本发明属于生物菌肥技术领域，具体涉及一种铁皮石斛的复合菌剂。
背景技术：
铁皮石斛是兰科石斛属多年生附生植物，在医药领域的研究与开发方面应用广泛。现代医学研究表明，铁皮石斛具有滋肺清热、滋阴养胃、清肝明目、抵抗癌症、降低血糖等药用功效。作为养生保健的极品，铁皮石斛被历代医学家所推崇。
目前由于铁皮石斛的自然繁殖率低，对环境条件要求较严格，产区药农长期采挖等因素导致自然资源已濒临灭绝。而铁皮石斛又因为种子微小，没有胚乳，因此自然条件下不利于获得大批量铁皮石斛幼苗。当前，石斛组织培养体系已成功建立，可大量繁殖石斛无性苗，但无性苗移栽成活率低、生长缓慢、生长周期长等问题。
技术实现要素：
解决上述技术问题，本发明提出了一种铁皮石斛的复合菌剂，采用铁皮石斛菌根真菌与根内放线菌协同作用促进其无性苗生长，即放线菌兰斯基链霉菌（Streptomyces krainskii）与菌根真菌瘤菌根菌属（Epulorhiza sp.）和胶膜菌属（Tulasnella sp.）协同促进铁皮石斛无性苗生长。
其技术方案为：
一种铁皮石斛的复合菌剂，
（1）根内放线菌的分离纯化：
A．选取健康新鲜铁皮石斛营养根系，将根样用纱布包好经流动自来水冲洗干净；
B．置于75%乙醇中消毒20s，无菌水冲洗2-3次，再用0.1%升汞溶液消毒20s，无菌水冲洗4-5次，使用灭菌滤纸将根样表面水分吸干；
C．设置空白对照试验，即用消毒完的根样置于高氏一号培养基上滚动数次；
D．将表面已消毒根样，置于超净工作台中研磨成匀浆，微波处理30S，混匀后分别稀释成10-1、10-2、10-3根样稀释液，分别接种于高氏一号、TWYE、YIM38#三种培养基平板中，置于28℃恒温培养箱中倒置培养7-15天；
E．对照培养基若无菌落生成，则表明根样表面消毒合格，将分离出的放线菌菌落挑出，多次纯化，得到放线菌菌株，置于4℃冰箱中保存备用；
（2）拮抗放线菌的筛选：
A．采用平板对峙法，将供试铁皮石斛病原真菌极细链格孢菌、砖红镰孢菌、层出镰孢菌、灰葡萄孢菌、齐整小核菌接种于PDA培养基中，28℃恒温培养5天，打取直径5mm的病原菌菌块接种于高氏一号培养皿中央，在同一水平线上，与病原菌同等距离的位置两侧，接种同等大小的放线菌菌块，每个处理重复3次实验；
B．以培养皿中央只接种病原真菌，两侧不接种放线菌为对照，每个处理重复3次，待对照病原真菌长满培养皿，测定放线菌对5种病原真菌的抑制率，筛选对病原真菌具有明显拮抗作用的放线菌菌株；
（3）促生菌根真菌的放线菌筛选：
A．将上述筛选出的促生放线菌分别与两种供试铁皮石斛促生菌根真菌瘤菌根菌属和胶膜菌属，在高氏一号培养基中进行平板对峙试验，每个处理重复3次实验；
B．以培养皿中央只接种菌根真菌为对照，每个处理同样重复3次，待对照菌根真菌长满培养皿，测定放线菌对菌根真菌抑制率，筛选出对铁皮石斛菌根真菌具有明显促生作用的放线菌；
（4）促生放线菌种属地位确定：
采用分区划线法、插片法观察上述筛选出的放线菌的形态显微结构特征，采用16S rDNA PCR扩增分析，鉴定促生放线菌为克兰斯基链霉菌；
（5）优化菌根真菌协同放线菌促进铁皮石斛无性苗生长的复合菌剂：
A．选取4个月苗龄的铁皮石斛无性苗，接种于Harvaris培养基中，培养15天；
B．将促生放线菌克兰斯基链霉菌与供试铁皮石斛促生菌根真菌瘤菌根菌属和胶膜菌属按照1:1:1的比例接种在无污染的健康无性苗中进行共生培养，培养60天。
本发明利用铁皮石斛菌根真菌协同其根内放线菌得到的复合菌剂，能够刺激铁皮石斛细胞产生高效的防御能力，增强铁皮石斛自身修复、抗病性、抵抗极端环境及提高其无性苗成活率能力，促进铁皮石斛无性苗的生长，为规模化生产优质铁皮石斛种苗提供技术支持。
具体实施方式
1、根内放线菌的分离纯化
（1）选取健康新鲜铁皮石斛营养根系，将根样用纱布包好经流动自来水冲洗干净。
（2）置于75%乙醇中消毒20s，无菌水冲洗2-3次,再用0.1%升汞溶液消毒20s，无菌水冲洗4-5次，使用灭菌滤纸将根样表面水分吸干。
（3）设置空白对照试验，即用消毒完的根样置于高氏一号培养基上滚动数次。
