新型澳洲坚果过敏原的制作方法
本发明涉及一种多肽，其包括选自包含下列蛋白质的组的澳洲坚果蛋白：在ph6.3至8.7于2dsdspage中电泳的53至67kda的蛋白质和在ph6.5至7.9于2dsdspage中电泳的20至25kda的蛋白质或其抗原变体，优选在ph6.3至8.7电泳的53至67kda的蛋白质或其抗原变体。
对树坚果的过敏反应可以是严重的和危及生命的。这适用于常见的品种，例如榛子，花生，核桃，也适用于澳洲坚果，其为澳大利亚常青树(四叶澳洲坚果(macadamiatetraphylla)和澳洲坚果(m.integrifolia))的果实。
澳洲坚果(就植物学而言，其是种子)不像许多其它树坚果一样是常见的食物，但其越来越频繁地被生吃或烘焙食用，并且常常被添加至各种食物例如小吃棒、谷物和混合坚果。碎澳洲坚果膳食正在成为烘焙食品中日益流行的成分，冷压澳洲坚果油亦如此。绝非少数情况的是，澳洲坚果常常可用作坚果混合物的一部分，并因此在先前不进口其的国家中销售。
在敏化个体中因暴露于澳洲坚果而引起的过敏反应可包括严重的症状(pallares,d.e.(2000):allergytomacadamianut.annallergyasthmaimmunol2000；85(5):385-6)。因此，患有过敏的受试者知晓过敏原的来源是至关重要的，因为他们需要避免接触含有任何过敏原或已接触过任何过敏原的食品、化妆品和其它产品。
过敏可以使用常规皮肤点刺试验来诊断，所述试验涉及将怀疑患有过敏的受试者的皮肤暴露于潜在致敏性果实的提取物，并用合适的对照进行补充。然而，假阴性结果经常发生，因为某些过敏原可能以不足够低的浓度存在于这些提取物中(sicherer,s.h.,teuber,s.s.(2004):currentapproachtothediagnosisandmanagementofadversereactionstofoods.journalofallergyandclinicalimmunology2004；114.5,1146–50)。另外，特定的过敏原可以在提取物中进行蛋白水解(rancé,f.,juchet,a.,brémont,f.,dutau,g.(1997):correlationbetweenskinpricktestsusingcommercialextractsandfreshfoods,specificigeandfoodchallenges.allergy1997；52.10,1031–5)。此外，基于全提取物的测定由于交叉反应性而不够特异。
因此，期望基于针对特异性过敏原的抗体例如ige或igg的检测来设计测定。这样的测定涉及将包含抗体的患者样品暴露于固定化的过敏原，随后进行检测，任选地定量结合至固定化的过敏原的ige抗体(volcheck,g.w.(2009):clinicalallergy,diagnosisandmanagement)。
主要过敏原已在一系列坚果中被鉴定。例如，花生过敏的绝大多数病例与对储存蛋白arah2、arah7和arah6的敏感性相关。因此，已经设计了基于针对这些过敏原的ige抗体的检测的合理可靠的测定(codreanu,f.,collignon,o.,roitel,o.,thouvenot,b.,sauvage,c.,vilain,a.c.,cousin,m.o.,decoster,a.,renaudin,j.m.,astier,c.,monnez,j.m.,vallois,p.,morisset,m.,moneret-vautrin,d.a.,brulliard,m.,ogier,v.,castelain,m.c.,kanny,g.,bihain,b.e.,jacquenet,s.(2011):anovelimmunoassayusingrecombinantallergenssimplifiespeanutallergydiagnosis.intarchallergyimmunol2011；154(3):216-26；ep15075033.9)。
相比之下，关于澳洲坚果过敏原的身份的信息非常少。迄今为止，描述用于诊断澳洲坚果过敏的免疫测定的现有技术文献的作者必须依赖于全坚果提取物或部分纯化的提取物。例如，ghorbani等人进行了基于检测食品中残留的澳洲坚果蛋白质的免疫测定(ghorbani,m.,morgan,m.r.a.(2010):proteincharacterisationandimmunochemicalmeasurementsofresidualmacadamianutproteinsinfoodstuffs.foodagrimmunol2010；21:347-360)。
