一种高硫酸化硫酸角质素及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种高硫酸化硫酸角质素及其制备方法和应用。

背景技术：

硫酸角质素（KS）是自然界唯一不含糖醛酸的粘多糖，主要分布在各种动物角膜、软骨、脑等组织中，其重复二糖单元骨架为[→3Galβl→4GlcNAcβl→]。KS的硫酸化修饰主要在半乳糖（Gal）和N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）两个糖残基的C-6位且硫酸化程度因动物来源不同而不同，分子量范围10~50KDa。根据糖和蛋白质之间连接方式的不同，KS分为KS I、KS II和KS III三类。KS I最初发现于角膜，它通过GlcNAc连接于核心蛋白的天冬酰胺上，属于N-连接聚糖；KS II主要存在于骨骼中，由N-乙酰氨基半乳糖（GalNAc）连接于核心蛋白的丝氨酸或苏氨酸，属于O-连接聚糖；KS III则主要在脑中发现，是由甘露糖（Man）通过O-连接于核心蛋白的丝氨酸。随着国内外对KS的分布、化学结构及理化性质等方面研究的不断深入，发现KS具有抗类风湿性关节炎、抑制神经细胞粘附和神经突生长、保持角膜通透性等生物活性，具有潜在药用价值。如中国专利（公开号：CN102552312A）公开了包括硫酸角质素在内的糖胺聚糖复合制剂治疗骨关节炎；中国专利（公开号：CN1682755）公开了硫酸软骨素或硫酸角质素和聚乙烯吡咯烷酮作为活性成分治疗溃疡；中国专利（公布号：CN101370507）公开了硫酸角质素寡糖或其衍生物能改善由脊髓损伤引起的外伤性神经性疾病和/或运动功能障碍；中国专利（公布号：CN1174557）利用角质素酶II制备硫酸角质素寡糖，并公开了其在抗炎症、抗过敏、免疫调节、细胞分化诱导及细胞诱导凋亡等中的作用；美国专利（公布号：US8557536B2）公开了一种通过血液样品中硫酸角质素的浓度评价关节软骨退化或损伤方法；中国专利（公布号：CN105732838A）公开了一种从蛋清中提取硫酸角质素的方法。目前对硫酸角质素的研究主要集中在角膜、关节软骨应用上，结构研究较少。虽然中国专利（公布号：CN 103755823 A）公开了一种硫酸软骨素中硫酸角质素的纯化与检测方法，以及中国专利（公布号：CN105777938A）公开了一种采用化学方法从硫酸软骨素粗提物中去除硫酸角质素的方法，但均没有KS结构信息。目前已报道的KS结构中二硫酸化二糖的比例为40~70%（Amanda Weyers, FEBS Journal, 2013；Li Fu et al., Glycobiology, 2016），而且在KS应用方面，并无文献或专利报道KS在调节肠道微生物和调节免疫方面的作用。

技术实现要素：

本发明提供一种高硫酸化硫酸角质素及其制备方法和用途。本发明从鲨鱼软骨中提取了一种结构新颖的高硫酸化KS，对其结构进行了阐述，并进一步证明所得高硫酸化KS对肠道微生物及免疫具有良好的调节作用。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一种高硫酸化硫酸角质素，所述高硫酸化硫酸角质素来源于鲨鱼软骨，分子量为20~100 kDa，所述高硫酸化硫酸角质素由 6位硫酸化半乳糖和6位硫酸化乙酰氨基葡萄糖以β-1,3和β-1,4糖苷键交替连接而成，其二硫酸化二糖含量为80~95%，非还原端为唾液酸化的三硫酸基取代硫酸角质素四糖，唾液酸与半乳糖之间为α-2,3连接，其结构式如下：

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进一步的：所述唾液酸化的三硫酸基取代KS四糖，其结构如下所示：

