一种莱茵衣藻重金属镉吸附突变体的筛选方法与流程

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种莱茵衣藻重金属镉吸附突变体的筛选方法。

背景技术：

随着重工业化的不断发展，国内重金属污染问题也日益加重。大量的重金属进入大气、水、土壤之后，将会打破自然的生态平衡。同时通过水循环、大气循环、以及食物链等，重金属最终会在我们人体中富集，威胁到人类的身体健康。重金属污染与其他环境污染物不同，重金属污染很难在环境中自然降解，因此，如何将重金属从环境中富集回收，是解决重金属污染问题的关键所在。

在众多重金属污染中，镉污染情况最为严重。工业废气是镉污染的主要来源，通过降雨，大气中的镉便会积累在土壤中。由于电镀，采矿等工业废水的排放，灌溉水也被污染，进而累积到了土壤中。再者农田中施用的一些含镉的化肥，这些也会污染土壤。现有技术中通常采用物理化学方法对污水中的镉进行处理，常用方法有沉淀法、吸附法、高分子捕集剂法、离子交换法等等，但是极易造成二次污染。

莱茵衣藻是一种单细胞真核生物，具有吸附重金属的能力。衣藻吸附重金属过程主要分为生物吸附和生物累积，前者是细胞壁物理吸附过程，后者则是细胞生理代谢的累积过程。相对于传统的废水处理方法而言，衣藻具有环保、经济和高效等优点。

技术实现要素：

本发明提供一种莱茵衣藻重金属镉吸附突变体的筛选方法，基于上述技术问题，达到了提供能够简单、高效地获得大量的衣藻重金属镉吸附突变体技术效果。

为解决上述技术问题，本发明提供一种莱茵衣藻重金属镉吸附突变体的筛选方法，所述筛选方法包括：

根据不同氯化镉浓度对莱茵衣藻生长的影响，选择合适的重金属镉吸附突变体筛选浓度；

电击转化获得莱茵衣藻突变体；

筛选出莱茵衣藻重金属镉吸附突变体；所述筛选出莱茵衣藻重金属镉吸附突变体，包括：筛选重金属镉敏感型突变体和筛选重金属镉抗性突变体；

鉴定筛选出的莱茵衣藻重金属镉吸附突变体的突变基因。

优选的，所述根据不同氯化镉浓度对莱茵衣藻生长的影响，选择合适的重金属镉吸附突变体筛选浓度，包括：

培养莱茵衣藻；

配置固体tagp氯化镉浓度呈梯度的培养基；

将培养好的莱茵衣藻分别置于所述固体tagp氯化镉浓度呈梯度的培养基中，根据莱茵衣藻在不同浓度呈梯度的培养基中的生长状况，选择重金属镉敏感型突变体筛选浓度和重金属镉抗性突变体筛选浓度。

优选的，所述配置固体tagp氯化镉浓度呈梯度的培养基，具体为：

向tagp中加入不同浓度梯度的氯化镉，具体浓度为0mm,、0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1.0mm。

优选的，所述根据莱茵衣藻在不同浓度呈梯度的培养基中的生长状况，选择重金属镉敏感型突变体筛选浓度和重金属镉抗性突变体筛选浓度，具体为：

将培养好的野生型莱茵衣藻21gr分别滴在不同氯化镉浓度梯度tagp固体培养基上，培养五天后，观察记录，根据具体结果，选取0.4mm氯化镉作为用于筛选重金属镉敏感型突变体的筛选浓度和0.6mm氯化镉作为用于筛选重金属镉抗性突变体的筛选浓度。

优选的，所述电击转化获得莱茵衣藻突变体，包括：

制备aphⅷ目的片段；

配备经过过滤除菌的0.4％peg6000和以tap为基础的培养基和预设细胞浓度的莱茵衣藻；

制备莱茵衣藻感受态细胞；

电击获得莱茵衣藻突变体；

细胞涂板；

挑取细胞转化子。

优选的，所述制备aphⅷ目的片段，具体包括：

通过构建的质粒pjmg-aphⅷ，所述质粒pjmg-aphⅷ含有paro抗生素筛选的dna片段(aphⅷ)；采用ecorⅰ酶切，胶回收aphⅷ片段；

预设细胞浓度的莱茵衣藻包括：将莱茵衣藻21gr在tap吹气瓶中培养至对数期后，转接到200ml的三角瓶中，置于摇床培养8-16小时，以200rpm的转速并连续光照；直至细胞浓度为4x10⁶cells/ml。

