一种抗小鼠RCN3蛋白单克隆ScFv抗体及其淘选方法与流程

本发明属于生物技术领域，涉及一种抗体及抗体药物的开发和生产，具体涉及一种抗小鼠RCN3蛋白单克隆ScFv抗体及其淘选方法，抗小鼠RCN3蛋白抗体的序列及真核表达与抗原检测的方法。

背景技术：

小鼠RCN3是一个单拷贝基因，基因序列号为BC055903，位于小鼠的7号染色体上，含有7个外显子，编码328个氨基酸。研究表明，RCN3蛋白位于小鼠内质网分泌途径，含有6个EF-hand结构域的内质网钙离子结合蛋白，与肺I型和II型蛋白增值相关。人工敲除该基因的基因缺失纯合体小鼠在生产后会呼吸不畅并全身紫干而亡，症状与小儿呼吸窘迫综合征相似，但具体作用机制尚不明确。小鼠作为一种哺乳动物模式生物，特别适合用于此方面的研究。在对RCN3蛋白分子生物学作用机制方面的研究中急需特异性识别并结合该蛋白的抗体。但是目前国内尚无抗小鼠RCN3蛋白的抗体可以购买使用。

生物制药是近年来抗体诊断与药物医药行业中增长最迅速的行业之一，抗体已成为生物制药的最大产品类别，在治疗以肿瘤为主的人类多种疾病方面起着重要作用。随着生物技术的不断发展，抗体药物的市场前景将会越来越广泛。随着人类基因组学的进一步深入，越来越多的新靶点和新表位被发现和研究，抗原范围的扩大也必将扩大抗体药物的市场。随着生物技术的不断进步，提高抗体的科研和生产水平的同时也需要降低科研和生产的成本。

技术实现要素：

本发明为解决难以鉴别和筛选小鼠RCN3蛋白的技术难题，公开了一种抗小鼠RCN3蛋白单克隆ScFv抗体及其淘选方法。

为解决上述技术难题，本发明采用以下技术方案：

一种抗小鼠RCN3蛋白单克隆ScFv抗体，所述单克隆ScFv抗体的碱基序列如SEQ ID NO：10所示，所述碱基序列对应的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。

所述单克隆ScFv抗体由轻链可变区V_L和重链可变区V_H组成，所述轻链可变区V_L的碱基序列如SEQ ID NO：7所示，所述重链可变区V_H的碱基序列如SEQ ID NO：8所示。

所述重链可变区含有三个高变区，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示；所述轻链可变区V_L含有三个高变区，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。

所述单克隆ScFv抗体包括由ScFv通过二硫键形成全长的抗体，以及重链可变区和轻链可变区形成的ScFv、Fab、Fab2、IgG、Fv、Fv2、ScFv2或ScFv-Fc2抗体片段。

所述单克隆ScFv抗体的宿主为M13噬菌体，所述M13噬菌体的宿主为大肠杆菌XL1-blue。

一种抗小鼠RCN3蛋白单克隆ScFv抗体的淘选方法，所述淘选方法具体步骤如下：

（1）构建ScFv抗体噬菌体文库；

（2）利用小鼠RCN3蛋白对ScFv抗体噬菌体文库进行筛选，获得展示了高亲和力抗小鼠RCN3蛋白单链ScFv抗体的噬菌体克隆；

（3）高亲和力抗小鼠RCN3蛋白ScFv抗体的噬菌体克隆的活性测定；

（4）以高亲和力的抗小鼠RCN3蛋白ScFv抗体的噬菌体克隆为模板，构建抗小鼠RCN3蛋白ScFv抗体的表达载体；

（5）真核表达抗小鼠RCN3蛋白ScFv-Fc抗体，亲和纯化抗小鼠RCN3蛋白ScFv-Fc抗体及其活性检测。

本发明的有益效果在于：

1.本发明公开了一种对小鼠RCN3蛋白有很高的亲和力，在噬菌体表面展示的，可用于高效筛选的抗体噬菌体文库的构建及其淘选方法和抗体的序列及真核表达与抗原检测的方法。

