一种用于单细胞捕捉和培养的微流控芯片的制作方法

本发明涉及一种用于单细胞捕捉和培养的微流控芯片。

背景技术：

单细胞分析已经发展成为细胞生物学领域研究细胞功能的一个关键问题，并且受限于工具和技术支持使得对单个细胞的分离，对后续的单细胞研究等问题变得越来越突出。传统提取单细胞的方式相当繁复：将细胞悬浮液分注在培养盘，静置待细胞沉淀，再用显微镜确认盘上微孔中有多少个成功抓取到一个细胞。显微镜的视野塞不下单个孔洞，所以研究人员得反复挪移盘子，如此重复确认近百次。这种传统的序列稀释法耗时、费力且效率不佳。

近年来，微流控芯片的出现，为研究者们提供了一种操纵微米尺度的流体的方法。同时微米纳米加工技术的发展也提供了制造与细胞尺度相似的微结构的方法。上述技术的出现，使得单细胞的操控成为可能。微流控芯片单细胞操纵是在微米级通道内驱动细胞并将其运送到预定位点或将其固定在特定位置的方法。目前微流控芯片单细胞操纵手段主要是在力学、电学等原理上建立起来的，具体可以分为机械捕捉，磁场捕捉，光学，介电泳捕捉，超声捕捉，水动力捕捉等。

实际应用产品方面，对于非商用研究中的单细胞技术，一定数量的单细胞应用已经被全世界的开发研究小组在非商业产品或原型系统中实现。多数的这些技术是基于微流控芯片，并且发展了更加灵活的方法，研究者们已经开发出了基于液滴的技术，比如激光引导打印，改进的喷墨打印，在不同的基板上打印单细胞。然而基于喷墨的细胞打印会使许多细胞受损或死亡。当细胞喷出喷嘴，就只50％到80％的成活率。

美国休斯顿卫理公会研究院的研究人员开发出一种可将活细胞打印到任何表面和几乎任何形状上的技术，且整个过程中几乎所有的细胞仍能存活。这种方法在可产生2D细胞阵列，并可以应用与不同类型的细胞，虽然接近100％的细胞成活率。但其捕捉成功率只在百分之九十到九十四，其捕捉时间通常在半个小时左右，而且不能跟细胞培养有效的结合。

中国台湾卫生研究院生医工程与纳米医学研究所的研发人员开发出一种具有上下版具有一大一小两个微孔的微流控芯片，通过利用小微孔捕捉单细胞，然后使用重力将捕捉的细胞转移到大的微孔使细胞在细胞培养期间扩散和生长，其操作简单、低成本，其单细胞捕捉效率相比传统方法已经有显著的提高。然而其通过小微孔捕捉细胞的方法，导致单细胞捕捉效率偏低，小孔成功获得一个细胞的机率通常只有10％到20％，而且其操作过程中需要静置一段时间导致其难以实现单细胞高通量捕捉。

技术实现要素：

本发明的主要目的在于克服现有技术的不足，提供一种单细胞分析用的微流控芯片，能够将单细胞精确地快速地从大量细胞中捕捉，并将单细胞捕捉、冲洗和培养过程集成在单个微流控芯片上，通过简单的操作，实现单细胞高通通量精确获取及培养分析。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种用于单细胞捕捉和培养的微流控芯片，包括组合在一起的上盖板和下基板，所述上盖板和所述下基板的相对表面上分别设置有微孔阵列，所述上盖板和所述下基板的各个微孔一一对准，所述上盖板上的微孔独立隔离分布，所述下基板上的微孔由所述下基板上的微流通道串联成一条液体通道或者并联成多条液体通道，每条液体通道在所述微流控芯片上具有一个液体入口和一个液体出口，所述下基板上的微孔阵列中的每个微孔的入口处设置有微挡流结构，所述微挡流结构用于捕捉流入其中的单个目标细胞，且所述微挡流结构与所述上盖板之间具有大于目标细胞直径的间隙；当翻转所述微流控芯片时，由所述微挡流结构捕捉的单个目标细胞落入并限位于所述上盖板上的对应微孔中。