herbst等人使用来自引起患者显示过敏症状的单一批次的澳洲坚果的全坚果提取物(herbst,r.a.,wahl,r.,frosch,p.j.(2010):specificigereactivityandidentificationofpotentialallergensinmacadamiaallergy.jeuracaddermatolvenereol2010；24(11):1361-3)。
sathe等人报道了从包括澳洲坚果的各种树坚果制备的全提取物的溶解并将其用于western印迹中(sathe,s.k.,venkatachalam,m.,sharma,g.m.,kshirsagar,h.h.,teuber,s.s.,roux,k.h.(2009):solubilizationandelectrophoreticcharacterizationofselectediblenutseedproteins.jagricfoodchem2009；57(17):7846-56)。
在缺乏特异性过敏原的情况下，提供足够可靠的诊断是不可行的。全坚果提取物或部分纯化的提取物与类似于皮肤点刺试验的缺点的限制(例如不稳定性和不足的特异性，更具体地说是假阴性结果)有关。
因此，本发明涉及的问题是提供一种用于诊断过敏，优选坚果过敏，更优选澳洲坚果过敏的方法，以及用于这样的方法的试剂，相较于现有技术测定，所述方法具有改善的诊断可靠性(特别是灵敏度)。
本发明涉及的另一个问题是提供用于鉴别诊断过敏，优选坚果过敏例如树坚果过敏的测定，更优选用于区分对澳洲坚果的过敏与对非澳洲坚果的坚果的过敏的测定，和/或用于监测患有这种过敏的个体的治疗。
本发明涉及的另一个问题是提供可用于这样的测定的试剂，用于制备这样的试剂的方法和用于这样的诊断的方法。本发明涉及的另一个问题是提供用于治疗患有对澳洲坚果的过敏的患者的治疗方法和药物组合物。
本发明涉及的问题通过所附的独立和从属权利要求的主题来解决。
在第一方面，本发明涉及的问题通过一种多肽来解决，所述多肽包括选自包含下列蛋白质的组的澳洲坚果蛋白：在ph6.3至8.7于2dsdspage中电泳的53至67kda的蛋白质和在ph6.5至7.9于2dsdspage中电泳的20至25kda的蛋白质或其变体，优选在ph6.3至8.7电泳的53至67kda的蛋白质或其变体。所述多肽是来自四叶澳洲坚果(macadamiatetraphylla)和澳洲坚果(m.integrifolia)优选澳洲坚果的多肽。
在优选的实施方案中，多肽是分离的和/或重组的多肽。
在另一个优选的实施方案中，多肽是融合多肽，其优选包含用于检测或纯化的标签。
在第二方面，该问题通过一种核酸来解决，所述核酸编码根据本发明的多肽，其优选在载体中，更优选在细胞中的载体中。
在另一个优选的实施方案中，多肽是固定化的。
在第三方面，该问题通过一种医疗器械来解决，所述医疗器械包含根据本发明的多肽，其中所述医疗器械优选是诊断上有用的载体，更优选选自包含珠子、测试条、微量滴定板、印迹的组，优选选自包含蛋白质印迹、线印迹和斑点印迹、玻璃表面、载玻片、生物芯片、膜、微阵列、电泳凝胶和微量滴定板的组。
在第四方面，该问题通过包括以下步骤的方法来解决：在样品，优选来自哺乳动物，更优选来自人的样品中检测与根据本发明的多肽结合的抗体，所述方法优选用于诊断坚果过敏，更优选用于诊断澳洲坚果过敏。
在第五方面，该问题通过包括下列步骤的治疗疾病的方法来解决：向受试者施用或使来自受试者的样品接触根据本发明的多肽，
其中所述疾病优选是坚果过敏，更优选是树坚果过敏，最优选是澳洲坚果过敏。
在第六方面，该问题通过一种抗体来解决，所述抗体结合选自包含下列蛋白质的组的澳洲坚果蛋白：在ph6.3至8.7于2dsdspage中电泳的53至67kda的蛋白质和在ph6.5至7.9于2dsdspage中电泳的20至25kda的蛋白质或其变体，
优选在ph6.3至8.7电泳的53至67kda的蛋白质，
其中任选地所述抗体处于与所述澳洲坚果蛋白或其变体的复合物中。在优选的实施方案中，结合澳洲坚果蛋白的抗体是分离的抗体。
在第七方面，该问题通过用于诊断疾病的测试试剂盒来解决，所述试剂盒包含根据本发明的多肽和任选地用于检测包含所述多肽和根据本发明的抗体的复合物的工具。
在第八方面，该问题通过用于分离抗体的方法来解决，所述抗体结合选自包含下列蛋白质的组的澳洲坚果蛋白：在ph6.3至8.7于2dsdspage中电泳的53至67kda的蛋白质和在ph6.5至7.9于2dsdspage中电泳的20至25kda的蛋白质或其抗原性片段，所述方法包括下列步骤：
a)在适于形成复合物的条件下，使包含所述抗体的样品与澳洲坚果蛋白或其变体接触，
b)分离在步骤a)中形成的复合物，
c)解离在步骤b)中分离的复合物，和
d)使澳洲坚果蛋白与所述抗体分离。
在第九方面，该问题通过一种药物组合物或疫苗来解决，所述药物组合物或疫苗包含根据本发明的多肽，任选地另外包含药学上可接受的载物。
