本发明属于生物
技术领域：
，特别是涉及一种嗜热酮还原酶突变体及其应用。
背景技术：
：(S)-N-Boc-3-哌啶醇可以用于合成一种非天然药物抗充血性心力衰竭药卡莫瑞林、BTK抑制剂ibrurinib、天然物质异白刺碄淋胺和小白果刺碱等药物前体，市场需求量较高，因此该类化合物具有广泛的应用前景。(S)-N-Boc-3-哌啶醇可以由N-Boc-3-哌啶酮不对称还原制备，引入手性中心。手性醇的传统合成方法有化学还原和生物还原。利用化学催化方法可实现这一过程，然而反应效率较低，条件苛刻，且产生的三废也较多，没有能够实现工业化应用。生物催化方法反应条件温和，绿色无污染，立体选择性专一，具有推广的潜力。生物学上，手性产物的生成可经过化学与酶的催化，不对称还原，多步反应合成。其中，生物催化的不对称还原在理论上说，在温和的条件下可以使产物对映选择性达到99％。目前越来越多的药物或其中间体是通过一种生物酶催化合成的方式，而非化学合成。很明显，酶催化相比于传统的化学合成有极大的优势：1，生物反应中可避免有毒的反应试剂或溶剂；2，酶具有高效率、底物特异性等特点；3，避免了包括消旋化等在内的副反应。利用生物转化实现还原产生手性醇的技术已比较成熟，然而文献检索可知，只有一个利用胡萝卜整细胞催化该还原反应的实例，所用催化剂占底物质量的约20％，来源不稳定且热稳定性不高。植物细胞反应中含有各种复杂成分，对下游提取加大难度。更重要的是，该反应底物浓度较低(3.3mM)，酶活力极低只有0.05U/mg，产物光学纯度有98％，且不具备实际工业应用价值。很多的文献和专利中都报道了关于酮还原酶催化还原含酮基底物生成羟基化的产物，使反应变得高效率，具有底物特异性或旋光纯选择性等优势。例如，有些研究是从赭色掷孢酵母提取出一种酮还原酶催化对取代乙酰苯(Cl-，Br-，Me-，OMe-，MeC3，CF3-等)，旋光选择性极低，需要通过理性设计突变位点，定点突变将其氨基酸序列中242位的甲硫氨酸以亮氨酸取代，氨基酸序列中245位的谷氨酰胺以脯氨酸取代，组成有效的双突变体酶。该突变体酶在原条件下催化具有各种取代基的对取代乙酰苯，使生成的产物构型由R-转变为S-，同时使原S-产物的ee值提高至99％。这一成果具有极高的价值。也有相关研究如：提取于橘青霉的酮脂还原酶(ker)，用于催化4-溴-3-氧基丁酸生成高纯度的(S-)-4-溴-3-羟基丁酸，酶活稳定性低，一般在30℃热浴6h后酶活降低到初始酶活的15％。为了提高稳定性，易错聚合酶链式反应随机突变，然后对突变体进行高通量的筛选，最终获得热稳定性提高的单突变体，它们分别是在其特定氨基酸序列中54位的亮氨酸被谷氨酰胺取代成的单突变体，氨基酸序列中245位的精氨酸被赖氨酸取代成的单突变体，和氨基酸序列中271位置的天冬酰胺被天冬氨酸取代成的单突变体酶，尤其是氨基酸序列中54位的亮氨酸被谷氨酰胺取代的突变体酶在30℃热浴6h后，活性提高到初始酶活的62％，突变后的效果非常显著。技术实现要素：本发明提供了一种嗜热酮还原酶突变体及其应用，该嗜热酮还原酶突变体具有很好催化合成(S)-N-Boc-3-哌啶醇的活力，具有良好的工业应用前景。野生型嗜热酮还原酶(GeneBank号为WP_004082270.1)来源于海栖热袍菌(Thermotogamaritime)，但野生型嗜热酮还原酶催化N-Boc-3-哌啶酮获得(S)-N-Boc-3-哌啶醇的活性较弱，且产物中S型N-Boc-3-哌啶醇对映体过量(ee值)为98.5％，还有少量的R型N-Boc-3-哌啶醇，所以还不具备实际工业应用价值。如果能够通过基因工程改造，提高其酶活性以及产物光学纯度(ee值)，则其具备相应的工业应用价值。一种嗜热酮还原酶突变体，由氨基酸序列如SEQIDNO：1所示的嗜热酮还原酶第21位色氨酸突变为半胱氨酸或谷氨酸，和/或第86位色氨酸突变为丙氨酸、亮氨酸或缬氨酸得到。