本发明属于海洋天然产物领域，涉及一种鲨鱼软骨中具有生物活性Ⅱ型胶原蛋白的制备方法。
背景技术：
Ⅱ型胶原蛋白以原骨胶原同型三聚体的超螺旋结构存在于哺乳动物软骨，是由3条相同的α1(Ⅱ)链组成的，在合成过程中原骨胶原α链的修饰是通过脯氨酰、赖氨酰羟化酶在细胞内对脯氨酸，赖氨酸羟基化，特定的羟赖氨酸的糖基化，链的结合以及链内二硫键的产生，从而形成了三链螺旋结构。Ⅱ型胶原蛋白只在软骨组织中发现，它构成了60％的软骨干重，在哺乳动物透明软骨中含量丰富，约占软骨组织蛋白质总量的80％。软骨的两种主要成分分别是纤维状的Ⅱ型胶原蛋白和大分子量的蛋白聚糖，能够起到保护组织的作用。软骨的大多数生理特征是依赖于完整的Ⅱ型胶原蛋白网络。
Ⅱ型胶原蛋白最初以前体的形式在软骨结缔组织的成纤维细胞合成，随后被拼接成前胶原ⅡA和前胶原ⅡB两种方式，不同分子形式的Ⅱ型胶原蛋白是由于氨基端前肽的半胱氨酸富集区的选择性切割而形成的。前胶原ⅡA在N末端有一段半胱氨酸富集区，称为Ⅱ型前胶原A氨基端前肽，主要见于前期软骨组织成纤维细胞和胚胎组织中，而前胶原ⅡB的N末端缺乏这种半胱氨酸富集区，主要存在于成年哺乳动物软骨成纤维细胞中。Ⅱ型胶原前体剪切掉氨基端前肽，经羟基化修饰后，通过二硫键连接成三螺旋结构分泌至细胞外成为软骨基质中的结构蛋白。
Ⅱ型胶原蛋白作为典型的结构蛋白，含有大部分常见氨基酸，其中甘氨酸和羟脯氨酸的含量很高，但不含有色氨酸或其它氨基酸含量很少。基于氨基酸构成的胶原蛋白3条肽链形成的空间超螺旋结构，和每一条肽链重复出现的Gly-X-Y三肽单元密切相关。甘氨酸的空间位置能优化多肽链折叠构象，而且甘氨酸是唯一适合肽链折叠内部位置的氨基酸，产生(Gly-X-Y)n氨基酸序列的重复，最为常见的三肽单元Gly-Pro-Hyp有助于三股螺旋的稳定。Phanat等从鲨鱼软骨中分离的胶原蛋白热变性温度34.56～36.73℃。陈申汝等人从灰星鲨鱼软骨中提取胶原蛋白的方法把鲨鱼软骨规则切成小块，将脱钙洗涤时间需要5天左右。
Ⅱ型胶原蛋白一般是从猪、羊和鸡等陆生生物软骨中分离得到。Ⅱ型胶原蛋白的提取方法主要是胃蛋白酶水解法，但软骨粉的前处理去除非胶原成分部分与纯化步骤是本发明的特殊之处，本发明采用0.1mol/L NaOH和0.5mol/L EDTA除去软骨中的非胶原成分，消除了盐酸胍残留存在的安全隐患，安全性更高，应用范围更广。
技术实现要素：
本发明所解决的技术问题是提供一种生物活性Ⅱ型胶原蛋白生产方法，胶原蛋白的提取过程较简便，安全性更高，应用范围更广。
.一种鲨鱼软骨中具有生物活性Ⅱ型胶原蛋白的制备方法，包括如下步骤：
(1)获取鲨鱼软骨材料，将获取的软骨处理后切成3-5mm薄片，将切碎的软骨薄片冷冻干燥；通过冷冻干燥后粉碎可以最大限度提高胶原的提取率和维持其部分生物活性功能。
(2)再将冷冻干燥后的软骨粉碎成80-200目的粉末，进行除杂过程；
(3)胃蛋白酶水解提取Ⅱ型胶原蛋白，获得含Ⅱ型胶原蛋白的混合液；酸性环境下Ⅱ型胶原蛋白的提取效率更高。
(4)通过盐析、透析、冷冻干燥后得到具有生物活性的Ⅱ型胶原蛋白。
进一步，所述鲨鱼软骨材料选自蓝鲨软骨。稍高于其他鲨鱼软骨的提取效率。
进一步，所述步骤(2)中的除杂过程具体如下：将鲨鱼软骨粉0.1-0.2mol/L NaOH 1：5-15体积比混合，进行充分搅拌，每2-3小时更换一次碱液，搅拌结束后用去离子水反复洗涤，直至pH为7.0-7.6,再用0.5-1mol/L，pH7.0-7.6EDTA溶液连续搅拌除去矿物质，每8-10h更换一次溶液，搅拌结束后用20-30倍体积的去离子水连续搅拌10-20min，共2-5次，最后得到去除杂质后胀润的鲨鱼软骨粉。Ⅱ型胶原蛋白存在条件相对缓和，有利于其生物活性的维持。