在优选的实施方案中，所述样品是包含抗体的体液，所述体液优选选自包含全血、血清、脑脊液和唾液的组，更优选为全血。
在优选的实施方案中，所述抗体是ige或igg，例如igg4，优选ige抗体。
在第十面，该问题通过根据本发明的多肽用于诊断过敏，优选坚果过敏，更优选树坚果过敏，最优选澳洲坚果过敏的用途来解决。
本发明基于本发明人的令人惊讶的发现：在澳洲坚果中存在一系列特异性过敏原，其显示针对来自患有坚果过敏的患者的血清的反应性，并且可用于诊断和治疗坚果过敏，特别是澳洲坚果过敏。此外，这些过敏原可用于区分坚果过敏，特别是区分对澳洲坚果的过敏与对非澳洲坚果的坚果的过敏。就发明人所知，这些抗原在本领域的现有技术中还没有被描述。
在优选的实施方案中，本文所用的术语“树坚果”是选自包含以下的组的坚果：澳洲坚果，榛子，花生，核桃，杏仁，美洲山核桃，腰果，巴西坚果，栗子，松子，开心果，mongongoyeheb坚果，石栗和智利榛子。
本发明涉及诊断上有用的载体，优选为固相载体，用于使特异性捕获抗体的工具(所述工具与所述载体缔合)与来自受试者，优选哺乳动物受试者，更优选人受试者的体液样品接触。载体可以直接与样品接触，并且允许用于特异性捕获抗体的工具暴露于样品中的任何抗体。在优选的实施方案中，固相载体是诊断装置，更优选选自包含珠子、测试条、微量滴定板、印迹的组，优选选自包含蛋白质印迹、线印迹和斑点印迹、玻璃表面、载玻片、生物芯片、膜、微阵列、电泳凝胶和微量滴定板的组。
在最优选的实施方案中，诊断上有用的载体是线印迹(raoult,d.,anddasch,g.a.(1989),thelineblot:animmunoassayformonoclonalandotherantibodies.itsapplicationtotheserotypingofgram-negativebacteria.j.immunol.methods,125(1-2),57-65；wo2013041540)。在优选的实施方案中，本文所用的术语“线印迹”是指已用一种或多种用于捕获抗体的工具(优选各自为多肽)包被的测试条，更优选是基于膜的。如果使用两种或更多种工具，则它们优选在载体上是在空间上分离的。优选地，带的宽度为测试条的宽度的至少30％，更优选地40％，50％，60％，70％或80％。测试条可以包含一个或多个对照带，用于确认其已在适当的条件下，特别是在存在人血清、抗体缀合物或两者的情况下，与样品接触足够长的时间。许多线印迹可商购获得，例如获自euroimmunag,lübeck,germany。
必要的是，用于实施本发明的样品包含抗体，也称为免疫球蛋白。通常，样品是包含受试者的全部免疫球蛋白的代表性集合的体液。然而，在提供样品后，样品可以经历进一步的处理，这可包括分级分离、离心、富集或分离受试者的全部免疫球蛋白或任何免疫球蛋白类别，优选ige和/或igg4，这可影响各种类型的免疫球蛋白的相对分布。样品可以选自全血、血清、脑脊液和唾液，优选血清。在最优选的实施方案中，样品包含ige类抗体。
必要的是，诊断上有用的载体包含用于特异性捕获针对在ph6.3至8.7于2dsdspage中电泳的53至67kda的澳洲坚果蛋白或在ph6.5至7.9于2dsdspage中电泳的20至25kda的澳洲坚果蛋白(优选在ph6.3至8.7电泳的53至67kda的澳洲坚果蛋白)的抗体的工具，所述澳洲坚果蛋白已被本发明人鉴定为澳洲坚果豌豆球蛋白样蛋白(macadamiavicilin-likeprotein)(多肽的数据库登录码：q9spl3；编码所述蛋白质的核酸的数据库登录码：af161885)。本申请通篇中提及的任何数据库代码是指在本申请的优先权日时可通过ncbi数据库在线获得的多肽序列。
优选地，用于特异性捕获这样的抗体的这样的工具是一种多肽，其包括选自包含下列蛋白质的组的澳洲坚果蛋白：在ph6.3至8.7于2dsdspage中电泳的53至67kda的蛋白质或在ph6.5至7.9于2dsdspage中电泳的20至25kda的蛋白质或其变体，优选在ph6.3至8.7电泳的53至67kda的蛋白质或其变体。