其中所述结构式中两个取代基R1 和R2其中之一为SO3H，另一取代基则为H。

进一步的：所述鲨鱼软骨为鲨鱼的关节、肋骨、头骨、椎骨、椎间盘或气管部位的软骨。

本发明还提供了所述的高硫酸化硫酸角质素的制备方法，它包括以下步骤：

(1) 蛋白酶降解：将鲨鱼软骨粉碎后分散于酶解缓冲液中，然后加入木瓜蛋白酶，50~70 ℃摇床反应，后煮沸使酶灭活；降温后再加入胰蛋白酶，30~55 ℃摇床反应，后煮沸使酶灭活，冷却后离心去除不溶性杂质；

(2) 乙醇沉淀：向步骤（1）得到的溶液中加入乙醇，低温放置 12~24 小时，离心后取沉淀，沉淀用蒸馏水复溶后透析，减压浓缩、冻干后得到鲨鱼软骨粘多糖组分；

(3) 阴离子交换树脂分离：将步骤(2)所得鲨鱼软骨粘多糖组分用蒸馏水溶解，以氯化钠水溶液为流动相线性洗脱，经阴离子交换树脂分离纯化，硫酸苯酚法检测，蒸馏水透析后减压浓缩、冻干，得到高纯度硫酸角质素；

或者软骨素酶解分离：将步骤(2)所得鲨鱼软骨粘多糖组分用缓冲液溶解，加入软骨素ABC酶，25~40 ℃摇床反应4~6h后煮沸使酶灭活，离心后向上清液中加入乙醇，低温放置 12~24 小时，离心收集沉淀，复溶于水后透析脱盐、冻干，得到高纯度硫酸角质素。

进一步的：所述步骤(1)中木瓜蛋白酶的用量为10~100 U·g^-1，pH为7.0；所述胰蛋白酶的用量为0.1~10%，pH为7.5。

进一步的：所述步骤(1)中加入木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的反应时间均为8~12 h。

进一步的：所述步骤(3)中所述阴离子交换树脂的填料为Q-Sepharose FF、DEAE-Sepharose FF、Capto-Q Sepharose FF、DEAE-Cellulose或Capto-DEAE Sepharose FF。

进一步的：所述步骤(3)中软骨素ABC酶的用量为300~600 mU·g^-1。

本发明还提供了所述的高硫酸化硫酸角质素在制备调节肠道微生物的制剂中的应用。

本发明还提供了所述的高硫酸化硫酸角质素在制备增强免疫力的制剂中的应用。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：

(1) 本发明提供的硫酸角质素制备工艺成本低、操作简单，容易产业化生产。

(2) 本发明制备的硫酸角质素产品纯度高，分子量为20~100 kDa，该多糖主要由 6位硫酸化半乳糖和6位硫酸化乙酰氨基葡萄糖以β-1,3和β-1,4糖苷键交替连接而成，其二硫酸化二糖含量为80~95%，非还原端存在唾液酸化的三硫酸基取代KS四糖，唾液酸与半乳糖之间为α-2,3连接。

(3) 本发明提供的高硫酸化硫酸角质素对肠道微生物具有良好的调节作用。可改变雌鼠和雄鼠体内肠道微生物的结构，明显增加了雌雄鼠体内乳酸杆菌的丰度，并且这种改变与性别密切相关。

(4) 本发明提供的高硫酸化硫酸角质素具有较好的增强免疫活性。

结合附图阅读本发明的具体实施方式后，本发明的其它优点和特点将变得更加清晰。

附图说明

图1为本发明所述高硫酸化硫酸角质素的高效凝胶渗透色谱图。

图2为本发明所述高硫酸化硫酸角质素的一维核磁共振氢谱图。

图3为本发明所述高硫酸化硫酸角质素的一维核磁共振碳谱图。

图4为本发明所述高硫酸化硫酸角质素酶解产物HILIC-UPLC-FT-MS分析图。

图5为唾液酸化的三硫酸基取代KS四糖的二维¹H-¹³C HMBC (A)和¹H-¹H COSY (B)谱图。

图6为本发明所述高硫酸化硫酸角质素改变小鼠体内肠道微生物结构热图。

图7为本发明所述高硫酸化硫酸角质素调节小鼠体内乳酸杆菌图。

图8为本发明所述高硫酸化硫酸角质素促细胞吞噬中性红图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进一步的详细说明，但本发明要求保护的范围并不局限于实例表述的范围。

