一种检测人巨噬细胞钙激活钾通道核酸的荧光定量PCR引物、探针及试剂盒的制作方法

本发明涉及人巨噬细胞钙激活钾通道核酸的荧光定量PCR检测试剂和检测方法。

背景技术：

冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)是危害人类健康的严重心血管疾病之一，经皮冠状动脉支架置入术已经成为治疗冠心病的常规手段。冠心病介入治疗经历从经皮冠脉成形术、裸金属支架、及药物涂层支架(DES)的变革，但仍有10％～20％支架内再狭窄率以及晚期支架血栓，成为制约DES置入术后临床效果的重要因素，是目前冠心病介入支架治疗后面临的严峻问题。

支架内新生动脉粥样硬化(In-Stent Neoatherosclerosis,ISNA)是具有或不具有坏死核心的新生内膜内富含脂质的泡沫巨噬细胞簇。DES及BMS置入后，血管内超声发现新生内膜增殖、钙化及坏死，且支架置入时间越长，新生内膜中坏死及钙化的成分越多。分辨率达到微米水平的光学干涉断层成像技术证据及尸检结果显示ISNA是DES置入后支架内再狭窄及晚期支架内血栓的重要原因，即支架治疗失败的共同路径。

内膜损伤所致炎症反应导致支架内再狭窄，在动脉粥样斑块旋切术患者中，斑块中巨噬细胞浸润及血液中单核细胞活化状态与再狭窄相关，病理发现大量的炎症细胞聚集在斑块内，主要是巨噬细胞、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞；在兔、猪球囊损伤模型中，早期单核细胞从管腔浸润至血管损伤局部血栓内。DES置入时血管内膜在球囊及支架作用下遭受破坏，触发损伤修复急性炎症反应；斑块挤破后释放大量组织因子，激活凝血酶，进而激活血小板并释放大量活性物质及炎性因子，中性粒细胞及单核细胞游走并浸润于内膜下形成巨噬细胞。以巨噬细胞为主导的炎症反应促进中膜平滑肌细胞迁移，同时损伤处的血栓为平滑肌细胞增殖提供了一个可吸收的载体。

钙激活钾通道(KCa通道)属于化学门控型的钾通道家族成员之一，其门控行为受细胞内钙离子浓度和膜电位的控制，KCa3.1属于中电导型钙激活钾通道，在可兴奋细胞及非可兴奋细胞膜上都有分布，TRAM-34为其特异性阻断剂。KCa3.1参与细胞分泌、细胞周期调控、细胞迁移和增殖等多种生理活动。免疫细胞中，KCa3.1的主要功能是通过调节膜电位及钙信号来调节免疫细胞的激活、增殖等许多钙依赖性的生理活动。

人巨噬细胞功能恶化，可引起心脏冠状动脉粥样硬化，尤其是冠状动脉血管支架植入后，支架内动脉粥样斑块形成。冠状动脉粥样硬化斑块检测已有实验诊断技术主要包括：1)血管造影，此技术包括DSA数字造影仪器，需要使用造影剂；2)血管内超声检测，为有创伤检测；3)光学相干断层扫描成像检测为有创伤检测。现有诊断方法需要技术难度大和费用高，均需要在X线下操作，对患者和医疗人员均有伤害。

技术实现要素：

为了解决现有临床影像学检查技术要求高与有创性，以及现有分子诊断技术不足，本研究发明提供一种快速、特异性强、灵敏性高、适合临床使用的定量PCR检测重要核酸的引物、探针及试剂盒。

本发明的原理和核心的技术关键是科学地设计扩增和检测巨噬细胞钙激活钾通道的特异、高效的引物、探针。在确保设计的引物高效扩增巨噬细胞钙激活钾通道、特异检测巨噬细胞钙激活钾通道核酸的表达，确保引物不扩增和检测其它类似的通道。

本发明还公开了人巨噬细胞钙激活钾通道的荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒由下列组成：包括2倍qPCR反应液25ul，以及25ul的2倍Oligo混合物(含2μM的上游引物、2μM的下游引物、1μM的探针)。

所述引物为：

上游引物：5’-CTTGCTGGAGCAGGAGAAGT-3’(SEQ ID No.1)；

下游引物：5’-GCTGGACCTCTTTGGCATGA-3’(SEQ ID No.2)；

探针：5’-荧光发光基团-CACTGGTGCTGGCAGGAACTGG-荧光淬灭基团-3’(SEQ ID No.3)；

上述探针中，荧光发光基团优选FAM、VIC、TET、CY3、CY5、HEX、JOE、ROX中的一种；荧光淬灭基团优选TAMRA、DABCYL、NFQ中的一种。本发明进一步提供了巨噬细胞钙激活钾通道检测方法，该方法包括以下步骤：