根据本发明，载体包括用于特异性捕获抗体的一种或多种工具，优选一种或多种，更优选两种或更多种，更优选三种或更多种，更优选四种或更多种这样的工具，它们中的每一种能够特异性捕获不同的抗体。除了用于捕获澳洲坚果蛋白(优选澳洲坚果豌豆球蛋白样蛋白(q9spl3))的工具以外，所述载体还可包括用于捕获针对一种或多于一种来自包含下列蛋白质的组的蛋白质的抗体的工具：seqidno3(来自榛子的cora11),seqidno4(来自芝麻(sesam)的sesi3),seqidno5(来自花生的arah1),seqidno6(来自开心果的pisv3),seqidno7(来自腰果的anao1),seqidno8(来自美洲山核桃的cari2),seqidno9(来自核桃的jugr2)；例如用于捕获针对seqidno3的抗体的工具和用于捕获针对seqidno4的抗体的工具。所述工具优选固定在所述载体上。在优选的实施方案中，用于特异性捕获抗体的工具是与待捕获的抗体结合的多肽或其变体，例如根据本发明的多肽或seqidno3(来自榛子的cora11),seqidno4(来自芝麻的sesi3),seqidno5(来自花生的arah1),seqidno6(来自开心果的pisv3),seqidno7(来自腰果的anao1),seqidno8(来自美洲山核桃的cari2),seqidno9(来自核桃的jugr2)，例如用于捕获针对seqidno3的抗体的工具和用于捕获针对seqidno4的抗体的工具。所述工具与其附着至的不溶性载体一起可以以直接方式例如通过过滤、离心或倾析从反应混合物中分离。所述工具可以以可逆或不可逆的方式固定。例如，如果分子经由可以通过加入高浓度的盐掩蔽的离子相互作用与载体相互作用，或者如果分子通过可切割的共价键结合，则固定是可逆的。相比之下，如果分子通过不能在水溶液中裂解的共价键连接到载体上，则固定是不可逆的。所述工具(优选多肽)可以是间接固定的，例如通过固定对多肽具有亲和力的抗体或其它实体，然后加入多肽并形成多肽-抗体复合物。
然而，本发明的教导不仅可以使用具有本申请中明确或隐含提及(例如通过功能、名称、序列或登录号)的精确序列的多肽或野生型序列来执行，还可以使用这样的多肽的变体来执行。
在优选的实施方案中，如本文所用的术语“变体”可以指所提及的全长序列的至少一个片段，更具体地，相对于全长序列而言在一个或两个末端上截短一个或多个氨基酸的氨基酸或核酸序列。这样的片段包含或编码具有原始序列的至少10、15、25、50、75、100、150、200、300、400或500个连续氨基酸的肽或其变体。变体的总长度可以是25、30、40、50、60、70、80、90、100个或更多个氨基酸。优选的片段是seqidno：1或其变体。
变体可以与所提及的参考氨基酸序列或其片段具有至少40、50、60、70、75、80、85、90、92、94、95、96、97、98或99％的同一性，其中除了对生物活性必需的那些氨基酸之外的氨基酸被缺失或取代和/或一个或多个这样的必需氨基酸以保守方式被替换和/或氨基酸被添加或缺失以使得多肽的生物活性至少被部分保留。现有技术包括可用于比对两个给定的核酸或氨基酸序列和计算同一性程度的各种方法，参见例如arthurlesk(2008),introductiontobioinformatics,oxforduniversitypress,2008，第三版。在优选的实施方案中，使用clustalw软件(larkin,m.a.,blackshields,g.,brown,n.p.,chenna,r.,mcgettigan,p.a.,mcwilliam,h.,valentin,f.,wallace,i.m.,wilm,a.,lopez,r.,thompson,j.d.,gibson,t.j.,higgins,d.g.(2007):clustalwandclustalxversion2.0.bioinformatics,23,2947-2948)，应用默认设置。
在优选的实施方案中，变体可以另外包含化学修饰，例如同位素标记或共价修饰，例如糖基化，磷酸化，乙酰化，脱羧基化，瓜氨酸化，羟基化等。本领域技术人员熟悉用于修饰多肽的方法。此外，还可以通过与其它已知多肽或其变体融合来产生变体。
必要的是，多肽的变体具有生物活性。在优选的实施方案中，这样的生物活性是结合来自患者，优选患有过敏，更优选对坚果的过敏，最优选对澳洲坚果的过敏的患者的过敏特异性ige抗体的能力。在另一个优选的实施方案中，这样的生物活性是在对坚果，优选树坚果，更优选澳洲坚果过敏的受试者中引发过敏反应的能力。
本领域技术人员能够通过从原始澳洲坚果蛋白质开始，引入修饰点突变、截短等来设计变体，随后通过测试所述变体是否结合获自对澳洲坚果过敏的受试者的样品中的抗体来确认该变体仍然具有生物活性。
变体可以使用遗传工程方法或化学合成法制备。
可以通过蛋白质印迹，使用来自对澳洲坚果过敏的患者的血清(优选如实施例中所述的)作为抗体来源来确定结合活性。
根据本发明的多肽或其变体可以是融合蛋白，即任选通过接头与其它序列融合(优选在n末端或c末端上)的多肽。该其它序列可以是用于检测的标签，例如flag标签，或用于纯化的标签，例如选自包含gst、his或mbp标签的组。根据本发明的示例性融合多肽显示于seqidno：2中。
