技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，涉及重组基因工程菌发酵合成2,5-呋喃二甲酸的方法。
背景技术：
2，5-呋喃二甲酸( FDCA) 是重要的有机合成中间体，可用来制备各种烷基取代或酯类呋喃衍生物。烷基取代类衍生物广泛应用于合成手性催化剂、分子识别受体和高分子材料中; 酯类衍生物是重要香料，主要用在食品、化妆品香精中。此 外，2，5-呋喃二甲酸可取代对苯二甲酸制造聚酯类的塑胶材料。在药理学方面，2，5-呋喃二甲酸二乙酯具有与可卡因类似的麻醉作用，2，5-呋喃二甲酸钙盐具有抑制巨大芽孢杆菌的生长的功能。
以二甘醇酸为原料，与二氯亚砜和甲醇反应得到二甘醇酸二甲酯，在氢氧化钾作用下，与二水合三聚乙二醛缩合得到2，5-呋喃二甲酸。此法原料不易制备、价格昂贵，合成中用到了二氯亚砜、乙醚、氯仿等危险试剂，后处理常采用柱层析法， 不利于工业化生产。以5-羟甲基糠醛为原料，金合二氧化铈为催化剂，高压(1.01×106Pa)氧化得到2,5-呋喃二甲酸。此法虽然获得较好的收率99%，但原料及金属催化剂价格昂贵，高压条件对设备要求太高，工业化成本高，不利于实际生产应用。以糠酸为起始原料，先与甲醇反应，经氯甲基化，再水解，最后经高锰酸钾氧化制得2,5-呋喃二甲酸 ，反应总收率为47.5% 。此方法的原料虽较廉价易得，但操作工艺要求高和环境污染较严重。本发明是将梭菌属甘油脱水酶基因gldABC，整合进土生克雷伯杆菌基因dhaβ,形成重组DNA基因gldha；通过PCR扩增，并经修饰后插入大肠杆菌表达载体pTE28aT7，构建2,5-呋喃二甲酸工程菌pTE28aT7-gldha；在异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导下，在含有果糖的限制培养基中，经深度发酵合成2,5-呋喃二甲酸；通过过滤发酵液、有机溶剂萃取结晶和组合溶剂重结晶获得产品2,5-呋喃二甲酸。合成工艺路线简捷，既节能又环保，所获得的产品质量高和成本低，总质量收率达到65.5%以上。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供重组基因工程菌发酵合成2,5-呋喃二甲酸的方法。
本发明通过下述方法实现的：
将梭菌属甘油脱水酶基因gldABC，整合进土生克雷伯杆菌基因dhaβ,形成重组DNA基因gldha；通过PCR扩增，并经修饰后插入大肠杆菌表达载体pTE28aT7，构建2,5-呋喃二甲酸工程菌pTE28aT7-gldha；在异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导下，在含有果糖的限制培养基中，经深度发酵合成2,5-呋喃二甲酸；通过过滤发酵液、有机溶剂萃取结晶和组合溶剂重结晶获得产品2,5-呋喃二甲酸。
质粒子及菌株：
克隆载体pTE28aT7-，大肠杆菌E.Coli ＪＭ１０９购自商业公司。
限制性内切酶，Taq酶，T4DNA连接酶均购自大连宝生物工程公司，其他化学试剂为国产分析纯化学试剂。
甘油脱水酶分离培养基：蒸馏水1000mL,果糖6g,NaCl 5g,酵母粉7 g，葡萄糖20g,琼脂粉15g,调pH7.0,0.1MPa灭菌20min.冷却至35℃～45℃，加入尼尔红（Nile Red）2mL/L(0.30mg Nile Red溶于100mL二甲基亚砜），无菌条件下倒入培养皿，冷却后备用。
富营养培养基：蒸馏水1000mL,酵母粉10g,琼脂粉10g,果糖3g,(NH4)2SO4 5g,调pH7.0，0.1MPa灭菌10min.
