一种猪链球菌截短蛋白Sao及应用的制作方法

本发明涉及家畜基因工程疫苗领域，具体涉及一种猪链球菌截短蛋白sao及应用。

技术背景

猪链球菌(streptococcussuis,s.suis)是引起猪链球菌病的主要病原，依据细菌表面的荚膜多糖(cps)可以将s.suis分为33个血清型，分别为1/2型、1～31和33型。其中猪链球菌2(ss2)型是毒力最强、流行广、临床分离频率最高的血清型。ss2是一种重要的人畜共患病病原体，能引起猪脑膜炎、心内膜炎、败血症、关节炎、浆膜炎、肺炎等，常引起断奶仔猪或育肥猪突然死亡；人类感染该菌，可导致脑膜炎，引发永久性耳聋、败血症、心内膜炎，甚至死亡。1991年首次报道在广东省发现猪2型链球菌疑似病例,1998-1999年江苏省部分地区连续2年在盛夏季节暴发该病。目前已有足够的流行病学资料证实，ss2已经对我国的养殖业和人民健康构成了严重的威胁。因此，研发出有效的疫苗来预防猪链球菌的感染和控制猪链球菌病迫在眉睫。

亚单位苗具有活菌苗的免疫效力高及灭活菌苗的安全性好等优点，yuanyili等人证实sao是猪链球菌的表面膜蛋白，sao的特异性抗体可以和33个血清型中的28个血清型菌株裂解物及26株ss2中的25株有良好的免疫原性反应，说明sao在猪链球菌中有高保守性。

另外，sao蛋白的免疫保护效果和佐剂有很大关系。yuanyili等人发现sao和佐剂emulsigen-plus混合使用后虽然能引起较高的抗体水平，但是不能保护仔猪抵抗猪链球菌的感染。该研究者后来将佐剂emulsigen-plus替换成佐剂quila，却能提供仔猪80％以上的保护力。k.-j.hsueh等人证实sao和商业化佐剂w/o/w佐剂也能给鼠提供80％的保护力。

sao根据基因序列长度的不同分为3个型：sao-s(1.5kb)、sao-m(1.7kb)、sao-l(2.0kb)，其中sao-m在菌株中分布最广。sao-m全长蛋白有110kd，王晶等人发现全长sao蛋白纯化难度大，蛋白稳定性差，降解速度块，这些因素阻碍了sao蛋白疫苗的进一步研发。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供了一种猪链球菌截短蛋白sao，其序列为seqidno.2所示。其对应的核苷酸序列为seqidno.1所示。本发明提供的截短蛋白sao为稳定性蛋白，溶解于pbs缓冲溶液中，保存在-80℃一个月后取出未发现蛋白有降解现象。

本发明的另一个目的在于提供了猪链球菌截短蛋白sao在制备猪链球菌感染疫苗中的应用，将截短蛋白sao和佐剂制备成疫苗，肌肉免疫仔猪，加强免疫后攻毒，可以给仔猪提供较高的保护力。

本发明最后一个目的在于提供了截短蛋白sao在制备多联疫苗中的应用，将本发明提供的截短蛋白sao与其他蛋白疫苗制备成多联疫苗，可起到一针多效的效果。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

全长蛋白sao不稳定，容易降解，申请人将全长sao蛋白进行有效的截短，截短后的蛋白序列为seqidno.2所示，截短蛋白sao变为稳定性蛋白，溶解于pbs缓冲溶液中，保存在-80℃一个月后取出未发现蛋白有降解现象。

猪链球菌截短蛋白sao在制备猪链球菌感染疫苗中的应用，包括将截短蛋白sao和佐剂按比例混合制备成疫苗，肌肉免疫仔猪，能有效保护仔猪抵抗猪链球菌的感染。

截短蛋白sao在制备多联疫苗中的应用，将本发明提供的截短蛋白sao与其他蛋白疫苗制备成多联疫苗，优选的将截短蛋白sao和红斑丹毒丝菌表面截短蛋白spaa(seqidno.3所示)制备成联合疫苗，肌肉免疫仔猪，可有效提高攻毒后仔猪存活率，俩者互不影响彼此对仔猪的免疫保护效果。

具体方法详见具体实施方式。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.本发明提供的sao蛋白性质稳定，不容易降解，优于全长蛋白，制备成疫苗后稳定性好，适用于大量生产。