根据本发明的多肽可以以任何形式和以任何纯化程度提供，从以内源形式包含所述多肽的组织、果实或细胞、更优选过表达所述多肽的细胞、这样的细胞的粗制或富集的裂解物到纯化和/或分离的多肽(其基本上是纯的)。在优选的实施方案中，多肽是天然多肽，其中本文所用的术语“天然多肽”是指折叠的多肽，更优选从组织或细胞，更优选从哺乳动物细胞或组织，任选地从非重组组织或细胞纯化的折叠多肽。如果使用天然多肽，与其天然状态相比，优选是富集的。
根据本发明，多肽可以是重组蛋白，其中本文使用的术语“重组”是指在生产过程的任何阶段使用遗传工程方法产生的多肽，例如通过融合编码多肽的核酸至用于在细胞或组织中过表达的强启动子或通过工程改造多肽本身的序列和/或使用用于通过遗传工程修饰的细胞的表达。本领域技术人员熟悉用于工程改造核酸和编码的多肽的方法(例如，在sambrook,j.,fritsch,e.f.andmaniatis,t.(1989),molecularcloning,csh或brownt.a.(1986),genecloning–anintroduction,chapman&hall中描述的)以及用于产生和纯化天然或重组多肽的方法(例如由gehealthcarelifesciences出版的handbooks“strategiesforproteinpurification”,“antibodypurification”，以及在burgess,r.r.,deutscher,m.p.(2009):guidetoproteinpurification中描述的)。
在优选的实施方案中，术语“分离的”意指多肽相对于在整个坚果或从整个坚果获得的全坚果提取物中的全部澳洲坚果蛋白，优选澳洲坚果过敏原，已被富集。在另一个更优选的实施方案中，多肽是分离的多肽，其中术语“分离的”意指该多肽相较于其在使用生物技术或合成方法产生后的状态已被富集并且优选是纯的，即所使用的多肽的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％由所述多肽组成，如通过sds聚丙烯酰胺凝胶电泳随后考马斯蓝染色和目视检查所判断的。
根据本发明的受试者是产生抗体，优选ige类别或等同的过敏相关抗体，更优选来自哺乳动物，最优选人的抗体的动物，包括人。
根据本发明的方法考虑了在样品中检测与根据本发明的多肽结合的抗体，所述方法优选用于诊断坚果过敏，更优选用于诊断澳洲坚果过敏。本领域技术人员熟悉可用于检测样品中的抗体的各种方法，例如选自包括免疫扩散技术、通过ige抗体的嗜碱性粒细胞活化、免疫电泳技术、光散射免疫测定、凝集技术、标记的免疫测定例如放射性标记的免疫测定、酶免疫测定例如比色测定、化学发光免疫测定和免疫荧光技术的组。
在许多情况下，检测样品中的抗体的不存在或存在(任选地意指确定抗体的浓度是否超过某些阈值，常常通过检测限度显示)足以用于诊断。如果可以检测抗体，则这将是对临床医生的诊断有用的信息，并且表明患者患有过敏的可能性增加。在优选的实施方案中，可以测定血清中的抗体相对于可能在平均健康受试者中发现的水平的相对浓度。在优选的实施方案中，如本文所使用的术语“检测存在或不存在”意指足以核查是否可以使用合适的复合物检测方法检测足够超过任何背景水平的信号，所述复合物检测方法指示目标抗体存在或存在比在健康受试者中所存在的更多的目标抗体。在更优选的实施方案中，这可以包括确定浓度是否超过对照中的浓度或超过阈值，优选至少0.1，优选0.2、0.5、1、2、5、10、20、25、50、100，200、500、1000、10000或100000倍高于在平均健康受试者中发现的目标抗体的浓度。
简言之，检测抗体可以包括步骤a)在适于形成复合物的条件下，使包含抗体的样品与根据本发明的多肽或其变体接触。这可以通过使液体样品与固定化形式(例如被固定在膜上，例如在蛋白质印迹或线印迹中所使用的)的多肽接触来实现。当样品和多肽接触时，样品中存在的能够特异性结合多肽的任何抗体将进行这样的结合达到使包含多肽和抗体的复合物存在的效果。
随后，进行步骤b)，其包括分离在步骤a)中形成的所述复合物，例如通过除去样品和任选地使用洗涤缓冲液洗涤被固定的多肽来进行分离。
最后的步骤c)包括检测复合物，例如通过添加可结合来自样品的抗体的第二抗体来检测。第二抗体可以包含标记，例如酶或放射性同位素。或者，可以使用方法诸如化学交联随后sdspage或使用质谱法来直接检测复合物。
针对根据本发明的多肽的抗体的检测表明，供给样品的受试者对澳洲坚果过敏。在受试者表现出过敏反应，但这样的样品不含有针对本发明受试者的抗体的情况下，受试者可能患有过敏，例如坚果过敏，但对澳洲坚果不过敏。
在本发明的范围内的是诊断上有用的载体，其包含用于特异性捕获针对本发明多肽的抗体的工具。在优选的实施方案中，如本文所用的术语“特异性捕获抗体”是指特异性结合目标抗体达到从样品中结合和去除其而其它抗体基本上不结合并保留在样品中的效果的能力。