2.本发明公开的抗小鼠RCN3蛋白单克隆ScFv抗体噬菌体文库构建及其淘选方法可以淘选得到特异性识别并结合小鼠RCN3蛋白分子的ScFv抗体，所述抗体文库构建及其淘选方法对筛选用于小鼠RCN3蛋白相关的检测与疾病防治具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为三轮淘选产出噬菌体与小鼠RCN3蛋白结合力检测结果图。

图2为单克隆噬菌体与小鼠RCN3蛋白结合力检测结果图。

图3为小鼠RCN3带有Fc片段的单链ScFv抗体的SDS-PAGE检测结果图。

图4为单克隆ScFv抗体与小鼠RCN3蛋白酶联免疫吸附试验（Elisa）检测结合力结果图。

图5为单克隆ScFv抗体与重组小鼠RCN3蛋白的Western blot检测结果图。

具体实施方式

一种抗小鼠RCN3蛋白单克隆ScFv抗体，所述单克隆ScFv抗体的碱基序列如SEQ ID NO：10所示，所述碱基序列对应的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。

所述单克隆ScFv抗体由轻链可变区V_L和重链可变区V_H组成，所述轻链可变区V_L的碱基序列如SEQ ID NO：7所示，所述重链可变区V_H的碱基序列如SEQ ID NO：8所示。

所述重链可变区含有三个高变区，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示；所述轻链可变区V_L含有三个高变区，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。

所述单克隆ScFv抗体包括由ScFv通过二硫键形成全长的抗体，以及重链可变区和轻链可变区形成的ScFv、Fab、Fab2、IgG、Fv、Fv2、ScFv2或ScFv-Fc2抗体片段。

所述单克隆ScFv抗体的宿主为M13噬菌体，所述M13噬菌体的宿主为大肠杆菌XL1-blue。

一种抗小鼠RCN3蛋白单克隆ScFv抗体的淘选方法，所述淘选方法具体步骤如下：

（1）构建ScFv抗体噬菌体文库；

（2）利用小鼠RCN3蛋白对ScFv抗体噬菌体文库进行筛选，获得展示了高亲和力抗小鼠RCN3蛋白单链ScFv抗体的噬菌体克隆；

（3）高亲和力抗小鼠RCN3蛋白ScFv抗体的噬菌体克隆的活性测定；

（4）以高亲和力的抗小鼠RCN3蛋白ScFv抗体的噬菌体克隆为模板，构建抗小鼠RCN3蛋白ScFv抗体的表达载体；

（5）真核表达抗小鼠RCN3蛋白ScFv-Fc抗体，亲和纯化抗小鼠RCN3蛋白ScFv-Fc抗体及其活性检测。

下面结合具体实施例和试验例对本发明做进一步的说明，具体操作如下。

一、单链ScFv抗体DNA文库的制备

用人白细胞提取总RNA并反转录为cDNA。以cDNA为模板，PCR扩增所有类型的轻链可变区和重链可变区基因后，重叠延伸PCR连接轻链和重链。PCR产物经1%琼脂糖凝胶（含EB）电泳后，在紫外灯下切胶回收约750bp大小位置的目的条带，用Qiagen的胶回收试剂盒回收其中的DNA片段，纯化的DNA即为单链ScFv抗体DNA文库。

二、构建单链ScFv抗体免疫噬菌体DNA文库

将单链ScFv抗体免疫DNA文库用NEB的SfiI-HF进行双酶切，产物经1%琼脂糖凝胶（含EB）电泳后，在紫外灯下切胶回收约750bp大小位置的目的条带，用Qiagen的胶回收试剂盒回收其中的DNA片段，得到同时具有2个SfiI-HF酶切末端的单链ScFv抗体免疫DNA文库。

将同时具有2个SfiI酶切末端的单链ScFv抗体免疫噬菌体DNA文库，与同样同时具有2个对应SfiI酶切末端的pSEX载体，在NEB的T4 DNA连接酶的作用下进行连接，得到单链ScFv抗体免疫噬菌体DNA文库。

