本发明属于生物材料领域和创伤修复领域，具体涉及一种改性纳米羟基磷灰石/聚乙二醇复合水凝胶的制备方法。
背景技术：
水凝胶是由亲水性分子通过物理或者化学的方法交联而成的高分子三维网络结构，其具有溶胀性、生物相容性和生物可降解性。是介于固体和液体之间的弹性体。正是由于水凝胶具有三维网络结构，且含水率为70-90%左右，与关节软骨的含水量类似（含水量为70-80%），且水凝胶是和软骨结构类似的弹性体，且固含量低，降解产物较少，能够大大降低降解产物对人体的免疫反应；此外，水凝胶化学性质稳定、成型性好，因而被广泛的应用于关节软骨的修复。PEG水凝胶具有良好的生物相容性和抵制蛋白吸附的性能，被认为是一种非常有前景的人工软骨修复材料。
但是，单纯的聚乙二醇（PEG）水凝胶与软骨的力学强度具有一定的差异，因而需要对其进行改性以增强其强度。纳米羟基磷灰石（nHA）是人体骨的主要成分，具有优良的生物活性，能够诱导骨细胞的生长，目前已经作为骨修复材料应用到临床上。将纳米羟基磷灰石填充到PEG凝胶中能够显著增加纯PEG凝胶的的力学强度和生物活性。但是作为填料，nHA纳米粒子本身具有较高的极性和表面能，容易团聚且与PEG基体之间的相容性差。此外，nHA与PEG之间的界面结合力较差，一旦植入动物体内nHA与PEG基体的界面将先被破坏，nHA粒子很快从PEG基体中脱离出来，使复合水凝胶的强度迅速降低。因而，需要对nHA进行改性以增加其在PEG中的分散性。
技术实现要素：
为了解决nHA在PEG基体中分散性较差的问题，本发明提供一种改性纳米羟基磷灰石/聚乙二醇复合水凝胶的制备方法，在nHA的表面接枝了PEG分子，然后将改性过的nHA与PEG进行复合后制备了温敏性的PEG水凝胶。该方法制备得到的改性nHA有效的改善了nHA与PEG之间的相容性，提高了PEG的力学强度和生物活性。
为了解决上述问题，本发明采用以下技术方案：
一种改性纳米羟基磷灰石/聚乙二醇复合水凝胶的制备方法，步骤如下：
（1）将硅烷偶联剂接枝到纳米羟基磷灰石的表面，使其表面氨基化得到得到表面修饰了氨基的纳米羟基磷灰石（HA-NH2）；
（2）将干燥后的含有端羧基的聚乙二醇（PEG-COOH）溶解到二氯甲烷中，然后加入N,N'-羰基二咪唑，在0~4℃、无水的条件下对羧基进行活化0.5~2h，然后加入表面修饰了氨基的纳米羟基磷灰石（HA-NH2），常温下搅拌反应6~12h，反应结束后，对产物进行离心，洗涤，干燥，得到聚乙二醇改性的纳米羟基磷灰石（HA-PEG）；
（3）将多臂端氨基聚乙二醇溶解到水溶液中，然后加入聚乙二醇改性的纳米羟基磷灰石（HA-PEG），得到PEG/HA-PEG混合溶液，然后向混合液中加入京尼平，搅拌均匀后，置于37℃水浴中孵化直至其发生凝胶化转变得到改性纳米羟基磷灰石/PEG复合水凝胶。
所述步骤（1）的具体操作步骤如下：硅烷偶联剂在乙醇水溶液中充分水解0.5~2h，加入纳米羟基磷灰石反应6-8h，反应完成后离心回收固体物质，真空干燥后进行研磨、过筛，得到表面修饰了氨基的纳米羟基磷灰石；纳米羟基磷灰石与硅烷偶联剂的摩尔比为1:1~1.5，所述硅烷偶联剂为3-氨丙基三乙氧基硅烷、3-氨丙基三甲氧基硅烷或3-氨丙基甲基二乙氧基硅烷中的一种。
所述的步骤（2）中含有端羧基的聚乙二醇的含水率<50ppm。
所述的步骤（2）中含有端羧基的聚乙二醇与N,N'-羰基二咪唑的物质的量之比为1:2~4，含有端羧基的聚乙二醇与表面修饰了氨基的纳米羟基磷灰石的物质的量之比为1~3:1。
所述的步骤（3）中所用的多臂端氨基聚乙二醇为4臂或者8臂，且多臂端氨基PEG的分子量为2000-20000，质量浓度为5-10%。
所述的步骤（3）中聚乙二醇改性的纳米羟基磷灰石与多臂端氨基聚乙二醇的质量比为1~2.5:1。
所述的步骤（3）中京尼平占聚乙二醇改性的纳米羟基磷灰石和多臂端氨基聚乙二醇总质量的1-5%。
本发明的有益效果：1、本发明通过在nHA的表面接枝了PEG分子，改善了nHA与PEG之间的相容性，有效的解决了nHA在PEG水凝胶中易团聚的问题，提高了PEG水凝胶的力学性能；2、本发明所制备的为温敏性的PEG水凝胶，且所使用的交联剂京尼平为天然提取物，对人体无毒，且不会产生残留；3、本发明的所有反应均在常温下进行，反应条件较为温和，操作简便，缩短了反应的时间，有利于工业化的生产。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围，该领域的技术熟练人员可以根据上述发明的内容作出一些非本质的改进和调整。
实施例1
本实施例的改性纳米羟基磷灰石/聚乙二醇复合水凝胶的制备方法，步骤如下：