优选的，所述电击获得莱茵衣藻突变体，包括：

在电击杯中加入250ul衣藻感受态细胞和aphⅷ目的片段100-200ng；在电击仪btxecm630进行电击，电击最佳时间为10ms到14ms；电击完毕后，立即将电击杯放置冰上，静置5-10min；其中，在制备衣藻感受态细胞和电击转化过程中，需要保持细胞处于无菌状态。

优选的，所述鉴定筛选出的莱茵衣藻重金属镉吸附突变体的突变基因，包括：

利用resda-pcr技术获取插入片段及其侧翼dna；

获取侧翼基因信息。

优选的，所述利用resda-pcr技术获取插入片段及其侧翼dna，具体包括：所述resda-pcr其中一端的引物由简并性引物，一段特定序列q0和四种限制性内切酶特异识别序列组成；另一端是以插入片段上的一段序列作为引物；对resda-pcr两端的引物进行扩增，得到大量带有限制性内切酶序列和插入片段上特定序列q0组合的扩增产物，将所述扩增产物稀释25倍作为模板，以特定序列q0和插入片段上已有序列作为引物，进行第二轮扩增，得到的扩增产物包含插入片段及其侧翼基因。

优选的，所述获取侧翼基因信息，具体包括：

所述扩增产物经过dna电泳跑胶后，切胶回收500bp以上的片段，进行测序；

将测序结果与插入片段进行序列比对，鉴定出扩增产物是否包含插入片段；

查询插入片段以外的序列，获得突变基因序列。

本申请有益效果如下：

(1)本发明提供的一种莱茵衣藻重金属镉吸附突变体的筛选方法，步骤简单、筛选效率高。

(2)所述筛选方法中鉴定出的重金属镉吸附突变体筛选浓度0.4mm和0.6mm，能够快速、准确的筛选出重金属镉敏感型突变体和重金属镉抗性突变体。

(3)所述筛选方法中通过resda-pcr可以鉴定出突变基因及插入突变位点，用于研究衣藻重金属镉代谢机制。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例。

图1为本申请一较佳实施方式一种莱茵衣藻富硒中突变体的筛选方法的流程图；

图2为本申请中不同氯化镉浓度对莱茵衣藻生长的影响的生长状态；

图3为本申请pjmg-aphⅷ质粒经ecorⅰ酶切后电泳图；

图4为本申请中野生型21gr和重金属镉敏感型突变体cb27经0.4mm氯化镉筛选第一天和第五天以及第十四天的对照图；

图5为本申请中野生型21gr和重金属镉抗性突变体cb14经0.6mm氯化镉筛选第一天和第三天以及第五天的对照图；

图6为本申请重金属镉敏感型突变体cb27的resda-pcr电泳图；

图7为本申请重金属镉抗性突变体cb14的resda-pcr电泳图。

具体实施方式

为了更好的理解上述技术方案，下面将结合说明书附图以及具体的实施例对上述技术方案进行详细的说明。

本申请提供的一种莱茵衣藻重金属镉吸附突变体的筛选方法，请参阅图1，所述筛选方法包括：

步骤s100，根据不同氯化镉浓度对莱茵衣藻生长的影响，选择合适的重金属镉吸附突变体筛选浓度；

具体的，所述步骤s100中所述根据不同氯化镉浓度对莱茵衣藻生长的影响，选择合适的重金属镉吸附突变体筛选浓度，包括：

步骤s110，培养莱茵衣藻；

所述步骤s110中所述培养莱茵衣藻，具体为：

采用的莱茵衣藻21gr，在tap培养液中进行培养，在持续光照条件下吹气培养四天后，21gr进入对数期。

步骤s120，配置固体tagp氯化镉浓度呈梯度的培养基；

所述配置固体tagp氯化镉浓度呈梯度的培养基，具体为：

向tagp中加入不同浓度梯度的氯化镉，具体浓度为0mm,、0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1.0mm。

所述tagp培养基具体是以正常的tap固体培养基(其中琼脂为1.5％)为基础，将无机磷酸盐按比例换成甘油磷酸，以配置好tagp培养基。其中tagp具体配方如下：

tagp固体培养基配方：

按顺序加各组分，最后加蒸馏水定容至500ml即可。

步骤s130，将培养好的莱茵衣藻分别置于所述固体tagp氯化镉浓度呈梯度的培养基中，根据莱茵衣藻在不同浓度呈梯度的培养基中的生长状况，选择重金属镉敏感型突变体筛选浓度和重金属镉抗性突变体筛选浓度。