三、构建具有单链ScFv抗体免疫噬菌体DNA的细菌文库

将单链ScFv抗体免疫噬菌体DNA文库，分多次电穿孔转化入大肠杆菌XL1-blue电转感受态中，在含有100μg/mL 羧苄青霉素和15μg/mL四环素的2×YT固体培养基上，37℃条件下培养14-16h后，得到3×10⁶个单克隆菌落，收集全部单克隆菌落并混匀，得到计数克隆测定库容为3×10⁶CFU的，具有单链ScFv抗体免疫噬菌体DNA的细菌文库。

四、包装单链ScFv抗体免疫噬菌体文库

具有单链ScFv抗体免疫噬菌体DNA的细菌文库，细菌增殖后用含有100μg/mL 羧苄青霉素和15μg/mL四环素的2×YT液体培养基，稀释至OD600吸光值≤0.5，在20MOI的Progen公司的Hyperphage辅助下，30℃ 260rpm振荡培养12-16h包装噬菌体。

包装完成后，离心收集培养基上清。按照培养基上清：5×PEG8000/NaCl（20% PEG8000，150mM NaCl）溶液为4:1的比例向培养基上清中加入5×PEG8000/NaCl溶液，混合均匀后冰浴2h沉淀噬菌体，离心收集沉淀，充分溶解于1mL PBS（pH7.4）中，12000×g离心1 min，去除不可溶的沉淀。再次按照溶液上清：5×PEG8000/NaCl溶液为4:1的比例向溶液上清中加入5×PEG8000/NaCl溶液，混合均匀后冰浴2h沉淀噬菌体，离心收集沉淀，充分溶解于1mL PBS（pH7.4）中，离心去除不可溶的沉淀。溶液上清即为单链ScFv抗体免疫噬菌体文库，测定滴度为5×10⁷PFU/mL。

五、高亲和力噬菌体克隆筛选

以小鼠重组RCN3蛋白为抗原按照1μg/100μL包被96孔酶标板的1个孔100μL，4℃孵育过夜。弃尽孔内液体，PBS（pH7.4）洗涤1次。弃尽孔内液体，加入200μL封闭液（2%脱脂奶粉溶解于含有0.25% Tween20的PBST（pH7.4）中），37℃封闭板孔2h。弃尽孔内液体，PBS（pH7.4）洗涤1次。弃尽孔内液体，加入100μL噬菌体，37℃孵育4h。弃尽孔内液体，含有0.25% Tween20的PBST（pH7.4）洗涤20次。弃尽孔内液体，向孔内加入100μL浓度为1.75μg/mL的胰酶，室温孵育15min。反复吹吸3-4次，转移所有液体至1mL新鲜的OD600吸光值为0.5的XL1-blue（F’）中，37℃孵育1h。取其中的1μL进行1000倍稀释涂布于含有1%葡萄糖、100μg/mL 羧苄青霉素和15μg/mL四环素的 2×YT固体培养基平板上用于计数，余下的全部涂布于，大的方形含有1%葡萄糖、100μg/mL 羧苄青霉素和15μg/mL四环素的 2×YT固体培养基平板上，37℃培养16-18h。收集全部菌落于10mL含有100μg/mL 羧苄青霉素和15μg/mL四环素的 2×YT液体培养基中混匀，取其中一部分稀释至OD600吸光值≤0.3，37℃ 260rpm振荡培养至OD600吸光值≈0.5。在20MOI的Progen公司的Hyperphage辅助下，30℃ 260rpm振荡培养12-16h包装噬菌体。包装完成后，高转速离心三次，收集培养基上清。按照培养基上清：5×PEG8000/NaCl溶液为4:1的比例向培养基上清中加入5×PEG8000/NaCl溶液，混合均匀后冰浴2h沉淀噬菌体，离心收集沉淀，充分溶解于1mLPBS（pH7.4）中，离心去除不可溶的沉淀。再次按照溶液上清：5×PEG8000/NaCl溶液为4:1的比例向溶液上清中加入5×PEG8000/NaCl溶液，混合均匀后冰浴2h沉淀噬菌体，离心收集沉淀，充分溶解于1mL PBS（pH7.4）中，离心去除不可溶的沉淀。计数溶液中噬菌体的滴度。