（4）将表面已消毒根样，置于超净工作台中研磨成匀浆，微波处理30S。因为分离的是内生放线菌，而根系放线菌比较难分离，所以必须充分研磨，以增加内生放线菌的分离种类；适度微波处理可能会促进放线菌孢子的萌发，使部分难分离放线菌的孢子在接受了一定量的微波辐射后萌发，转化为可培养的放线菌，增加可培养放线菌的种类和数量。
（5）混匀后分别稀释成10-1、10-2、10-3根样稀释液，分别接种于高氏一号、TWYE、YIM38#三种培养基平板中。梯度稀释就是为了减少浓度，减少分离难度。三种培养基一般都是分离放线菌用的，而每种培养基针对的放线菌菌群又稍有不同，因此三种培养基的结合使用就是为了增加分离放线菌的种类。
（6）置于28℃恒温培养箱中倒置培养7-15天，对照培养基若无菌落生成，则表明根样表面消毒合格。
（7）将分离出的放线菌菌落挑出，经过多次纯化后，共分离得到12株放线菌菌株，置于4℃冰箱中保存备用。
2、拮抗放线菌的筛选
（1）采用平板对峙法，将供试铁皮石斛病原真菌黑斑病的极细链格孢Alternaria tenuissima、茎腐病的砖红镰孢菌Fusarium incarnatum及层出镰孢菌Fusarium proliferatum、灰霉病的灰葡萄孢菌Botrytis cinerea及白绢病的齐整小核菌sclerotium rolfsii接种于PDA培养基中，28℃恒温培养5d，打取直径5mm的病原菌菌块接种于高氏一号培养皿中央，在同一水平线上，在距离病原菌同等距离的位置两侧，接种同等大小的放线菌菌块，每个处理重复三次实验。
（2）以培养皿中央只接种病原真菌，两侧不接种放线菌为对照，每个处理重复3次，待对照病原真菌长满培养皿，测定12株放线菌对5种病原真菌的抑制率，从而筛选对病原真菌具有明显拮抗作用的4株放线菌菌株。
选取的这些病原真菌，全是铁皮石斛常见病原真菌。 极细链格孢Alternaria tenuissima铁皮石斛黑斑病的病原真菌，砖红镰孢菌Fusarium incarnatum及层出镰孢菌Fusarium proliferatum是铁皮石斛茎腐病的病原真菌，灰葡萄孢菌Botrytis cinerea是铁皮石斛灰霉病的病原真菌，齐整小核菌sclerotium rolfsii是铁皮石斛白绢病的病原真菌。选取这些铁皮石斛常见病原真菌目的是为了筛选抵抗铁皮石斛病原真菌的放线菌。
3、促生菌根真菌的放线菌筛选
将上述筛选出的4株促生放线菌分别与两种命名为S1、S2的供试铁皮石斛促生菌根真菌瘤菌根菌属（Epulorhiza sp.）和胶膜菌属（Tulasnella sp.），在高氏一号培养基中进行平板对峙试验，每个处理重复3次实验。以培养皿中央只接种菌根真菌为对照，每个处理同样重复3次，待对照菌根真菌长满培养皿，测定放线菌对菌根真菌抑制率。从而筛选出对铁皮石斛菌根真菌具有明显促生作用的放线菌1株，命名为X。
4、促生放线菌种属地位确定
（1）对上述筛选出的对菌根真菌具有促生作用的1株放线菌进行种属地位鉴定。
（2）采用分区划线法、插片法观察放线菌的形态显微结构特征。同样采用16S rDNA PCR扩增分析，鉴定促生放线菌X为克兰斯基链霉菌（Streptomyces krainskii）。
5、优化菌根真菌协同放线菌促进铁皮石斛无性苗生长的复合菌剂
（1）选取4个月苗龄的铁皮石斛无性苗，接种于Harvaris培养基中，培养15天。
（2）将促生放线菌克兰斯基链霉菌（Streptomyces krainskii）与供试促生菌根真菌S1、S2按照下表配比接种在无污染的健康无性苗中进行共生培养，对照接入无菌同等大小琼脂块。共培养60天后，通过测定无性苗鲜重、干重、株高、茎粗、分蘖、生根数等生长指标，优化出最佳菌种配比。
（3）结果研究出放线菌克兰斯基链霉菌（Streptomyces krainskii）与菌根真菌瘤菌根菌属（Epulorhiza sp.）、胶膜菌属（Tulasnella sp.）共同接种于无性苗根系，与对照试验相比，对铁皮石斛无性苗的促生作用最显著。