根据本发明，提供了用于特异性检测捕获的抗体的工具，任选地作为试剂盒的一部分。在优选的实施方案中，如本文所使用的术语“特异性检测捕获的抗体”意指在捕获后检测到特异性结合至特异性捕获抗体(其结合根据本发明的多肽)的工具的抗体，而不是样品中存在的任何其它抗体。在优选的实施方案中，如本文所用的术语“特异性结合”意指该结合比其特征在于下述解离常数的结合反应更强：1×10-5m，更优选1×10-7m，更优选1×10-8m，更优选1×10-9m，更优选1×10-10m，更优选1×10-11m，更优选1×10-12m，如通过表面等振子体共振使用biacore设备在25℃下在ph7的pbs缓冲液中测定的。
本发明的教导内容提供了试剂盒，其优选用于诊断过敏，更优选用于诊断澳洲坚果过敏。这样的试剂盒是包含实施本发明方法所需的特定试剂(特别是根据本发明的诊断上有用的载体，任选地除了实施本发明方法所需的一种或多种溶液之外，该溶液优选选自或全部选自包括样品稀释缓冲液、洗涤缓冲液和包含用于检测任何特异性捕获的抗体例如第二抗体的工具和任选地用于检测后者的工具的缓冲液的组)的容器。此外，其可以包括详述如何使用试剂盒和本发明的用于使本发明的多肽与来自受试者优选人受试者的体液样品接触的诊断上有用的载体(例如线印迹，其中将用于特异性捕获抗体至根据本发明的多肽的工具固定在线印迹上)的说明书。此外，试剂盒可以包含阳性对照，例如已知结合根据本发明的多肽的重组抗体，和阴性对照，例如对根据本发明的多肽没有可检测的亲和力的蛋白质。最后，这样的试剂盒可以包含含有用于制备校准曲线的抗体的标准溶液。
根据本发明，需要用于检测一种或多种捕获的抗体的工具。本领域技术人员知道可以使用的许多方法，所述方法也被描述在现有技术中，例如在zane,h.d.(2001),immunology–theoretical&practicalconceptsinlaboratorymedicine,w.b.saunderscompany中，特别是在第14章中描述的。在优选的实施方案中，使用结合一种或多种捕获的抗体(其是相应的第一抗体)的恒定区的第二抗体，所述第二抗体可以与直接检测例如荧光、放射性或酶活性标记(后者可以催化化学发光反应或可使用比色法或光谱或其它分析方法检测的分子的产生)的标记相关联。
或者，生物功能测定可用作检测一种或多种捕获的抗体的工具，条件是抗体是ige类抗体，优选基于通过ige抗体的嗜碱性粒细胞活化的测定。这样的测定法已经在现有技术中描述，例如hausmann,o.v.,gentinetta,t.,bridts,c.h.,andebo,e.g.(2009):thebasophilactivationtestinimmediate-typedrugallergy,immunol.allergyclin.n.am.29,555-566。
在优选的实施方案中，如本文所使用的术语“诊断”是指旨在获得在评估患者是否患有或可能或比平均或比较受试者(后者优选地具有相似的症状)更可能在诊断时或在未来患有某种疾病或病症的过程中有用的信息以发现疾病如何进展或在未来可能进展或评估患者对于某种治疗(例如施用合适的药物，例如用于使过敏患者脱敏的药物)的反应性的任何种类的程序。换句话说，术语“诊断”不仅包括诊断，而且包括预测和/或监测疾病或病症的过程或治疗的成功。优选检测igg(更优选igg4)类别的自身抗体用于监测疾病的进展和/或治疗的成功。
因此，术语“诊断”优选地不意味着根据本发明的诊断方法或试剂将是结论性的并且足以基于单一测试(更不用说参数)来完成诊断，而是可以指对被称为“鉴别诊断”(即基于一系列诊断参数考虑一系列可能条件的可能性的系统诊断程序)的贡献。术语“诊断”还可以指用于为患者选择最有希望的治疗方案的方法或试剂。换句话说，所述方法或药剂可涉及选择用于受试者的治疗方案。
本发明提供了包含根据本发明的多肽的药物组合物，优选疫苗，所述组合物优选适于施用至受试者，优选哺乳动物受试者，更优选施用至人。这样的药物组合物可以包含药学上可接受的载体。药物组合物可以例如经口、肠胃外、通过吸入喷雾、局部地、通过滴眼剂、经直肠、经鼻、经口腔、经阴道或经由植入的储库施用，其中本文所用的术语“肠胃外”包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内和颅内注射或输注技术。药物组合物可以以合适的剂型提供，例如胶囊、片剂和水性悬浮液和溶液，优选为无菌形式。其可用于治疗疾病优选过敏的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本发明的多肽。可以使用根据本发明的多肽的低过敏原性变体。本领域技术人员熟悉用于产生已知过敏原的低过敏原性变体的方法。
本发明提供了用于通过向受试者施用本发明的药物组合物治疗、预防或改善过敏，优选坚果过敏，更优选澳洲坚果过敏的方法。