重复以上亲和筛选过程2次。

经过3轮亲和筛选过程，测定投入和产出的噬菌体的数目，产出/投入比增加了约10000倍，说明特异性结合小鼠RCN3蛋白蛋白的噬菌体得到了有效富集。

通过ELISA试验证明3轮淘选产出的噬菌体结合小鼠RCN3蛋白分子的亲和力显著提高。以100μL溶解于PBS中的3μg/mL 小鼠RCN3蛋白包被ELISA板孔，4℃过夜。弃尽板孔内溶液，以PBST（0.25% Tween20）配置的2%脱脂乳每孔200μL 37℃封闭2h。弃尽板孔内溶液，每孔加入100μL 以PBST（0.25% Tween20）配置的2%脱脂乳稀释的5×10⁸PFU噬菌体，37℃孵育1h。弃净板孔内溶液，以200μL PBST（0.25% Tween20）洗板20次后，每孔加入100μL 以PBST（0.25% Tween20）配置的2%脱脂乳1:5000稀释的 GE 的 HRP 标记的羊抗M13 抗体，37℃孵育1h。弃尽板孔内溶液，以200μL PBST（0.25% Tween20）洗板3次后，每孔加入100μL TMB底物显色液，15分钟后加入50μL的2M硫酸，3-5分钟后读值并进行统计分析，结果如图1所示。

六、筛选结合小鼠RCN3蛋白的阳性噬菌体抗体单克隆

每轮随机挑选5个左右分隔良好的单克隆，挑取2-3轮淘选之后产出的共10个单克隆进行序列测定，并对其进一步分析氨基酸序列和CDR 区。结果如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。

七、噬菌体克隆的活性测定

用ELISA试验证明淘选出的全人源抗小鼠RCN3蛋白单链ScFv抗体的噬菌体克隆可以特异性识别并结合小鼠RCN3蛋白分子。小鼠RCN3蛋白、GST蛋白和BSA蛋白分别以100μL溶解于PBS中的3μg/mL包被ELISA板孔，4℃过夜。弃尽板孔内溶液，以PBST（0.25% Tween20）配置的2%脱脂乳每孔200μL 37℃封闭2h。弃尽板孔内溶液，每孔加入100μL 以PBST（0.25% Tween20）配置的2%脱脂乳稀释的5×108PFU噬菌体，37℃孵育1h。弃净板孔内溶液，以200μL PBST（0.25% Tween20）洗板20次后，每孔加入100μL 以PBST（0.25% Tween20）配置的2%脱脂乳1:5000稀释的 GE 的 HRP 标记的羊抗M13 抗体，37℃孵育1h。弃尽板孔内溶液，以200μL PBST（0.25% Tween20）洗板3次后，每孔加入100μL TMB底物显色液，15分钟后加入50μL的2M硫酸，3-5分钟后读值并进行统计分析，结果如图2所示。

八、克隆ScFv-Fc抗体及其活性测定

将ELISA检测证实具有较强结合力的噬菌体上展示的编码SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和 SEQ ID NO：9的如SEQ ID NO：10所示的ScFv，导入真核表达载体pFUSERTL1中，转染到CHO-S悬浮细胞中进行表达7天，离心收集表达上清，利用Protein A亲和纯化全人源抗小鼠RCN3带有Fc标签的单链ScFv抗体。进行SDS-PAGE鉴定，结果如图3所示。

利用ELISA的方法，鉴定此ScFv-Fc抗体能与小鼠RCN3蛋白结合。小鼠RCN3蛋白、GST蛋白和BSA蛋白分别以100μL溶解于PBS中的3μg/mL包被ELISA板孔，4℃过夜。弃尽板孔内溶液，以PBST（0.25% Tween20）配置的2%脱脂乳每孔200μL 37℃封闭2h。弃尽板孔内溶液，每孔加入100μL 以PBST（0.25% Tween20）配置的5%脱脂乳稀释的300ng/μL的RCN3抗体作为一抗，37℃孵育1h。弃净板孔内溶液，用200μL PBST（0.25% Tween20）洗板5次后，每孔加入100μL 以PBST（0.25% Tween20）配置的2%脱脂乳1:5000稀释的 GE 的 HRP 标记的羊抗人IgG抗体，37℃孵育1h。弃尽板孔内溶液，用200μL PBST（0.25% Tween20）洗板3次后，每孔加入100μL TMB底物显色液，15分钟后加入50μL的2M硫酸，3-5分钟后读值并进行统计分析。结果如图4所示。此抗体可以特异性识别并结合小鼠RCN3蛋白分子。