通过对野生型嗜热酮还原酶的活性区域理性设计，对多个位点进行定点饱和突变，再表达纯化后进行酶活及产物ee值的检测，最终筛选得到第21位色氨酸突变为半胱氨酸或谷氨酸，或第86位色氨酸突变为丙氨酸、亮氨酸或缬氨酸，所得单点突变的酶，酶活获得成倍的增长，且酶催化反应的产物ee值也有所提高。更进一步的，同时将第21位的突变和第86位的突变引入嗜热酮还原酶，所得双突变中，第21位色氨酸突变为半胱氨酸或谷氨酸，同时第86位色氨酸突变为丙氨酸、亮氨酸或缬氨酸，组合后产生的6种双突变酶，经检测酶活能够提高10倍左右，且酶催化反应的产物ee值也都达到99％以上，最高的甚至达到99.8％。所述突变后的氨基酸序列如SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6、SEQIDNO：7、SEQIDNO：8所示。本发明又提供了编码所述嗜热酮还原酶突变体的基因。本发明又提供了包含所述基因的表达盒。本发明还提供了包含所述基因的重组表达载体。本发明还提供了包含所述重组表达载体的基因工程菌。本发明还提供了所述嗜热酮还原酶突变体在催化N-Boc-3-哌啶酮获得(S)-N-Boc-3-哌啶醇中的应用。本发明嗜热酮还原酶突变体与野生型酶相比，催化N-Boc-3-哌啶酮获得(S)-N-Boc-3-哌啶醇的酶活得到了大量提高，特别是双突变时，能够提高10倍左右，且催化反应产物的旋光选择性也有所增长，最高能够达到99.8％，具备良好的工业应用前景。附图说明图1为嗜热酮还原酶突变体催化N-Boc-3-哌啶酮获得(S)-N-Boc-3-哌啶醇的反应原理图；图2为嗜热酮还原酶突变体W86A的催化反应产物的HPLC检测结果图。具体实施方式实施例1野生型嗜热酮还原酶(GeneBank号为WP_004082270.1)，但野生型嗜热酮还原酶的酶活较低，且ee(S)值较低，不能很好地满足工业应用的要求。野生型嗜热酮还原酶序列如SEQIDNO：1所示，以含有该野生型嗜热酮还原酶基因(核苷酸序列如SEQIDNO：2所示)的pET-28a重组质粒为模板，将点W21，W86进行定点饱和突变。因此利用oligo7软件设计平末端引物，后进行PCR定点突变，引物如表1所示，其中W21-R和W86-R为反向引物，其余均为正向引物，其中每个位点的反向引物相同，正向引物中前三个碱基为突变位点。本次PCR突变采用KOD-Plus-NeoDNA聚合酶试剂盒(东洋纺科技有限公司，上海)。表1引物序列。反应体系如下表：PCR循环过程：将PCR产物回收，50μl的体系里加入DpnⅠ(1μl)，保持37℃，1.5h，用以消化模板DNA，然后以琼脂糖(1％)凝胶电泳检测其是否定点突变完成。在保证琼脂糖凝胶上跑出明显条带后，PCRcleaning试剂盒(购买于捷瑞生物工程有限公司，上海)清洗后进行PNK连接。PNK激酶(捷瑞生物工程有限公司，上海)连接体系为：连接缓冲液5μlPNK1μlPCRcleaning10μl，混合均匀后，放置于PCR仪里16℃，1.5h后，可完成连接。连接产物转化大肠杆菌，平板培养后，挑选长出的单克隆送测序，验证序列正确，得到了突变体质粒。实施例21、嗜热酮还原酶及其突变体的表达将实施例1得到的突变体质粒转化到大肠杆菌JM109(DE3)感受态细胞中，然后涂板、培养，10h后观察菌生长状况，挑取重组转化子活化，并扩大培养。(1)将重组转化子接种于装有5ml含卡那霉素(50μg/ml)的LB培养基中，置于37℃、200rpm摇床中震荡培养，至OD600达到0.4～0.5左右，获得种子液。(2)将种子液以1％的接种量接种于自诱导培养基中，25℃培养48小时。自诱导培养基配方为：阿拉伯糖3g/L，葡萄糖0.5g/L，甘油5g/L，蛋白胨10g/L，磷酸盐6.8g/L，硫酸盐1.2g/L，NH4Cl2.65g/L，MgSO40.98g/L，CaCl20.1g/L。将菌液以超声波破碎，离心后获得上清，即为各突变体相应的酶液。实施例3蛋白定量检测及各突变体酶活检测。根据文献(WoongKim,EricJ.Bennett,EdwardL.Huttlin,AilanGuo,JingLi,AnthonyPossemato(2011).44,2,325–340.)