通过以下附图和非限制性序列和实施例进一步说明本发明，从中可以获得本发明的其它特征、实施方案、方面和优点。
附图描述
图1显示了澳洲坚果提取物的2d凝胶电泳分离的结果。在ph3-10非线性ipg条上在第一维中分离，随后在还原条件下通过sdspage分离蛋白质，通过考马斯染色进行染色并从凝胶中切出。数字标记随后进行maldi-tof分析的点。箭头标记代表后续被鉴定为澳洲坚果豌豆球蛋白样蛋白的蛋白质的条带。
图2显示了澳洲坚果提取物的蛋白质印迹分析和通过2d凝胶电泳分离的蛋白质的蛋白质印迹的结果。分子量标记与图1所示相同。
图3显示了使用涂覆有来自澳洲坚果的豌豆球蛋白样蛋白的euroline品系测定法对来自澳洲坚果致敏患者(n＝20)和健康献血者(n＝17)的人血清的分析。基于east参考系统进行来自人血清的结合抗体的评价。
图4a至4g显示了比较数据，其指示如使用线印迹测定的来自所述患者的血清中以east类别形式表达的ige浓度。这些图显示了针对来自非澳洲坚果的树坚果的一种树坚果或核7s豌豆球蛋白样蛋白的ige与针对来自澳洲坚果的maci豌豆球蛋白的ige之间的相关性(如果有的话)。
本申请包括多个氨基酸序列，更具体地，包括：
seqidno1(优选澳洲坚果豌豆球蛋白样蛋白(q9spl3)的片段)
seqidno2(包含澳洲坚果豌豆球蛋白样蛋白的融合蛋白)
seqidno3(来自榛子的cora11),
seqidno4(来自芝麻的sesi3),
seqidno5(来自花生的arah1),
seqidno6(来自开心果的pisv3)
seqidno7(来自腰果的anao1)
seqidno8(来自美洲山核桃的cari2)
seqidno9(来自核桃的jugr2)
seqidno10(来自澳洲坚果的maci豌豆球蛋白)
通过以下非限制性实施例进一步说明本发明，从中可以获得本发明的其它特征、实施方案、方面和优点。
实施例：
实施例1：
澳洲坚果提取物的制备
将烘焙和盐腌的市售澳洲坚果仁研磨，然后用丙酮脱脂3次。将脱脂的坚果碎片在折叠的过滤器上干燥。将干燥的材料重悬于缓冲液例如磷酸缓冲盐水(pbs，50mm磷酸钠，150mmnacl,ph7.4)中，在孵育振荡器中在4℃孵育3小时，随后过滤并在台式离心机中在4℃以4000rpm离心30分钟。
使用100％硫酸铵沉淀上清液，并将所得沉淀针对pbs透析。如生产商的说明书中所述，通过bio-rad蛋白测定(bio-radlaboratories,inc.,hercules,usa)进行蛋白浓度的估计。
制备凝胶电泳
将粗制的澳洲坚果提取物用冷的丙酮沉淀，并且在-20℃孵育2小时且在4℃以20000xg离心30分钟后，将沉淀物重悬在样品缓冲液中用于等电聚焦(2.5％磺基甜菜碱3-10，4m尿素，2m硫脲，0.5％(v/v)载体两性电解质(carrierampholyte)ph3-10、40mmdtt和0.003％溴酚蓝)。在室温下用样品再次水化ipg条(readystripipg条7cmph3至10(bio-rad)，固定的ph梯度)过夜。
随后，使用proteani12ief系统(bio-rad)聚焦蛋白质，并且通过用于在凝胶上产生纯蛋白点的聚丙烯酰胺凝胶电泳(4至12％bis-tris蛋白质凝胶，1.0mmx2d孔，thermofisherscientific)，基于其表观分子量在第二维进行分离。对于2d凝胶中的点的尺寸估计，如制造商的说明书中所述使用spectramulticolorbroadrange(thermofisherscientific)进行估计。
通过blue-银染色(candiano等人,electrophoresis.2004may；25(9):1327-33.bluesilver:averysensitivecolloidalcoomassieg-250stainingforproteomeanalysis)对所得2d凝胶的蛋白质进行染色。染色的凝胶如图1所示。
蛋白质印迹
如制造商的说明书中所述，将坚果提取物的2d凝胶通过te22miniblotter(hoeferinc.，holliston，ma，usa)转移至硝酸纤维素膜。通过用ponceaus染色检测转移的蛋白质。将所得蛋白质印迹在洗涤缓冲液(euroimmunag,lübeck,germany)中孵育15分钟，随后用在洗涤缓冲液中1:10稀释的来自澳洲坚果致敏的患者的血清孵育1小时。
在用洗涤缓冲液(产品号zd1100，由euroimmunag提供用于euroline线印迹，lübeck，germany)洗涤3次，每次5分钟后，将膜与抗ige-ap缀合物(euroimmunag,lübeck,germany)孵育并再次用洗涤缓冲液洗涤3次，每次5分钟。如制造商的说明书中推荐的，通过与bcip/nbt底物(euroimmunag,lübeck,germany)孵育来检测结合的抗体。