（1）将1mL3-氨丙基三乙氧基硅烷（0.004mol）（上海晶纯试剂有限公司）偶联剂加入到100mL乙醇与水的混合溶液中室温条件下水解0.5h，然后将2.1g（0.004mol）羟基磷灰石（上海晶纯试剂有限公司）加入到混合溶液中室温条件下搅拌反应8h（转速800rpm），然后将反应后的产物进行离心分离、干燥，将干燥后的产物用乙醇进行洗涤、真空干燥，得到表面带有氨基的羟基磷灰石将硅烷偶联剂接枝到纳米羟基磷灰石的表面，使其表面氨基化（HA-NH2）；
（2）将1g（0.016mol）干燥后的（含水率30ppm）含有端羧基的聚乙二醇（PEG-COOH）（苏州岸谷纳米技术有限公司）溶解到100mL二氯甲烷中，然后向溶液中加入5.22g （0.032mol）N,N'-羰基二咪唑（上海晶纯试剂有限公司），对羧基进行活化0.5h（活化温度0℃，搅拌速度300rpm），得到羧基活化后的PEG-COOH溶液，然后向PEG-COOH溶液中加入8.03g（0.016mol）HA-NH2，常温下搅拌反应6h，反应结束后，对产物进行离心，洗涤，干燥，得到PEG改性的纳米羟基磷灰石（HA-PEG）；
（3）将分子量为2000的10g 4臂端氨基PEG溶解到100mL水中（10%），然后加入10g HA-PEG，得到PEG/HA-PEG混合溶液，然后向混合液中加入0.2g京尼平（1%），搅拌均匀后，置于37℃水浴中孵化直至其发生凝胶化转变即得到改性纳米羟基磷灰石/PEG复合水凝胶。
实施例2
本实施例的改性纳米羟基磷灰石/聚乙二醇复合水凝胶的制备方法，步骤如下：
（1）将硅烷偶联剂接枝到纳米羟基磷灰石的表面，使其表面氨基化，得到表面修饰了氨基的纳米羟基磷灰石（HA-NH2）；
（2）将1g（0.016mol）干燥后的（含水率30ppm）含有端羧基的聚乙二醇（PEG-COOH）溶解到100mL二氯甲烷中，然后向溶液中加入10.44g（0.064mol） N,N'-羰基二咪唑，对羧基进行活化2h（活化温度4℃，搅拌速度300rpm），得到羧基活化后的PEG-COOH溶液，然后向PEG-COOH溶液中加入4.01g（0.008mol） HA-NH2，常温下搅拌反应12h，反应结束后，对产物进行离心，洗涤，干燥，得到PEG改性的纳米羟基磷灰石（HA-PEG）；
（3）将分子量为20000的10g 8臂端氨基PEG溶解到200ml水中（5%），然后加入25g HA-PEG，得到PEG/HA-PEG混合溶液，然后向混合液中加入1.75g京尼平（5%），搅拌均匀后，置于37℃水浴中孵化直至其发生凝胶化转变即得到改性纳米羟基磷灰石/PEG复合水凝胶。
实施例3
本实施例的改性纳米羟基磷灰石/聚乙二醇复合水凝胶的制备方法，步骤如下：
（1）将硅烷偶联剂接枝到纳米羟基磷灰石的表面，使其表面氨基化，得到表面修饰了氨基的纳米羟基磷灰石（HA-NH2）；
（2）将1g（0.016mol）干燥后的（含水率30ppm）含有端羧基的聚乙二醇（PEG-COOH）溶解到100mL二氯甲烷中，然后向溶液中加入7.83g （0.048mol）N,N'-羰基二咪唑，对羧基进行活化1h（活化温度4℃，搅拌速度300rpm），得到羧基活化后的PEG-COOH溶液，然后向PEG-COOH溶液中加入2.67g （0.0053mol）HA-NH2，常温下搅拌反应12h，反应结束后，对产物进行离心，洗涤，干燥，得到PEG改性的纳米羟基磷灰石（HA-PEG）；
（3）将分子量为10000的10g 4臂端氨基PEG溶解到150mL水中（6.7%），然后加入15g HA-PEG，得到PEG/HA-PEG混合溶液，然后向混合液中加入0.75g京尼平（3%），搅拌均匀后，置于37℃水浴中孵化直至其发生凝胶化转变即得到改性纳米羟基磷灰石/PEG复合水凝胶。
实施例4
本实施例的改性纳米羟基磷灰石/聚乙二醇复合水凝胶的制备方法，步骤如下：
（1）将硅烷偶联剂接枝到纳米羟基磷灰石的表面，使其表面氨基化, 得到表面修饰了氨基的纳米羟基磷灰石（HA-NH2）；
（2）将1g（0.016mol）干燥后的（含水率30ppm）含有端羧基的聚乙二醇（PEG-COOH）溶解到100mL二氯甲烷中，然后向溶液中加入5.22g （0.032mol）N,N'-羰基二咪唑，对羧基进行活化0.5h（活化温度4℃，搅拌速度300rpm），得到羧基活化后的PEG-COOH溶液，然后向PEG-COOH溶液中加入4.01g（0.008mol） HA-NH2，常温下搅拌反应10h，反应结束后，对产物进行离心，洗涤，干燥，得到PEG改性的纳米羟基磷灰石（HA-PEG）；
（3）将分子量为20000的10g 8臂端氨基PEG溶解到100mL水中（10%），然后加入10g HA-PEG，得到PEG/HA-PEG混合溶液，然后向混合液中加入0.8g京尼平（4%），搅拌均匀后，置于37℃水浴中孵化直至其发生凝胶化转变即得到改性纳米羟基磷灰石/PEG复合水凝胶。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。