具体的，所述步骤s130将培养好的野生型莱茵衣藻21gr分别滴在不同氯化镉浓度梯度tagp固体培养基上，培养五天后，观察记录，具体结果请参阅图2。根据具体结果，选取0.4mm氯化镉(用于筛选重金属镉敏感型突变体)和0.6mm氯化镉(用于筛选重金属镉抗性突变体)作为筛选浓度。

步骤s200，电击转化获得莱茵衣藻突变体；

所述步骤s200中所述电击转化获得莱茵衣藻突变体，包括：

步骤s210，制备aphⅷ目的片段通过构建的质粒pjmg-aphⅷ，所述质粒pjmg-aphⅷ含有paro抗生素筛选的dna片段(aphⅷ)。采用ecorⅰ酶切，胶回收aphⅷ片段酶切后电泳结果请参阅图3。

步骤s220，配备经过过滤除菌的0.4％peg6000和以tap为基础的培养基和预设细胞浓度的莱茵衣藻；

其中，所述步骤s220中所述以tap为基础的培养基具体包括：

tap液体培养基、含60mm山梨醇的tap液体培养基、含paro抗性的tap固体培养基；

预设细胞浓度的莱茵衣藻包括：将莱茵衣藻21gr在tap吹气瓶中培养至对数期后，转接到200ml的三角瓶中，置于摇床培养8-16小时，以200rpm的转速并连续光照；直至细胞浓度为4x10⁶cells/ml。

步骤s230，制备莱茵衣藻感受态细胞；

所述步骤s230制备莱茵衣藻感受态细胞，具体包括：

离心获取步骤s220中培养好的衣藻细胞，温度23-26℃，转速2500rpm，时间3min；经过tap液体培养基重悬后，以相同参数进行第二次离心；加入少量tap重悬，使得细胞最终体积为(m+1)×250ul(m为转化个数)；冰上放置10min，制备莱茵衣藻感受态细胞。

所述步骤s230还包括提前将电击杯进行预冷处理。

步骤s240，电击获得莱茵衣藻突变体；

所述步骤s240具体为：在电击杯中加入250ul衣藻感受态细胞和aphⅷ目的片段(100-200ng)。在电击仪btxecm630进行电击，电击最佳时间为10ms到14ms；电击完毕后，立即将电击杯放置冰上，静置5-10min。另外，在制备衣藻感受态细胞和电击转化过程中，需要保持细胞处于无菌状态。

步骤s250，细胞涂板；

所述步骤s250具体包括：

将电击转化后的细胞转移到10-15mltap+60mm山梨醇培养基中，采用锡箔纸进行避光过夜修复，其中，修复过程在摇床中进行，转速1000rpm/min，温度24℃；

经过夜修复后，以转速2500rpm，离心3min收集细胞；加入淀粉重悬至3ml后，在tap+paro的固体培养基的中加1ml细胞进行涂板。

其中，所述淀粉重悬具体方法包括：

在50ml的离心管中称取4g淀粉，无水乙醇洗一遍，离心1000rpm，2min；倒掉上清，蒸馏水洗两遍，离心；

70％乙醇重悬定体积到20ml，室温放置(可制备多管备用)；

准备涂板前，将上述淀粉和乙醇混合液摇晃均匀，根据所需量量取；

离心1000rpm，1min，重悬到相应体积的tap+山梨醇60mm+peg60000.4％。

步骤s260，挑取细胞转化子。

所述步骤s260具体包括：

将涂板后的细胞，在14h光照/10小时黑暗条件下培养五天后，长出细胞转化子；将细胞转化子转移到tagp固体培养基上保种，并进行编号。

步骤s300，筛选出莱茵衣藻重金属镉吸附突变体；

所述步骤s300中所述筛选出莱茵衣藻重金属镉吸附突变体，包括：

步骤s310，筛选重金属镉敏感型突变体；

所述步骤s310中所述筛选重金属镉敏感型突变体包括：

步骤s311，突变体的筛选；

所述步骤s311具体为根据步骤二s200中步骤s260中tagp固体培养基上保种并进行编号的细胞转化子，挑取到用于筛选重金属镉敏感型突变体的筛选浓度tagp的固体培养基上，优选的，选取浓度0.4mm氯化镉的tagp固体培养基。以野生型21gr作为对照，筛选重金属镉敏感型突变体。在培养板中，重金属镉敏感型突变体相对于野生型藻株死得更快。