产品发酵培养基：
磷酸盐缓冲液的配制：蒸馏水1000mL，NaH2PO4.12H2O 8.95g，KH2PO4 1.5g,pH7.00.1MPa灭菌，15min～20min,备用。
基因工程菌富集培养基为 LB 培养基。发酵培养基为添加15.0%果糖的LB培养基，以鼓入空气作为基因工程菌氧化剂；培养温度为35℃。
重组DNA基因的获得与重组质粒的构建：
按照已发表的梭菌属甘油脱水酶的基因gldABC的cDNA序列，设计正反引物:正向引物Pl (5'-ACGAGGAATTCATGAATTGGCCTACTCG-3');反向引物P2 ( 5'-ATATGCGGCCGCGTGAACAGTAGGCAGAG-3')。正向引物带有EcoRI酶切位点，反向引物带有Not工酶切位点，以引物Pl , P2对重组质粒pUC19-gldABC PCR扩增获得gldABC基因片段。同样，设计土生克雷杆菌的基因dhaβ, 正向引物带有BamHI酶切位点，反向引物带有Xoh工酶切位点，以引物Pl’ , P2’对重组质粒pUCM-dhaβ PCR扩增获得dhaβ基因片段。将上述2种基因片段，在连接酶T4 ligase的作用，连接成为重组DNA的基因gldha。经重组DNA质粒的提取、高通量筛选和序列测定后，采用CaCl2质粒重组技术，将重组DNA的基因gldha和载体，转入E.coli JM109的感受态细胞中，转化子测序，得到表达质粒pTE28aT7-gldha。
PCR扩增：97℃预变性10min，94℃变形60s，58℃退火30s，72℃延伸60-120s，30个循环后72℃延伸10min。
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化：
根据钙法制备大肠杆菌感受态细胞并进行转化，转化后接于1mlLB培养集中36℃、150r/min振荡培养2h，均匀涂布于含有氨苄青霉素的LB平板上筛选重组大肠杆菌。筛选得到的菌株利用菌落PCR和限制性内切酶酶切重组质粒验证重组子。
重组基因工程菌的提取：
前培养是在L-试管中，以无菌操作加入5ml富营养培养基，以无菌牙签接入产气气杆菌的单菌落。35℃、120r/min培养15h。将前培养物0.5ml接种至含有100ml富营养培养基的500ml三角瓶中，30℃、110r/min振荡培养24h。4℃，6000*g无菌离心10min，弃上清，在离心管中以无菌磷酸盐缓冲液振荡混匀，然后在4℃，6000*g无菌离心12min，弃上清。将前培养物0.5ml接种至含有100ml富营养培养基的500ml三角瓶中，35℃、110r/min振荡培养24h。4℃，6000*g无菌离心10min，弃上清，在离心管中以无菌磷酸盐缓冲液振荡混匀，再次在4℃，6000*g无菌离心12min，弃上清。在分别将不含有富营养培养基的菌体无菌接入10瓶含有100m发酵培养基的500ml三角瓶中，31℃～37℃、110r/min振荡培养48h。
重组基因工程菌发酵生产2,5-呋喃二甲酸：
-70℃保藏的重组大肠杆菌在LB培养基平板上活化，以灭菌牙签挑取单菌落接于20mlLB培养基中，31℃～37℃培养过夜，以2%的接种量接种于发酵培养基中，加入1～2mmol/L的IPTG诱导gldhA的表达，发酵培养48h。
发酵产物的分离：发酵收获后，离心分离和回收催化酶，发酵母液使用乙酸丁酯萃取，将萃取所得的有机浓缩结晶后，使用乙酸丁酯和石油醚（1:3～4体积）重结晶得到产品。
本发明的重组基因工程菌发酵合成2,5-呋喃二甲酸的方法简明、产量高、成本低廉。基于上述优点，本发明的工程菌将在2,5-呋喃二甲酸的生物法制备中发挥重要的作用，应用前景广阔。
具体实施方式
下面结合具体的实施例，对本发明作进一步的阐述，但不限于这些具体的实施例，而所有的实施例均按上述的操作步骤操作。
实施例1
质粒子及菌株：
克隆载体pTE28aT7-，大肠杆菌E.Coli ＪＭ１０９购自商业公司。
限制性内切酶，Taq酶，T4DNA连接酶均购自大连宝生物工程公司，其他化学试剂为国产分析纯化学试剂。
甘油脱水酶分离培养基：蒸馏水1000mL,果糖6g,NaCl 5g,酵母粉7 g，葡萄糖20g,琼脂粉15g,调pH7.0,0.1MPa灭菌20min.冷却至35℃～45℃，加入尼尔红（Nile Red）2mL/L(0.30mg Nile Red溶于100mL二甲基亚砜），无菌条件下倒入培养皿，冷却后备用。
富营养培养基：蒸馏水1000mL,酵母粉10g,琼脂粉10g,果糖3g,(NH4)2SO4 5g,调pH7.0，0.1MPa灭菌10min.