(1)外周血提取单核细胞，常规培养后，提取基因组：采用Quiagen公司DNA提取试剂盒进行；

(2)2x qPCR stock(Modified DNA polymerase、SYBR Green I、Optimized PCR buffer、5mM MgCI₂、dNTP mix including dUTP)25ul、1对特异性引物和探针(由Invitrogen公司合成)。扩增条件为：50℃ 2分钟，95℃ 10分钟，95℃ 15秒，56℃ 1分钟，40个循环。

巨噬细胞定量PCR灵敏度的确定：由Intergated DNA Technology合成钙激活钾通道及相关通道的rRNA的序列。依据合成物的分子量和绝对重量以及PicoGreen的DNA定量技术，计算合成物所含的rRNA的基因拷贝的绝对数目。随后，对合成物进行稀释，制备每10ul合成物的稀释试剂10000拷贝、1000拷贝、100拷贝、10拷贝的rRNA。用上述的PCR系统扩增含不同浓度rRNA的巨噬细胞钙激活钾通道基因，依次确定本发明检测巨噬细胞钙激活钾通道的灵敏度。结果显示，此发明可以扩增反应系统中10个拷贝的钙激活钾通道rRNA。

本发明目的在于提供一种灵敏度和特异度更高且快速简便的通过检测钙激活钾通道基因拷贝数，用来筛选冠心病患者支架内再狭窄的实时荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒适用于目前市场上所有类型荧光定量PCR扩增仪。本发明能够检测患者巨噬细胞钙激活钾通道的表达水平，判断患者炎症巨噬细胞功能是否正常，在临床心血管疾病检验领域有良好的应用前景。

本发明与现有技术相比较，其优点表现在：本发明建立了快速鉴别人外周血钙激活钾通道的检测试剂盒及其方法，本试剂盒根据人外周血基因序列特点设计了引物。本发明建立的鉴别诊断技术，特异性强，有很高的灵敏度，可用于人外周血巨噬细胞功能的鉴别诊断。

本发明方法简单，检测时间短，检测结果准确可靠，易于判定结果，便于在医院和实验室推广应用。

附图说明

图1、巨噬细胞钙激活钾通道基因的实时PCR扩增曲线。

图2、是巨噬细胞钙激活钾通道的电泳图，其中M为DL100标准分子量Marker，第1泳道为阴性对照，第2、3泳道为阳性巨噬细胞钙激活钾通道。

具体实施方法

下列实例进一步说明本发明，但不应当当作对本发明的限制。

按照下列配方制作快速鉴别钙激活钾通道的检测试剂盒：

(1)制备PCR用的标准定量试剂。由Intergated DNA Technology合成巨噬细胞钙激活钾通道的核酸序列，此序列涵盖PCR的扩增区域。依据合成物的分子量和绝对重量以及PicoGreen的DNA定量技术，计算合成物所含的rRNA的基因拷贝的绝对数目。随后，对合成物进行稀释，制备每10ul合成物的稀释试剂10000拷贝、1000拷贝、100拷贝、10拷贝的rRNA。作为PCR用的标准定量试剂。

(2)外周血提取单核细胞，常规培养后，提取基因组：采用Quiagen公司DNA提取试剂盒进行；

(3)2x qPCR stock(Modified DNA polymerase、SYBR Green I、Optimized PCR buffer、5mM MgCI₂、dNTP mix including dUTP)25ul、1对特异性引物和探针(由Invitrogen公司合成)。

上游引物：5’-CTTGCTGGAGCAGGAGAAGT-3’(SEQ ID No.1)；

下游引物：5’-GCTGGACCTCTTTGGCATGA-3’(SEQ ID No.2)；

探针：5’-荧光发光基团-CACTGGTGCTGGCAGGAACTGG-荧光淬灭基团-3’；

扩增条件为：50℃ 2分钟，95℃ 10分钟，95℃ 15秒，56℃ 1分钟，40个循环。扩增曲线见图1。

(4)电泳鉴定：如图2所示，巨噬细胞钙激活钾通道出现大小约为206bp的条带(第2、3泳道)，而阴性对照组为扩增出条带(第1泳道)。

SEQUENCE LISTING

<110> 代民, 张

<120> 一种检测人巨噬细胞钙激活钾通道核酸的荧光定量PCR引物、探针及试剂盒

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cttgctggag caggagaagt 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gctggacctc tttggcatga 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cactggtgct ggcaggaact gg 22