进一步地：

所述微挡流结构具有水平对称设置的两个钩状部，所述两个钩状部在靠近微孔外的一端具有较大的间隙，在靠近微孔内的一端具有较小的间隙，所述较大的间隙大于目标细胞的直径，所述较小的间隙小于目标细胞的直径。

所述较大的间隙为目标细胞直径的1.3～1.8倍，优选1.5倍，所述较小的间隙为目标细胞直径的0.2～0.8倍，优选0.6倍。

所述微挡流结构与所述微孔的近端壁面的间隙为目标细胞直径的1.5倍以上，优选2倍。

所述微挡流结构的高度为目标细胞的直径的0.8倍以上，优选相等。

所述上盖板上的微孔的深度大于所述下盖板上的微孔的深度。

所述上盖板和所述下基板上的微孔为直径相同的圆柱形微孔。

所述液体入口和所述液体出口设置在所述上盖板上。

所述液体入口和所述液体出口连接有用于驱动液体流动的注射泵。

所述微流控芯片通过用软光刻法结合聚二甲硅氧烷(PDMS)制作成型，所述上盖板和所述下基板键合在一起。

本发明的有益效果：

本发明针对目前已公开的技术中单细胞捕捉和培养技术存在的细胞成活率低、捕捉率低、纯度低、难以实现高通量精确受控组装的不足，提出一种用于细胞捕捉和培养的微流控芯片，利用流体力学原理和微流控技术，将流动聚焦理论与钩状结构相结合，并与微孔板相配合，实现单细胞精确捕捉和培养，具有高捕捉率、高纯度、高通量、适用性强的特点，并且结构简单、易操作加工、成本低，进而成为能够满足科研和临床需求的工具，为单细胞研究提供发展机理、诊断及治疗等，探索出一条新的研究和实验手段。

本发明具有以下优点：1、实现了单细胞高效捕捉和培养；2、采取了可抛弃式微流控芯片制作简单，没有高深比结构，免清洗和可扩展性强3、实现了接近百分之百的精确捕捉；4、通过微挡流结构优化和弯曲微通道显著提高了捕捉效率；5、反转后细胞存活率高。

附图说明

图1是本发明实施例的一种用于单细胞捕捉和培养的微流控芯片的结构示意图；

图2是本发明实施例微流控芯片中上盖板的仰视图；

图3是本发明实施例微流控芯片中上盖板剖视图和局部放大图；

图4是本发明实施例微流控芯片中下盖板的俯视图；

图5是本发明实施例微流控芯片中下盖板剖视图和局部放大图；

图6是本发明实施例微流控芯片中下盖板中单个捕捉结构；

图7是本发明实施例微流控芯片键合后的透视图和局部放大示意图；

图8是本发明实施例微流控芯片键合后的剖视图和局部放大图；

图9是本发明实施例微流控芯片捕捉和培养的流程示意图，图中从上至下分别表示流道冲洗、细胞捕获、细胞冲洗、翻转培养四个步骤。

附图标记说明：

1——上盖板；2——下基板；3——液体入口；4——液体出口；5——上盖板的微孔阵列；6——下基板的微孔阵列；7——微流通道；8——微挡流结构；9-目标细胞。

具体实施方式

以下对本发明的实施方式作详细说明。应该强调的是，下述说明仅仅是示例性的，而不是为了限制本发明的范围及其应用。

参阅图1至图9，在一种实施例中，一种用于单细胞捕捉和培养的微流控芯片，包括组合在一起的上盖板1和下基板2，所述上盖板1和所述下基板2的相对表面上分别设置有微孔阵列5、6，所述上盖板1和所述下基板2的各个微孔一一对准，所述上盖板1上的微孔独立隔离分布，所述下基板2上的微孔由所述下基板2上的微流通道7串联成一条液体通道或者并联成多条液体通道，每条液体通道在所述微流控芯片上具有一个液体入口3和一个液体出口4，所述下基板2上的微孔阵列中的每个微孔与微流通道7连通的入口处设置有微挡流结构8，所述微挡流结构8用于捕捉流入其中的单个目标细胞9，且所述微挡流结构8与所述上盖板1之间具有大于目标细胞直径的间隙以保持所述液体通道的整体流通性而不会造成堵塞；当翻转所述微流控芯片使所述上盖板1在下而所述下基板2在上时，由所述微挡流结构8捕捉的单个目标细胞9落入并限位于所述上盖板1上的对应微孔中，并可在其中进行单株培养。