产品发酵培养基：
磷酸盐缓冲液的配制：蒸馏水1000mL，NaH2PO4.12H2O 8.95g，KH2PO4 1.5g,pH7.00.1MPa灭菌，15min～20min,备用。
基因工程菌富集培养基为 LB 培养基。发酵培养基为添加15.0%果糖的LB培养基，以鼓入空气作为基因工程菌氧化剂；培养温度为35℃。
重组DNA基因的获得与重组质粒的构建：
按照已发表的梭菌属甘油脱水酶的基因gldABC的cDNA序列，设计正反引物:正向引物Pl (5'-ACGAGGAATTCATGAATTGGCCTACTCG-3');反向引物P2 ( 5'-ATATGCGGCCGCGTGAACAGTAGGCAGAG-3')。正向引物带有EcoRI酶切位点，反向引物带有Not工酶切位点，以引物Pl , P2对重组质粒pUC19-gldABCPCR扩增获得gldABC基因片段。同样，设计土生克雷杆菌的基因dhaβ, 正向引物带有BamHI酶切位点，反向引物带有Xoh工酶切位点，以引物Pl’ , P2’对重组质粒pUCM-dhaβ PCR扩增获得dhaβ基因片段。将上述2种基因片段，在连接酶T4 ligase的作用，连接成为重组DNA的基因gldha。经重组DNA质粒的提取、高通量筛选和序列测定后，采用CaCl2质粒重组技术，将重组DNA的基因gldha和载体，转入E.coli JM109的感受态细胞中，转化子测序，得到表达质粒pTE28aT7-gldha。
PCR扩增：97℃预变性10min，94℃变形60s，58℃退火30s，72℃延伸60-120s，30个循环后72℃延伸10min。
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化：
根据钙法制备大肠杆菌感受态细胞并进行转化，转化后接于1mlLB培养集中36℃、150r/min振荡培养2h，均匀涂布于含有氨苄青霉素的LB平板上筛选重组大肠杆菌。筛选得到的菌株利用菌落PCR和限制性内切酶酶切重组质粒验证重组子。
重组基因工程菌的提取：
前培养是在L-试管中，以无菌操作加入5ml富营养培养基，以无菌牙签接入产气气杆菌的单菌落。35℃、120r/min培养15h。将前培养物0.5ml接种至含有100ml富营养培养基的500ml三角瓶中，30℃、110r/min振荡培养24h。4℃，6000*g无菌离心10min，弃上清，在离心管中以无菌磷酸盐缓冲液振荡混匀，然后在4℃，6000*g无菌离心12min，弃上清。将前培养物0.5ml接种至含有100ml富营养培养基的500ml三角瓶中，35℃、110r/min振荡培养24h。4℃，6000*g无菌离心10min，弃上清，在离心管中以无菌磷酸盐缓冲液振荡混匀，再次在4℃，6000*g无菌离心12min，弃上清。在分别将不含有富营养培养基的菌体无菌接入10瓶含有100m发酵培养基的500ml三角瓶中，31℃～37℃、110r/min振荡培养48h。
重组基因工程菌发酵生产2,5-呋喃二甲酸：
-70℃保藏的重组大肠杆菌在LB培养基平板上活化，以灭菌牙签挑取单菌落接于20mlLB培养基中，31℃～37℃培养过夜，以2%的接种量接种于发酵培养基中，加入1～2mmol/L的IPTG诱导gldhA的表达，发酵培养48h。