实施例1：高硫酸化硫酸角质素的制备

本发明所述高硫酸化硫酸角质素的制备方法包括以下步骤：

(1) 蛋白酶降解：将鲨鱼软骨（购买自市售公司）粉碎后分散于PBS（磷酸盐缓冲液）中，然后加入木瓜蛋白酶，所述木瓜蛋白酶用量（E/S）为10~100 U·g^-1，pH为7.0，50~70 ℃摇床反应8~12 h后煮沸使酶灭活；降温后再加入胰蛋白酶，所述胰蛋白酶用量（E/S）为0.1~10%，pH为7.5。30~55 ℃摇床反应8~12 h后煮沸使酶灭活，冷却后离心去除不溶性杂质。

(2) 乙醇沉淀：向步骤（1）溶液中加入2~10倍体积浓度≥ 95％的乙醇，4 ℃放置 12~24 小时，离心后取沉淀，沉淀用蒸馏水复溶后透析，减压浓缩、冻干后得到鲨鱼软骨粘多糖组分。

(3) 阴离子交换树脂分离：将步骤(2)所得鲨鱼软骨粘多糖组分1 g，用4 mL蒸馏水溶解，以0~3.0 mol·L^-1 氯化钠水溶液为流动相线性洗脱，经阴离子交换树脂分离纯化，收集组分蒸馏水透析后减压浓缩、冻干，得到高纯度硫酸角质素。

软骨素酶解分离：将步骤(2)所得鲨鱼软骨粘多糖组分1 g用酶解缓冲液溶解，加入软骨素ABC酶（300~600 mU·g^-1），25~40 ℃摇床反应4~6h后煮沸使酶灭活，离心后向上清中加入2~10倍体积浓度≥ 95％的乙醇，4 ℃放置 12~24 小时，离心收集沉淀，复溶于水后透析脱盐、冻干，得到高纯度硫酸角质素。

实施例2：高硫酸化硫酸角质素的结构表征

（1）绝对分子量测定与纯度分析：采用高效凝胶渗透色谱（HPGPC）-多角度激光散射法（MALLS）联用法测定所述高硫酸化硫酸角质素的绝对分子质量及纯度。

将制得的所述高硫酸化硫酸角质素样品用0.1 mol·L^-1 Na2SO4溶解配制成5 mg·mL^-1水溶液。色谱分析条件：色谱柱为Shodex OHpak SB-804 HQ 与Shodex OHpak SB-802.5 HQ串联使用，流动相为0.1 mol·L^-1 Na2SO4 水溶液，进样量为100 μL，柱温为35℃，流速为0.6 mL·min^-1，采集时间为45min，检测器为示差检测器与多角度激光散射仪联用。实验结果如图1所示，样品呈现单一对称峰，分子量在20~100kDa之间。

（2）核磁共振波谱分析：取30 mg高硫酸化硫酸角质素用重水交换后转至核磁管中，以氘代丙酮为内标，采用600MHz核磁共振波谱仪分析。从如图2、3可知，高硫酸化硫酸角质素纯度很高，不含蛋白和核酸及其他杂质，并能发现分子中存在唾液酸（1.74ppm）信号峰。在其¹H-NMR中，2.05 ppm是GlcNAc乙酰基中甲基氢的吸收峰，3.5~4.5 ppm之间是糖环上各氢信号；4.66和4.48 ppm分别为GlcNAc和Gal的端基质子吸收峰。在¹³C-NMR中，22.07 ppm峰是GlcNAc C-2位上的乙酰基中甲基的吸收峰，102.83 ppm左右是Gal和GlcNAc的异头碳吸收峰，82.06ppm和78.72 ppm分别是糖苷键位置的吸收峰；67.66ppm和66.43 ppm分别是Gal6S和GlcNAc6S的C6吸收峰。此外，在高场区域，还发现了1.74ppm和2.68ppm唾液酸C3位上的两个氢信号。