在优选的实施例中，所述微挡流结构8具有水平对称设置的两个钩状部，所述两个钩状部在靠近微孔外的一端具有较大的间隙，在靠近微孔内的一端具有较小的间隙，所述较大的间隙大于目标细胞的直径，所述较小的间隙小于目标细胞的直径。

在更优选的实施例中，所述较大的间隙为目标细胞直径的1.3～1.8倍，最优选为1.5倍，所述较小的间隙为目标细胞直径的0.2～0.8倍，最优选为0.6倍。

在优选的实施例中，所述微挡流结构8与所述微孔的近端壁面的间隙为目标细胞直径的1.5倍以上，最优选为2倍。

在优选的实施例中，所述微挡流结构8的高度为目标细胞的直径的0.8倍以上，最优选地，微挡流结构8的高度与目标细胞的直径相等。

在优选的实施例中，所述上盖板1上的微孔的深度大于所述下盖板上的微孔的深度。

在优选的实施例中，所述上盖板1和所述下基板2上的各个微孔为圆柱形微孔。

在优选的实施例中，所述液体入口3和所述液体出口4设置在所述上盖板1上。

在优选的实施例中，所述液体入口3和所述液体出口4连接有用于驱动液体流动的注射泵。

在优选的实施例中，所述微流控芯片通过用软光刻法结合聚二甲硅氧烷(PDMS)制作成型，所述上盖板1和所述下基板2键合在一起。

为避免清洗步骤带来的效率降低和成本上升，本发明采用可抛弃式微流控芯片。

根据本发明的一些实施例，芯片由上盖板键合下基板组成。通过用软光刻法结合聚二甲硅氧烷(PDMS)制作的成型技术制备在下基板表面刻有微流道，其中流道包括弯曲流道，包括液体入口、主流道、用于细胞捕捉的对称的钩状结构、液体出口。

芯片上下两层各有直径和间距都相同但深度不同的圆柱型微孔阵列，下层较浅的筛选微孔由微流通道串联或者并联起来，微孔深度和微流通道的深度相同，并在微孔入口处有微挡流结构，可有效捕捉单细胞；捕捉后用不含细胞的培养液把残留的细胞冲走，而后翻转，在重力的作用下被捕捉的细胞会落到上层较深的培养微孔，进行长时间单株培养。

在本发明的一个具体实例中的芯片大小：15x 30mm²；下层筛选微孔：直径300微米、深度30微米；上层培养微孔：直径300微米、深度200微米。

微流通道可以是串联的蛇形的单条通道，这种情况下仅需要一个液体入口和一个液体出口；也可以是并行布置的多条通道，每条通道均有与其连通的液体入口和液体出口。

本发明具体实施例的微流控芯片的微流通道的尺寸，由具体分析的单细胞的大小决定。在具体实施例中，宽度可以是30-100微米，深度可以是20-50微米。本领域技术人员可以根据分析的单细胞的大小设计微流通道的尺寸。一个具体实施例中，微流通道的宽度为100微米，深度均为30微米。

注射泵连接所述微流控芯片的液体入口和液体出口，用于驱动微流体流动。

在本发明的一个具体实施例中，芯片键合后的微挡流结构的高度与捕捉细胞直径相等，二者均小于微通道的深度，而其钩状结构顶部与上盖板的间距大于捕捉细胞直径不会发生堵塞。捕捉区的微挡流结构与近端壁面的距离等于目标细胞直径的2倍。两个对称的钩状结构之间的最小间隙应小于目标细胞直径，考虑到细胞的弹性，同时为了更高效的捕捉细胞，其钩状结构的最大间距为目标细胞直径的1.5倍，最小间距为目标细胞直径的0.6倍。