发酵产物的分离：发酵收获后，离心分离和回收催化酶，发酵母液使用乙酸丁酯萃取，将萃取所得的有机浓缩结晶后，使用乙酸丁酯和石油醚（1:3～4体积）重结晶得到2,5-呋喃二甲酸8.57g(熔点308.5～309.2℃，含量99.32%,收率65.51%)。
实施例2
各培养基的组成和培养条件同上。
重组DNA基因的获得与重组质粒的构建：
按照已发表的梭菌属甘油脱水酶的基因gldABC的cDNA序列，设计正反引物:正向引物Pl (5'-ACGAGGAATTCATGAATTGGCCTACTCG-3');反向引物P2 ( 5'-ATATGCGGCCGCGTGAACAGTAGGCAGAG-3')。正向引物带有EcoRI酶切位点，反向引物带有Not工酶切位点，以引物Pl , P2对重组质粒pUC19-gldABC PCR扩增获得gldABC基因片段。同样，设计土生克雷杆菌的基因dhaβ, 正向引物带有BamHI酶切位点，反向引物带有Xoh工酶切位点，以引物Pl’ , P2’对重组质粒pUCM-dhaβ PCR扩增获得dhaβ基因片段。将上述2种基因片段，在连接酶T4 ligase的作用，连接成为重组DNA的基因gldha。经重组DNA质粒的提取、高通量筛选和序列测定后，采用CaCl2质粒重组技术，将重组DNA的基因gldha和载体，转入E.coli JM109的感受态细胞中，转化子测序，得到表达质粒pTE28aT7-gldha。
PCR扩增：97℃预变性10min，94℃变形60s，58℃退火30s，72℃延伸60-120s，30个循环后72℃延伸10min。
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化：
根据钙法制备大肠杆菌感受态细胞并进行转化，转化后接于1mlLB培养集中36℃、150r/min振荡培养2h，均匀涂布于含有氨苄青霉素的LB平板上筛选重组大肠杆菌。筛选得到的菌株利用菌落PCR和限制性内切酶酶切重组质粒验证重组子。
重组基因工程菌的提取：
前培养是在L-试管中，以无菌操作加入5ml富营养培养基，以无菌牙签接入产气气杆菌的单菌落。35℃、120r/min培养15h。将前培养物0.5ml接种至含有100ml富营养培养基的500ml三角瓶中，30℃、110r/min振荡培养24h。4℃，6000*g无菌离心10min，弃上清，在离心管中以无菌磷酸盐缓冲液振荡混匀，然后在4℃，6000*g无菌离心12min，弃上清。将前培养物0.5ml接种至含有100ml富营养培养基的500ml三角瓶中，35℃、110r/min振荡培养24h。4℃，6000*g无菌离心10min，弃上清，在离心管中以无菌磷酸盐缓冲液振荡混匀，再次在4℃，6000*g无菌离心12min，弃上清。在分别将不含有富营养培养基的菌体无菌接入10瓶含有100m发酵培养基的500ml三角瓶中，31℃～37℃、110r/min振荡培养48h。
重组基因工程菌发酵生产2,5-呋喃二甲酸：
-70℃保藏的重组大肠杆菌在LB培养基平板上活化，以灭菌牙签挑取单菌落接于20mlLB培养基中，31℃～37℃培养过夜，以2%的接种量接种于发酵培养基中，加入1～2mmol/L的IPTG诱导gldhA的表达，发酵培养48h。
发酵产物的分离：发酵收获后，离心分离和回收催化酶，发酵母液使用乙酸丁酯萃取，将萃取所得的有机浓缩结晶后，使用乙酸丁酯和石油醚（1:3～4体积）重结晶得到2,5-呋喃二甲酸9.08g(熔点308.6～309.3℃，含量99.27%,收率69.35%)。