA，方法按照试剂盒说明实施。

表1入组人群性别年龄情况表

Ref：reference；NS：not significant，无统计学意义。

2.miRNA反转录和检测

取上述miNRA，参照天根生化科技(北京)有限公司的miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒及miRcute miRNA荧光定量检测试剂盒进行逆转录和荧光定量RT-PCR检测了miR-105-5p，miR-21-5p，miR-29a-5p，miR-30e-5p的表达，方法按照试剂盒说明实施。所用引物购自天根生化科技(北京)有限公司，商品号分别为CD201-0048，CD201-0092，CD201-0328和CD201-0340。内参选用miRNA-16，所用引物序列为5’-GCTAGCAGCACGTAAATATTGGCG-3’(SEQ ID NO.5)。

3.分析服药情况、年龄、性别和病程对帕金森病患者miRNAs影响

收集入组人群临床病例，对帕金森病患者服药情况、年龄、性别和病程信息进行汇总，并分析其对miR-105-5p，miR-21-5p，miR-29a-5p，miR-30e-5p表达的影响。

4.统计分析和数据处理

所有数据以平均数±标准误差(Means±SEM)表示。用GraphPad Prism software version 4(GraphPad Inc.,San Diego,CA,USA)对两组数据进行独立样本t-检验，多组数据比较采用Oneway-ANOVA，P<0.05视为有统计学差异。二、实验结果

1.miRNAs在帕金森病患者血浆中的表达

我们发现与健康对照者相比，帕金森病患者血浆中miR-105-5p，miR-21-5p，miR-29a-5p，miR-30e-5p的表达均显著增加，分别增加了267.72％、832.62％、187.76％和163.10％(图1)。

2.服药情况对帕金森病患者血浆中miRNAs的影响

根据入组帕金森病患者的服药情况(包括未服药，服用左旋多巴，服用左旋多巴和多巴胺受体激动剂联合用药)，发现帕金森病患者服用多巴胺受体激动剂能明显上调miR-21-5p的表达，而对检测的其他miRNA无明显影响(图2)。

3.年龄对帕金森病患者血浆中miRNAs的影响

将入组健康对照和帕金森病患者按其年龄分为40～59、60～69、70～79和80～89四个年龄段，发现除了40～59年龄段健康对照和帕金森病患者miR-105-5p表达水平相比无统计学意义，帕金森病患者在不同年龄段miR-105-5p，miR-21-5p，miR-29a-5p，miR-30e-5p表达水平均显著上调(图3)。

4.性别对帕金森病患者血浆中miRNAs的影响

我们发现与健康对照者相比，帕金森病患者男性和女性血浆中miR-105-5p，miR-21-5p的表达均显著上调。男性帕金森病患者血浆中miR-30e-5p的表达水平比男性健康对照组显著增多，而女性帕金森患者不明显。miR-29a-5p在帕金森病患者男性和女性血浆中有增高趋势但尚无统计学意义(图4)。

5.病程对帕金森病患者血浆中miRNAs的影响

我们将入组帕金森病患者病程分为四个阶段1～3年、4～6年、7～9年和10～20年，发现与健康对照者相比，帕金森病患者血浆中miR-30e-5p，miR-21-5p在病程不同阶段的表达均显著上调。帕金森病患者血浆中miR-105-5p的表达水平在病程的前三个阶段显著增高，其在患病10～20年的帕金森病患者血浆中的表达有上升趋势。miR-29a-5p在帕金森病患者不同病程阶段血浆中变化不显著(图5)。

三、讨论

本发明在帕金森病患者血浆中验证了4种miRNAs：miR-105-5p，miR-21-5p，miR-29a-5p，miR-30e-5p可作为帕金森病生物标志物或治疗靶点，血浆中miR-105-5p，miR-21-5p，miR-29a-5p，miR-30e-5p或它们的组合，及其引物可用于制备诊断试剂盒，用于帕金森病的辅助早期诊断，miR-105-5p，miR-21-5p，miR-29a-5p，miR-30e-5p的抑制剂可用于制备治疗帕金森病的药物。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。