方法测定各体变体酶液蛋白浓度。嗜热酮还原酶突变体催化N-Boc-3-哌啶酮获得(S)-N-Boc-3-哌啶醇的反应原理如图1所示。设计以下反应体系测各突变体的酶活力。反应体系(2ml)：1.9ml50mMpH7.0的PBS中，加入Boc-3-哌啶酮20mg，嗜热酮还原酶或突变体0.5mg，NADPH10mg。37℃，摇床反应0.5小时后，加入2ml乙酸乙酯萃取后离心，进行HPLC液相分析。每个样品做三个平行。液相条件：OD-H柱(25cm)，正己烷：异丙醇＝92∶8，1ml/min，检测波长：210nm。有益突变体的筛选标准为：1，突变体催化能力高于野生型；2，ee值不低于98％。各突变体酶活力如下：表2单突变体筛选。在保证突变体酶的ee值和野生型相当，且催化能力高于野生型的前提下，选出如下单突变体：W21E，W21C，W86L，W86V，W86A。其中突变体W86A的催化反应产物，HPLC检测结果如图2所示。实施例4在第一轮单点突变筛选的基础上，进一步优化组合双突变，使获得更有效的突变体。将W21C、W21E分别与W86L、W86V、W86A组成双突变(点突变方法同实施例1)，构建双突变体文库，转化到大肠杆菌JM109(DE3)中培养，挑菌，活化，表达蛋白，进行液相检测(方法同上)，筛选出活力增高且ee值稳定的双突变体，步骤如上实施例1-3所述。测得产物ee值和酶活为如下表：表3双突变体筛选。突变体酶活(U/mg)ee(S)值(％)WT3.198.5W21E/W86L23.599.5W21E/W86A28.499.3W21E/W86V32.799.7W21C/W86L29.699.8W21C/W86A33.199.4W21C/W86V30.999.0实验结果所示，双突变体酶W21E/W86L、W21E/W86A、W21E/W86V、W21C/W86L、W21C/W86A、W21C/W86V的催化能力高于野生型约10倍，且ee值不低于99％。SEQUENCELISTING<110>杭州酶易生物技术有限公司<120>一种嗜热酮还原酶突变体及其应用<130><160>48<170>PatentInversion3.3<210>1<211>274<212>PRT<213>海栖热袍菌（Thermotogamaritima）<400>1MetLeuTyrLysGluLeuGlyArgThrGlyGluGluIleProAlaLeu151015GlyLeuGlyThrTrpGlyIleGlyGlyPheGluThrProAspTyrSer202530ArgAspGluGluMetValGluLeuLeuLysThrAlaIleLysMetGly354045TyrThrHisIleAspThrAlaGluTyrTyrGlyGlyGlyHisThrGlu505560GluLeuIleGlyLysAlaIleLysAspPheArgArgGluAspLeuPhe65707580IleValSerLysValTrpProThrHisLeuArgArgAspAspLeuLeu859095ArgSerLeuGluAsnThrLeuLysArgLeuAspThrAspTyrValAsp100105110LeuTyrLeuIleHisTrpProAsnProGluIleProLeuGluGluThr115120125LeuSerAlaMetAlaGluGlyValArgGlnGlyLeuIleArgTyrIle130135140GlyValSerAsnPheAspArgArgLeuLeuGluGluAlaIleSerLys145150155160SerGlnGluProIleValCysAspGlnValLysTyrAsnIleGluAsp165170175ArgAspProGluArgAspGly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