2.利用本发明提供的sao蛋白制成疫苗后，可有效对仔猪产生保护作用，利用大剂量的强毒株sc19攻毒后，其保护力依然达到60％。

3.本发明提供的sao蛋白安全无毒，对仔猪及妊娠母猪免疫后整个观察期间体温、呼吸、食欲、精神状态都正常，妊娠猪产仔正常，没有出现流产、死胎等情况。

4.本发明提供的sao蛋白还可与其他蛋白联合制备成多联疫苗，可起到一针多效的效果。

附图说明

图1为截短蛋白sao免疫小鼠的抗体水平示意图。

图2为截短蛋白sao免疫小鼠后攻毒保护力效果示意图。

图3为截短蛋白sao免疫仔猪后体温变化示意图。

图4为截短蛋白sao免疫仔猪后抗体水平示意图。

图5为截短蛋白sao免疫仔猪后攻毒保护力效果示意图。

图6为联合苗免疫仔猪后体温变化示意图。

图7为联合苗免疫仔猪后截短蛋白sao抗体水平示意图。

图8为联合苗免疫仔猪后截短蛋白spaa抗体水平示意图

具体实施方式

本发明所述试剂如未特别说明，均购自商业渠道或为本领域的常规配制试剂。所述技术方案如未特别说明，均为本领域的常规方案。

实施例1：

猪链球菌截短蛋白sao的合成及疫苗制备：

1.1截短蛋白sao的合成

截短蛋白sao的序列如seqidno.2所示，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。合成后截短蛋白sao多肽纯度为99％，每只5mg，为白色粉末状，避光保存于-20度，完全可溶于水。将该蛋白溶解于pbs缓冲溶液中，保存在-80℃一个月后取出未发现蛋白有降解现象。

使用前，用无菌pbs(nacl8.0g，kcl0.2g，kh2po40.24g，na2hpo4×12h2o3.628g，ph7.4)按指定浓度进行稀释。使用前置于37度温箱预热。

1.2疫苗的制备

剂型：油包水型(w/o)

佐剂组成：白矿油(marcol52)、吐温80(crillet4)、司盘80(crill4)。

油相：白矿油加热至透明后与司盘80按体积比94：6配制。

水相：蛋白与吐温80组成，吐温80占水相的0.4％(体积比)。

疫苗乳化：水相与油相按1：1体积混合乳化。使截短蛋白sao的终浓度为1mg/ml，用于以下实验。

1.3常规检验

疫苗性状检测：乳化后疫苗滴入清水中，第一滴散开，第二滴油珠状，晃动液面油珠不破乳。无菌检测：取少许疫苗涂布tsa平皿，37℃温箱培养18小时无菌落长出。

稳定性检验：3000rpm/min离心15分钟，根据分离情况判定乳化是否稳定，离心后乳化疫苗未分层。

将蛋白溶解于pbs缓冲溶液中，-80℃分别保存1个月、3个月、6个月，未发现蛋白性质变化。

将上述乳化好的疫苗置于4℃分别保存1个月、3个月、6个月，未检测到疫苗性状变化。实施例2：

截短蛋白疫苗sao在制备猪链球菌感染疫苗中的应用

1、在小鼠模型上评价疫苗的免疫保护效果

1.1实验方案

实验动物：4周龄雌性balb/c小白鼠，购自湖北省疾病预防控制中心。

攻毒菌株：猪链球菌2型sc19。

实验分组：取体重16g雌性balb/c小白鼠20只，随机分为2组:疫苗i组(sao)、对照组(佐剂和pbs)，每组10只。免疫后期间每周断尾取血，用于血清特异性抗体的监测。免疫方法：将实施例1制备的疫苗按100μl/只的剂量皮下免疫实验小鼠；2周后加强免疫1次(免疫剂量及部位同第一次免疫)。

1.2血清特异性抗体的检测

使用截短蛋白sao100ng/孔于4℃过夜包被酶联板，用间接elisa的方法检测分离血清的抗体效价；结果见图1。

免疫后对小鼠的抗体水平进行检测发现：首次免疫后第一周就可以诱导小鼠产生较高的抗体水平，有2⁷。在二免14天时小鼠体内抗体水平达到一个较高的水平，阳性血清的平均抗体效价可以达到2¹⁵。