步骤s312，突变体的复筛；

所述步骤s312具体为将已经筛出的突变体进行复筛。复筛确定后，便在tagp或tap固体培养基中进行保种，得到了敏感型突变体cb27，请参阅图4。

步骤s320，筛选重金属镉抗性突变体。

所述步骤s320中所述筛选重金属镉抗性突变体，具体包括

步骤s321，突变体的筛选

所述步骤s321具体为根据步骤二s200中步骤s260中tagp固体培养基上保种并进行编号的细胞转化子，挑取到用于筛选重金属镉抗性突变体的筛选浓度tagp的固体培养基上，优选的，选取浓度0.6mm氯化镉的tagp固体培养基。以野生型21gr作为对照，筛选重金属镉抗性突变体。在培养板中，重金属镉抗性突变体相对于野生型藻株存活时间更久。

步骤s322，突变体的复筛

所述步骤s322具体为将已经筛出的突变体进行复筛。复筛确定后，便在tagp或tap固体培养基中进行保种，得到了抗性突变体cb14，请参阅图5。

步骤s400，鉴定筛选出的莱茵衣藻重金属镉吸附突变体的突变基因。

所述鉴定筛选出的莱茵衣藻重金属镉吸附突变体的突变基因，包括：

利用resda-pcr技术获取插入片段及其侧翼dna；

所述利用resda-pcr技术获取插入片段及其侧翼dna，具体包括：所述resda-pcr其中一端的引物由简并性引物，一段特定序列q0和四种限制性内切酶特异识别序列组成；另一端是以插入片段上的一段序列作为引物；对resda-pcr两端的引物进行扩增，得到大量带有限制性内切酶序列和插入片段上特定序列q0组合的扩增产物，将所述扩增产物稀释25倍作为模板，以特定序列q0和插入片段上已有序列作为引物，进行第二轮扩增，得到的扩增产物包含插入片段及其侧翼基因。

获取侧翼基因信息。

所述获取侧翼基因信息，具体包括：

请参阅图6和图7，所述扩增产物经过dna电泳跑胶后，切胶回收500bp以上的片段，进行测序；其中图6和图7中m是markerⅲ，1，2，3，4，分别代表引物中分别包含四种限制性内切酶(alui,psti,sacii,和taqi)序列的扩增产物。

将测序结果与插入片段进行序列比对，鉴定出扩增产物是否包含插入片段；

通过测序和比对插入片段以外的序列，获得突变基因序列。

本申请实施例获得的重金属镉敏感型突变体cb27和抗性突变体cb14经resda-pcr鉴定，突变基因分别为fap和srrg，cdna序列如下。

fapcdna序列：

atgagtacgaaggaggagaagccgacacttgctggcgttaacgtcaagacccgcaagcggaacatcgttatccctgaggatccgggctcgtttgccgatgcgatcgtgacgctgtgccaggacgcggcgtcagatgacggttcggccggcctcgaggcggacctcgaggcggccgctaaggcgctcgacggcgcggagctagagtactcccgctatggcgatgtgctcttccaggtctttttcgcgggtggccgcttgggaacgggcgcgcagctggcggcggaggacaagatgcgcctcgcgaccaacattctggccgctgaggcaacccgggaagccatcaacccctacttcaagctgttccagacgctcacgcgccgccgccccttcctgatccgcggcctggagaacacgctggtgaagctgatgctgtcgctggagttcttcgacgacgtcggccgcaagaagctggggattgccctggcgctgacgttctcgtggaagatcggcgtggtgcccggcaacatcttcgcggcgctgctgaatgaccgcctggtggccaagggcacggtcctggaggtcatgattgtgttcttccaggagttcctggccaaggacaccacgctggacgacctggtgtccatcctggccaaggccaacatcgccaaccgcctgatggacttcgcgccgcccaacaagcgcacgccgcacgagtatcacctggtgctcaaggccgctggcctgaactcgctggtggagtgggacgtgcagcgcgagattgacttgcgcgtcagcgagctgcaggacgcgctgacggaggccatcgccgccgacccgccgctggcggtgtccgaggtgctcaacatcgccaagtccaagaagcaggagagcaacctgcccgacggcgaggtgctgcgcgtgtcgtggctggcgctgatgaagtccatcaacctgacgggcaagaaccagcagcagatcacgcaggccctgatgcagaagctcaagtcgcacggcaagctgtttgcgaccttcgccaccaacgccaaggcggagctggcgctgctgaacaccatccaggtgttctgctacgaggacacgcgcatgctcaagtgcttcaccgatatcatgaagctgctgtacaacgcggagattgtgggcgaggacaccatccagcactggtacaagaagggcagccacaccaagggacgcgccgtgttcctgaaggacatcgagcccttcatgaagtggctggaggaggcggaggaggacgacgagtag