获得的印迹示于图2中。主要的目标蛋白质包括在ph6.3至8.7于2dsdspage中电泳的53至67kda的蛋白质和在ph6.5至7.9于2dsdspage中电泳的20至25kda的蛋白质。
maldi
切下用blue银染色染色的2d凝胶的选定点并用胰蛋白酶消化。如制造商的说明书中所述，使用maldi-tof/tofautoflexiii(brukercorporation,billerica,ma,usa)进行肽质量指纹分析(pmf)和msms。就方便的序列筛选针对绿色植物的ncbi数据库，导致作为在ph6.3至8.7电泳的53至67kda的蛋白质的澳洲坚果豌豆球蛋白样蛋白(数据库登录码：q9spl3)的鉴定。
澳洲坚果豌豆球蛋白样蛋白的克隆、重组表达和纯化
通过基因合成(eurofinsgenomicsgmbh)生成澳洲坚果豌豆球蛋白样蛋白的编码区，更具体地等同于如seqidno：2所示的通过接头与his标签融合的af161885中的核苷酸序列的编码dna，通过聚合酶链反应扩增并使用
线印迹(euroline)的制备
通过使用精密分配器(可从zetacorporation商购获得)将融合蛋白涂覆在硝酸纤维素膜(可从schleicher&schüll商购获得)上来产生euroline线印迹。根据制造商的说明书的推荐封闭和洗涤后，将膜切成3mm的条。
使用euroline线测定法评价样品
根据制造商(euroimmunag,lübeck,germany)说明书的推荐孵育euroline条。具体来说，在室温下，用1ml在洗涤缓冲液中1/11(v/v)稀释的患者样品(20个澳洲坚果致敏的患者和17个健康血液供体)孵育所述条16小时。弃去患者样品后，将所述条洗涤3次，每次用每条1ml洗涤缓冲液洗涤5分钟，随后用1ml与ap缀合的抗人ige抗体孵育1小时。然后，将所述条再次用洗涤缓冲液洗涤5次，然后用bcip/nbt底物孵育10分钟。
通过扫描仪和
表1：east类别
实施例2：
来自榛子(seqidno3)、芝麻(seqidno4)、花生(seqidno5)、开心果(seqidno6)、腰果(seqidno7)、美洲山核桃(seqidno8)、核桃(seqidno9)和澳大利亚坚果(seqidno10)的豌豆球蛋白样蛋白根据标准方法表达为his标签融合蛋白，并如实施例1所述纯化。
制备线印迹，将其与患者样品接触，并如ep15001277的实施例2和3中所述进行评价。测试了来自对树坚果过敏的29个患者和9个健康献血者的血清。
测试来自健康献血者的对照血清，并且发现其均为阴性(east类别0)。
图4a至4g显示了比较数据，其指示如使用线印迹测定的来自所述患者的血清中以east类别形式表达的ige浓度。这些图显示了针对来自非澳洲坚果的树坚果的一种树坚果或核7s豌豆球蛋白样蛋白的ige与针对来自澳洲坚果的maci豌豆球蛋白的ige之间的相关性(如果有的话)。
例如，图4g显示，对于maci豌豆球蛋白，一个患者显示出east类别1ige反应，几个患者显示east类别2ige反应，并且一个患者显示east类别5ige反应，但是对于anao1(腰果)没有反应，如通过他们在对应于anao1的0east类别的那一排中所显示的情况所指示的。
这些结果显示，在每个比较实验中，显著数量的过敏性患者(图4a至4g中的暗视野)对maci豌豆球蛋白反应，但不对来自另一树坚果的相应豌豆球蛋白样蛋白反应，更具体地，该数量为29个患者中的13个(cora11相比于maci)，29个患者中的9个(sesi3)，29个患者中的10个(jugr2)，29个患者中的9个(pisv3)，29个患者中的8个(cari2)，29个患者中的4个(arah1)和29个患者中的4个(anao1)。这些患者之一不能通过检测针对来自其它树坚果的豌豆球蛋白而非maci豌豆球蛋白的ige类别抗体来诊断，因为其血清中的ige抗体仅对maci豌豆球蛋白反应。
maci豌豆球蛋白与来自其它坚果和核的7s豌豆球蛋白样蛋白没有east类别相关性。一些患者对maci豌豆球蛋白的反应比对各自的其它树坚果过敏原的反应强得多，表明各患者主要对澳洲坚果过敏而不是对另一种树坚果过敏。例如，图4a显示4名患者具有对maci豌豆球蛋白的6(强反应)的east类别，但对于cora11没有或仅有轻微反应(east类别0或1)。这表明，maci豌豆球蛋白具有不与任何其它豌豆球蛋白共有的独特的ige表位。
序列表
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<120>新型澳洲坚果过敏原
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