1.3免疫鼠攻毒后保护情况

二免14天后攻毒试验，攻毒剂量为3.3×10⁸cfu/只。连续观察一周，记录小鼠的临床特征及死亡情况。

结果如下：

sc19株的绝对致死菌量ld100为3.0×10⁸cfu/只，免疫小鼠攻毒结果见图2，小鼠存活率是70％，存活的7只小鼠无临床症状；而对照组小鼠全部死亡，存活率是0。由抗体水平和免疫组小鼠存活率可以看出sao蛋白截短后加佐剂制成的疫苗对小鼠有较高的保护效果，该蛋白的免疫原性没有消失。

2、在仔猪模型上评价疫苗的免疫保护效果

2.1实验方案

实验动物：4周龄猪链球菌检测阴性断奶仔猪，购自武汉市黄陂区青草湖天种猪场。

攻毒菌株：猪链球菌2型sc19。

实验分组：4周龄断奶仔猪分为3组，免疫1组(sao)、免疫2组(sao)、对照组(佐剂和pbs)，免疫1组和对照组每组10头，免疫2组5头，免疫1组、佐剂和pbs混合对照组用于攻毒，免疫2组用于检测抗体水平，连续检测8个月。

免疫方式：臀部肌肉多点注射，首免后隔14天加强免疫一次(免疫剂量及部位同首免)，免疫剂量为2ml/头。

2.2血清特异性抗体的检测

免疫1组、佐剂和pbs混合对照组每周耳静脉取血，用于血清特异性抗体的检测；免疫2组每个月采血一次，用于血清特异性抗体的检测。使用纯化的截短蛋白sao100ng/孔包被酶联板，4℃过夜。用间接elisa检测仔猪体内的抗体水平。

2.3免疫后仔猪体温变化检测

首次免疫后每天监测体温，连续检测7天，观察免疫后仔猪的采食及精神情况。

2.4免疫猪攻毒后保护情况

二免14天后进行攻毒试验，攻毒剂量为1.8×10⁶cfu/头的sc19，是仔猪致死剂量ld100的1.5倍。连续观察14天，记录临床特征及死亡情况。

2.5免疫效果评估

免疫后仔猪没有临床发病症状，免疫1组、对照组免疫后第二天体温会上升，上升幅度较小，未见仔猪有厌食、贪卧、精神沉郁等症状，第三天体温基本恢复正常，期间仔猪采食量未见减少，体温的短暂上升对仔猪的生长影响较小，体温变化见图3。

对仔猪免疫sao后的抗体水平检测表明：sao诱导仔猪的抗体水平逐渐升高，在首免后第四周可达2²⁰左右，见图4；攻毒后，免疫1组有4头仔猪在7天内死亡，存活6头，见图5。将健康存活仔猪处以安乐死进行剖检分菌，肾、脾、肝、心都没有分离到sc19。对照组仔猪陆续发病，后腿关节肿胀，精神沉郁，喜卧，结膜炎，划水呈游泳状，陆续有仔猪死亡，最后全部死完。本体动物的实验结果进一步说明本发明制备的截短蛋白sao可以为仔猪提供较好的保护效果。

对免疫2组进行8个月的抗体水平检测，加强免疫后2周开始检测抗体，检测结果表明：首免后的第28天～90天抗体效价平均值在2²⁰左右；从首免后第4个月到第6个月抗体效价逐渐下降，抗体水平仍然较高，第6个月的抗体效价平均值在2¹⁰左右，依然对仔猪有保护力，说明抗体水平至少可维持6个月。210天虽能检测到抗体，但抗体水平较低，抗体效价平均值只有2⁵。

实施例3：安全性检验

为了检验所制备疫苗对仔猪及妊娠母猪的安全性影响，对35日龄仔猪和妊娠70日龄母猪进行安全性检验。

3.1实验方案：

1)将制备的疫苗分别通过臀部肌肉分点注射接种35日龄健康仔猪，每批疫苗注射5头，每头接种2ml，观察其临床表现并测定体温。

2)制备的疫苗分别通过臀部肌肉分点注射接种妊娠70日的健康母猪，每批疫苗注射5头，每头接种2ml，观察其临床表现和产仔情况。

2.试验结果

3.2.1本发明的亚单位疫苗对断奶仔猪接种的安全性

将制备的疫苗接种35日龄健康断奶仔猪后，每批疫苗注射5头，仔猪呼吸情况、精神状况、食欲等均正常，只是接种疫苗第二天体温稍有上升，第三天体温迅速下降恢复正常。说明该疫苗制品对断奶仔猪安全性很好，体温变化见(表1)。

表1本发明制备的疫苗接种35日龄断奶仔猪后的平均体温变化

3.2.2本发明的亚单位疫苗对怀孕动物(妊娠母猪)接种的安全性(产子情况)