srrgcdna序列：

atgtcgtatgcgtacctcttcaagtacattattattggcgacacaggtgttggcaagtcatgcctcctgctccagttcaccgacaagcgcttccagccagtgcacgacttgaccattggcgtggagtttggcgctcgcatgatcaacattgacgggaaacagattaagctgcaaatttgggacacggctgggcaagagtcgttccgttcaatcactcgctcttattaccgcggcgcagcgggcgcgctacttgtgtatgatatcacgcggcgcgagaccttcaaccacctggcgagttggcttgaagacgcgcgtcagcacgccaaccccaacatgaccattatgctcatcggcaacaagtgcgacctcacgcaccggcgcgcggtgaccacggaggagggcgagcagttcgccaaggagcacggcctcatcttcctggagacctcggcgcggacggcccacaacgtggaggaggcgttcatcaacaccgcgaaggagatttacaagaagatccaggacggcgtgttcgacgtgtccaacgagtcgtacggtatcaaggtgggctacggcgccggcaacgccgggccgcagacggtcaagcccggcgagggcggtgccgccaagtccagcagctgctgctga

本申请有益效果如下：

(1)本发明提供的一种莱茵衣藻重金属镉吸附突变体的筛选方法，步骤简单、筛选效率高。

(2)所述筛选方法中鉴定出的重金属镉吸附突变体筛选浓度0.4mm和0.6mm，能够快速、准确的筛选出重金属镉敏感型突变体和重金属镉抗性突变体。

(3)所述筛选方法中通过resda-pcr可以鉴定出突变基因及插入突变位点，用于研究衣藻重金属镉代谢机制。

最后所应说明的是，以上具体实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照实例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表1（fap）

<110>江汉大学

<120>一种莱茵衣藻重金属镉吸附突变体的筛选方法

<130>2010

<160>1

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1278

<212>dna

<213>fap

<400>1

atgagtacgaaggaggagaagccgacacttgctggcgttaacgtcaagacccgcaagcgg60

aacatcgttatccctgaggatccgggctcgtttgccgatgcgatcgtgacgctgtgccag120

gacgcggcgtcagatgacggttcggccggcctcgaggcggacctcgaggcggccgctaag180

gcgctcgacggcgcggagctagagtactcccgctatggcgatgtgctcttccaggtcttt240

ttcgcgggtggccgcttgggaacgggcgcgcagctggcggcggaggacaagatgcgcctc300

gcgaccaacattctggccgctgaggcaacccgggaagccatcaacccctacttcaagctg360

ttccagacgctcacgcgccgccgccccttcctgatccgcggcctggagaacacgctggtg420

aagctgatgctgtcgctggagttcttcgacgacgtcggccgcaagaagctggggattgcc480

ctggcgctgacgttctcgtggaagatcggcgtggtgcccggcaacatcttcgcggcgctg540

ctgaatgaccgcctggtggccaagggcacggtcctggaggtcatgattgtgttcttccag600

gagttcctggccaaggacaccacgctggacgacctggtgtccatcctggccaaggccaac660

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gacggcgaggtgctgcgcgtgtcgtggctggcgctgatgaagtccatcaacctgacgggc960

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aacgcggagattgtgggcgaggacaccatccagcactggtacaagaagggcagccacacc1200

aagggacgcgccgtgttcctgaaggacatcgagcccttcatgaagtggctggaggaggcg1260

gaggaggacgacgagtag1278

序列表2（srrg）

<110>江汉大学

<120>一种莱茵衣藻重金属镉吸附突变体的筛选方法

<130>2010

<160>1

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>642

<212>dna

<213>srrg

<400>1

atgtcgtatgcgtacctcttcaagtacattattattggcgacacaggtgttggcaagtca60

tgcctcctgctccagttcaccgacaagcgcttccagccagtgcacgacttgaccattggc120

gtggagtttggcgctcgcatgatcaacattgacgggaaacagattaagctgcaaatttgg180

gacacggctgggcaagagtcgttccgttcaatcactcgctcttattaccgcggcgcagcg240

ggcgcgctacttgtgtatgatatcacgcggcgcgagaccttcaaccacctggcgagttgg300

cttgaagacgcgcgtcagcacgccaaccccaacatgaccattatgctcatcggcaacaag360

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cccggcgagggcggtgccgccaagtccagcagctgctgctga642