进一步，所述步骤(3)胃蛋白酶水解提取Ⅱ型胶原蛋白的具体步骤如下：将除去杂质后胀润的鲨鱼软骨粉与用0.5-1mol/L乙酸配成的1-2％胃蛋白酶液以1：10-20体积比混合，经过充分搅拌后，6000-10000rpm离心，取上清液，用NaOH将pH调至7.4-7.6；加入NaCl盐析，并搅拌使Ⅱ型胶原蛋白充分析出，6000-10000rpm离心得沉淀；透析，沉淀用的0.5-1mol/L乙酸使之恰好溶解，用20-30倍体积的0.1-0.2mol/L乙酸透析12-36h，再用20-30倍体积的去离子水透析24-72h；透析液冷冻干燥后保藏。
进一步，除冷冻干燥外所有操作在3-5℃条件下进行。
进一步，除冷冻干燥外所有操作在4℃条件下进行，以保持Ⅱ型胶原蛋白的生物活性。
本发明的有益效果是：
1.本发明对原料进行冷冻干燥后再粉碎，既保持了其生物活性，又为原料的后续处理提供了方便。
2.本发明技术方案简便易行、标准化强、产量高。
3.本发明中，Ⅱ型胶原蛋白的提取过程较简便，便于放大。
4.本发明中，软骨粉的处理过程更有独创性，且简便易行，污染小，能耗低。
具体实施方式
实施例1
1、取10kg的鲨鱼软骨。人工去除残肉、骨膜等杂质，生理盐水洗涤3次并晾干。
2、将软骨切成3mm的薄片，于冷冻干燥机中-25℃、10Pa下冻干。
3、将软骨粉碎成200目的粉末。
4、将鲨鱼软骨粉与0.1mol/L NaOH 1：10体积比混合，进行充分搅拌，每2小时更换一次碱液，搅拌结束后用去离子水反复洗涤，直至pH为7.0,用0.5mol/L，pH7.4EDTA溶液连续搅拌除去矿物质，每8h更换一次溶液，搅拌结束后用20倍体积的去离子水连续搅拌10min，共3次，最后得到去除杂质后胀润的鲨鱼软骨粉。
5、将胀润的鲨鱼软骨粉与用0.5mol/L乙酸配成的1％胃蛋白酶液以1：10体积比混合，经过充分搅拌后，6000-10000rpm离心，取上清液，用NaOH将pH调至7.5；加入NaCl至2.6mol/L盐析，并搅拌使Ⅱ型胶原蛋白充分析出，8000rpm离心得沉淀；透析，沉淀用的0.5mol/L乙酸使之恰好溶解，用25倍体积的0.1mol/L乙酸透析24h，再用25倍体积的去离子水透析48h；透析液冷冻干燥后保藏。
获得1.16kgⅡ型胶原蛋白，经测定Ⅱ型胶原蛋白纯度在93.4％，分子量为130kD，在SDS-PAGE显示出α1链及其二聚体，提取出的Ⅱ型胶原蛋白中羟脯氨酸和甘氨酸的含量达到7.09％，Gly残基占氨基酸残基总数的30％以上，蓝鲨Ⅱ型胶原蛋白具有(Gly-Xaa-Yaa)的氨基酸残基构成特点，符合胶原蛋白的特征。
经测试热变形温度达到了41℃。
通过抗氧化试剂盒测定，Ⅱ型胶原蛋白对DPPH自由基的清除率为21.85％。
对比例1
1、取10kg的鲨鱼软骨。人工去除残肉、骨膜等杂质，生理盐水洗涤3次并晾干。
2、将软骨切成3mm的薄片。
3、将软骨粉碎成200目的粉末。
4、将鲨鱼软骨粉与0.1mol/LNaOH 1：10体积比混合，进行充分搅拌，每2小时更换一次碱液，搅拌结束后用去离子水反复洗涤，直至pH为7.0,用0.5mol/L，pH7.4EDTA溶液连续搅拌除去矿物质，每8h更换一次溶液，搅拌结束后用20倍体积的去离子水连续搅拌10min，共3次，最后得到去除杂质后胀润的鲨鱼软骨粉。
5、将胀润的鲨鱼软骨粉与用0.5mol/L乙酸配成的1％胃蛋白酶液以1：15体积比混合，经过充分搅拌后，6000-10000rpm离心，取上清液，用NaOH将pH调至7.5；加入NaCl至2.6mol/L盐析，并搅拌使Ⅱ型胶原蛋白充分析出，8000rpm离心得沉淀；透析，沉淀用的0.5mol/L乙酸使之恰好溶解，用25倍体积的0.1mol/L乙酸透析24h，再用25倍体积的去离子水透析48h；透析液冷冻干燥后保藏。
获得1.09kgⅡ型胶原蛋白，经测定Ⅱ型胶原蛋白纯度在91.7％。
通过抗氧化试剂盒测定，Ⅱ型胶原蛋白对DPPH自由基的清除率为16.56％。
由上述实施例可得通过冷冻干燥后再粉碎鲨鱼骨最大限度提高胶原的提取率和维持其部分生物活性功能。Ⅱ型胶原蛋白对DPPH自由基的清除率达到了20％左右，这数值远大于干贝肉等动物蛋白提取物，且提取率在10％左右，同类型提取胶原蛋白的方法相比，本方法的提取率更高，且热变形温度提高到了41℃,提高Ⅱ型胶原蛋白的潜在适用范围。