结果3批本发明的亚单位疫苗接种的健康妊娠70日母猪在整个观察期间体温、呼吸、食欲、精神状态都正常(表2)，产仔正常，没有出现流产、死胎等情况(表3)。

表2本发明的疫苗接种健康妊娠母猪后的平均体温变化

表3健康妊娠母猪接种制备疫苗后的产仔情况

实施例4：

截短蛋白sao在制备多联疫苗中的应用

1.联合疫苗的制备

按实施例1中的方法制备截短蛋白sao和红斑丹毒丝菌表面截短蛋白spaa的联合苗，sao和spaa的含量各为1mg/ml。

所述的红斑丹毒丝菌表面截短蛋白spaa的氨基酸序列为seqidno.3所示，本发明所用的截短蛋白spaa为基因工程菌大肠杆菌(escherichiacoli)bl21/pet-28a-spaa，保藏编号为cctccno：m2015076分泌得到，所述的菌株已于2015年2月2日送至中国典型培养物保藏中心保藏，地址：中国武汉武汉大学，分类命名：escherichiacolibl21/pet28a-spaa。

2.联合苗在仔猪上免疫效果

1)实验方案

实验动物：4周龄猪链球菌检测阴性断奶仔猪，购自武汉市黄陂区青草湖天种猪场。

攻毒菌株：猪链球菌2型sc19，红斑丹毒丝菌se38(简称se38，李敬涛，湖北部分地区红斑丹毒丝菌分离株耐药性分析，养殖与饲料[j].2015.2，11-14)，sc19攻毒剂量为1.8×10⁶cfu/头，是致死剂量id100的1.5倍；se38攻毒剂量为9.0×10⁸cfu/头，是致死剂量ld100的3倍。

实验分组：4周龄断奶仔猪分为4组，免疫1组(sao+spaa)、免疫2组(sao+spaa)、对照组(佐剂+pbs)2组，每组各10头。

免疫方式：臀部肌肉多点注射，首免后隔14天加强免疫一次，免疫剂量为2ml/头。

2)血清特异性抗体的检测

在4个实验组随机选取仔猪每周耳静脉取血，用于血清特异性抗体的检测。使用纯化的截短蛋白sao100ng/孔包被酶联板，4℃过夜，用间接elisa检测仔猪分离血清中sao抗体水平。使用纯化的截短蛋白spaa100ng/孔包被酶联板，4℃过夜，用间接elisa检测仔猪分离血清中spaa抗体水平。

3)免疫后仔猪临床观察

首次免疫后每天监测体温，连续检测7天，观察免疫后仔猪的采食及精神情况。

4)免疫猪攻毒后保护情况

二免14天后进行攻毒实验，连续观察14天，记录临床特征及死亡情况。

5)免疫效果评估

免疫后仔猪没有临床发病症状，免疫后仔猪第二天体温会略有上升，未见仔猪有厌食、贪卧、精神沉郁等症状，第三天体温基本恢复正常，期间仔猪采食量未见减少，体温的短暂上升对仔猪的生长影响较小，体温变化见图6。

对仔猪免疫后的sao和spaa抗体水平检测表明：免疫仔猪后，抗体效价逐渐升高，到二免2周结束时仔猪的抗体效价可以达到2²⁰左右。和单体疫苗免疫的抗体水平增长相比，联合苗免疫仔猪的抗体增长未见异常变化，说明俩者可以联合使用，不会出现抗体抵消的现象，见图7和图8。

攻毒结果见表4，截短蛋白sao苗可以提供仔猪60％的保护力，spaa可以给仔猪提供90％的保护力。本实验结果说明进一步制备的联合苗不会影响彼此对仔猪的保护效果。

表4联合苗攻毒后的结果

本发明制备的截短蛋白sao相对于全长蛋白，是稳定性蛋白，和佐剂混合后能给仔猪提供较高的保护效果，说明其免疫原性没有降低。和红斑丹毒丝菌截短蛋白spaa混合制备成联合疫苗免疫仔猪，不会出现抗体抵消的现象。以上说明：单独截短sao蛋白苗能保护仔猪抵抗猪链球菌2型强毒sc19的感染，和截短蛋白spaa组成联合苗也能保护仔猪抵抗猪链球菌或者红斑丹毒丝菌的感染，符合当前“一针防多病”的预防策略，具有非常重要的实际应用价值。

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