当细胞被钩状结构捕捉后，其通过的流量会由于细胞的阻挡进一步缩小。微挡流结构在绝大多数情况下只能容纳一个细胞。在非常罕见的情况下，当一个陷阱捕捉多个细胞，不含细胞的培养液的进一步冲洗也能够除去钩状微结构附近以及流道其他地方额外的细胞。单细胞捕捉精确度能够接近100％。

捕捉后用不含细胞的培养液把残留的细胞冲走，这是由于微挡流结构的作用，被捕捉的细胞并不能被冲走。

最后把芯片反转使上盖板在下而下基板在上，在重力的作用下被捕捉的细胞会落到上盖板中较深的培养微孔阵列中，可以进行长时间单株培养。

芯片内无运动部件，所有微结构都是通过软光刻工艺；上下板PDMS连接处通过强紫外光源固化键合，保证了管道的密封性。固化的芯片结构使得使用过程简单高效，操作简洁。

采用本发明的微流控芯片对平均直径约为10微米的癌细胞进行捕捉喷射：通过用软光刻法结合聚二甲硅氧烷(PDMS)制作的成型技术制备如图2所示的微流控芯片，微流道7刻在下基板2上，上盖板1和下基板2的材料均为PDMS，上盖板1和下基板2通过等离子表面改性质和对准键合机键合在一起，微流道7的深度为30微米，流道的宽度为100微米，深度为30微米。钩状微结构的最小间距为5毫米，最大间距为15毫米。

其工作流程流程图如图9示，开始准备阶段用注射泵通过培养液入口注入培养液冲刷微通道，流量为400μL/min，确保微流通道内没有残留细胞所示；接着所示为正向压力驱动将含有密度较高(每毫升500个细胞)的细胞悬浮液从流道入口进入流道，流量为100μL/min,当液体流至钩状结构时，大部分细细胞悬液顺由勾状结构与壁面之间的间隙绕过勾状结构液体出口，只有少数细胞流向钩状结构之间的间隙，并卡在两个钩状结构的间隙，从而成功将细胞捕获。接着通过入口孔将无细胞的缓冲液流入微通道，流量为400μL/min，这样可以把微通道中残留细胞冲出保证每个捕获区只有一个单细胞。最后通过对微流控芯片的反转，在重力的作用下，细胞全部落入上盖板的微孔阵列中，整个过程只有一个压力源应用于每一个步骤，可以在60秒内完成。之后就可以对细胞进行单株培养。

本发明的微流控芯片还可以通过调整钩状结构尺寸大小、微通道之间间隙的大小，可以实现对不同直径目标细胞的捕捉，可以调整微孔阵列的直径大小和间距对不同细胞培养进行调整和改善。其液体出口也可以连接回收容器，回收没有被捕捉的细胞悬浮液，在加入循环泵实现细胞的循环捕捉喷射。

本发明的主要技术指标

本发明能够克服现有单细胞捕捉喷射体统存在的制造成本高、精度低、难以单个细胞快速精确受控组装的，在重复性和可靠性上尚不能满足生化检测关键难题作为切入点，开发基于微流控芯片的实现单细胞的精确捕捉和培养，并达到以下技术指标：

1.应用微机电技术加工制成单细胞分选系统，实现单细胞捕捉和培养；

2.捕捉效率：单细胞的效率达到50％以上，多次；

3.捕捉精度：单细胞的精度达到95％以上；

4高通量：60秒可以捕捉800个单细胞。

4.细胞存活率：喷射后细胞存活率达98％以上，24小时后的细胞存活率达到90％以上，72小时后的细胞存活率达到百分之85以上，而且一直维持多能性，即分化出多种细胞的潜能。

以上内容是结合具体/优选的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，其还可以对这些已描述的实施方式做出若干替代或变型，而这些替代或变型方式都应当视为属于本发明的保护范围。