PP1γ截短体的应用的制作方法

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及PP1γ截短体及其载体和应用。

背景技术：

恶性肿瘤又称癌症，已成为危害人类健康的主要疾病，据统计2008年全世界约有1270万癌症新增患者，760万死于癌症，尤其在发展中国家，癌症新增例数达56％。恶性肿瘤的发病机制复杂，众多的分子和信号通路参与其中，而对其分子机制的详尽了解对肝癌的预防、临床诊断和治疗均具有重要的意义。因此，探究恶性肿瘤发生发展的分子机制具有十分重要的意义，并据此可作为潜在的分子药物开发的靶点及个体化治疗的依据。

在恶性肿瘤进展过程中，某些基因的表达发生变化，是肝癌发生发展的关键基因，成为癌症治疗的潜在靶点。很多研究表明，PP1γ具有促进细胞存活和增殖的能力。在有丝分裂后期，PP1γ可直接被募集到染色体上，并在染色体的正常分离和有丝分裂中发挥重要作用，干扰PP1γ可导致有丝分裂的失败和细胞凋亡。

技术实现要素：

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种PP1γ截短体，具有抗肿瘤的应用价值。本发明的另一目的是提供上述PP1γ截短体的表达载体。本发明还有一目的是提供上述PP1γ截短体的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

PP1γ截短体在制备抗肿瘤药物中的应用；所述的PP1γ截短体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

编码所述的PP1γ截短体的基因，其DNA序列如SEQ ID NO.2所示。

含有所述的PP1γ截短体的编码基因的DNA序列的载体。

所述的载体，将PP1γ截短体的DNA序列连接进PCMV-HA真核表达载体，构建出重组表达质粒。

有益效果：与现有技术相比，本发明利用生物工程技术，基因重组一段多肽对应的DNA序列到pcDNA3.1真核表达载体。经酶切和序列分析证明重组成功后，将此真核表达重组多肽转染到肿瘤细胞，免疫印迹证明多肽的蛋白表达，实现了多肽的重组。接着对多肽的抗肿瘤功能进行了研究，细胞学实验表明此多肽具有抑制肿瘤细胞存活和增殖的重要抗癌功能。为肿瘤治疗开发新的靶点提供实验依据，对于应用于肿瘤的临床治疗具有十分重要的开发应用前景。

附图说明

图1是检测多肽的表达结果图，大小为19KD；

图2是CCK-8实验检测多肽抑制Huh7细胞增殖结果图；

图3是EDU掺入实验测多肽阻滞HepG2细胞增殖结果图；

图4是EDU掺入实验柱状统计图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1 PP1γ多肽重组

提取人的mRNA，逆转录为cDNA，以cDNA为模板，设计相应上下游引物(5'-GCA AGC ATG TTA TAG CAG CCA TCG TGG A-3'和5'-CTA TTT CTT TGC TTG CTT TGT GGA GCT CGC-3')，应用PCR技术成功扩增出对应的cDNA编码序列，如SEQ ID NO.2所示，该序列所表达的PP1γ截短体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。将扩增得到的片段与载体连接，将连接产物转入感受态大肠杆菌DH5α中，在含Amp⁺琼脂平板上挑选克隆，以碱裂解法小提重组质粒后，以ECOR1酶切鉴定。

将含有多肽核酸片段的质粒经ECOR1酶切后，利用回收试剂盒获得该片段，同时用相同的酶处理质粒pcDNA3.1(约5kbp)，然后将回收多肽核酸片段和经酶切的载体pcDNA3.1在T4DNA连接酶作用下于16℃连接过夜。

将正确连接的多肽真核表达载体转染HepG2细胞，48小时后搜集样品，RIPA细胞裂解液裂解，免疫印迹结果证明了此多肽的表达，如图1所示。

实施例2 多肽抗肿瘤功能的检测

1)CCK-8实验证明多肽细胞水平的抗肿瘤效应

将肝癌细胞Huh7分别以20000个/孔的密度接种于96孔培养板，利用Lipofectamin 2000kit将35aa多肽真核表达载体和其它对照组瞬时转染HepG2和Huh7细胞，分别在0h、12h、24h、48h、72h后每孔加入10ul CCK-8溶液，2小时后，选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定不同时间点各孔光吸收值，记录结果。吸收值大小反映了细胞活性，根据实验数据，以时间为横坐标，吸收值为纵坐标做图。CCK-8结果显示与空载对照相比，多肽真核表达实验组显著抑制了Huh7细胞的增殖，如图2，说明多肽的过表达能有效地抑制细胞的增殖活性。

2)EDU掺入实验证明重组肽细胞水平的抗肿瘤效应

将HepG2分别以每孔4×10³～1×10⁵细胞接种于96孔板中，利用Lipofectamin 2000kit将多肽真核表达载体和其它对照组瞬时转染HepG2细胞，48h后进行EDU孵育(50nM)，2小时后弃培养基，而后通过细胞固定、Apollo染色、DNA染色后，进行观测统计，结果显示多肽真核表达实验组EdU阳性率明显降低，如图3、4，说明多肽的过表达能有效地抑制细胞的增殖活性，从而达到抗肿瘤效应。