利用Western blot方法检测此抗体能识别重组小鼠RCN3蛋白。将重组小鼠RCN3蛋白进行SDS-PAGE电泳后，电转移到0.2μm的NC膜上。封闭液（5%脱脂乳溶于0.05%的PBST中）封闭过夜后，加入封闭液稀释的终浓度为2μg/mL的ScFv-Fc抗体室温孵育2h，0.05%的PBST洗涤3次后以封闭液1:5000稀释的 GE 的 HRP 标记的羊抗人IgG抗体孵育1h。PBST洗涤3次后用科晶生物科技有限公司的化学发光液显色，ProteinSimple公司的FluorChem M system进行荧光和化学发光捕获照相，结果如图5所示。此抗体可以特异性识别并结合小鼠RCN3蛋白。

<110> 郑州师范学院

<120> 一种抗小鼠RCN3蛋白单克隆ScFv抗体及其淘选方法

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

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<221> DOMAIN

<222> (1)...(8)

<400> 1

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> DOMAIN

<222> (1)...(8)

<400> 2

Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys

1 5

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

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<221> DOMAIN

<222> (1)...(11)

<400> 3

Ala Arg Asp Leu Gly Thr His Ala Phe Asp Ile

1 5 10

<210> 4

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> DOMAIN

<222> (1)...(6)

<400> 4

Gln Asp Ile Thr Tyr His

1 5

<210> 5

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

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<221> DOMAIN

<222> (1)...(3)

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Asp Ala Ser

1

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> DOMAIN

<222> (1)...(9)

<400> 6

Gln His Tyr Tyr Asn Arg Pro Pro Thr

1 5

<210> 7

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

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<221> DOMAIN

<222> (1)...(107)

<400> 7

Glu Leu Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Thr Tyr His

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

35 40 45

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Val Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Tyr Asn Arg Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 8

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> DOMAIN

<222> (1)...(118)

<400> 8

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Leu Gly Thr His Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Met Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 9

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> DOMAIN

<222> (1)...(243)

<400> 9

Glu Leu Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Thr Tyr His

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Val Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Tyr Asn Arg Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Gly Gly Ser Ser Arg

100 105 110

Ser Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln

115 120 125

Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg

130 135 140

Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His

145 150 155 160

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile

165 170 175

Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg

180 185 190

Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met

195 200 205

Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp

210 215 220

Leu Gly Thr His Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr

225 230 235 240

Val Ser Ser

243

<210> 10

<211> 729

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> gene

<222> (1)...(729)

<400> 10

gagctccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc aggcgagtca ggacattacc taccatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc caaagctcct gatctacgat gcatccaatt tggtaaccgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gaagtggatc tgggacagac tttactgtca ccattagcag tctgcagcct 240

gaagattttg caacctacta ctgtcaacac tattataatc gccctcccac cttcggccaa 300

gggacacgac tggagattaa aggtggttcc tctagatctt cctcctctgg tggcggtggc 360

tcgggcggtg gtgggcaggt gcagctggtg cagtctgggg gaggcgtggt ccagcctggg 420

aggtccctga gactctcctg tgcagcctct ggattcacct tcagtagcta tggcatgcac 480

tgggtccgcc aggctccagg caaggggctg gagtgggtgg cagttatatc atatgatgga 540

agtaataaat actatgcaga ctccgtgaag ggccgattca ccatctccag agacaattcc 600

aagaacacgc tgtatctgca aatgaacagc ctgagagctg aggacacggc tgtgtattac 660

tgtgcgagag acctcgggac ccatgctttc gatatctggg gccaagggac aatggtcacc 720

gtctcttca 729。