（3）HILIC-UPLC-FTMS分析：所述高硫酸化硫酸角质素彻底降解后进行HILIC-UPLC-FTMS分析。色谱条件：色谱柱：Phenomenex Luna HILIC 200Å（150×2.00 mm，3μm），流动相：A：乙腈（含5 mM 醋酸铵），B：5 mM 醋酸铵水溶液，柱温25℃，流速0.15 mL·min^-1，洗脱梯度：0~58 min, 92~60% A; 58~60 min, 60~30% A;60~70 min, 30% A; 70~71 min, 30~92% A; 71~90 min, 92% A。结果如图4所示，KS中主要二糖单元为二硫酸化的二糖，其含量为80~95%，也发现了唾液酸化二糖和四糖的存在，进一步验证了核磁共振波谱结果。

实施例3：唾液酸化的三硫酸基取代硫酸角质素四糖的制备和结构表征

（1）取200 mg 高硫酸化硫酸角质素样品溶解于20 mL缓冲液 (0.05 mol/L醋酸铵和2 mmol/L氯化钙) 中，加入100 mU KeratanaseⅡ，37℃于10 Kd超滤离心管内水解。每隔5 h左右离心分离寡糖，并不断补加样品与酶。然后将分离得到的寡糖上样于Bio-Gel P6凝胶渗透色谱柱，用0.2 mol/L NH4HCO3洗脱，流速为0.2 mL/min。硫酸苯酚法检测，共得到五种不同聚合度寡糖。经过一级质谱检测，确定各寡糖聚合度为2~8，主要为高硫酸化寡糖，其中聚合度5的寡糖为位于非还原端的唾液酸化的三硫酸基取代硫酸角质素四糖。

取上述唾液酸化的三硫酸基取代KS四糖5 mg，重水交换后进行一维和二维核磁共振波谱分析。结果如图5所示，通过分析可以确定唾液酸与四糖中的半乳糖之间通过α-2,3连接。

（2）多级质谱分析：为了确定硫酸根取代位置，对所述唾液酸化的三硫酸基取代KS四糖进行多级质谱检测。确定其至少存在两种结构，即未发生硫酸根取代的位置位于还原端的乙酰氨基葡萄糖或半乳糖上。由此可以确定该高硫酸化硫酸角质素结构如下所示：其中所述结构式中两个取代基R1 和R2其中之一为SO3H，另一取代基则为H，即当R1=SO3H时，R2=H；或R1=H时，R2= SO3H。

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实施例4：高硫酸化硫酸角质素对肠道微生物的调节作用

（1）选用6组同一批次的昆明小鼠，雌雄各三组，以正常喂食组为对照，其余两组分别用低剂量（8 mg·Kg^-1）和高剂量（40 mg·Kg^-1）的KS对其灌胃饲养，六周后处死，取盲肠提取DNA，通过高通量测序对其肠道菌群进行分析。

（2）如图6为高硫酸化硫酸角质素调节肠道微生物的热图， N、L、H分别表示正常对照组、低剂量给药组、高剂量给药组，厚壁菌（Firmicutes）、拟杆菌（Bacteroidetes）和变形菌（Proteobacteria）均为丰度较高的菌。结果发现，雄鼠体内拟杆菌丰度降低而厚壁菌丰度增加，而在雌鼠体内，拟杆菌丰度降低而变形菌丰度增加，说明菌群变化与性别密切相关。此外，还发现高硫酸化硫酸角质素同时增加了雌雄鼠体内乳酸杆菌的丰度（如图7），并且这种改变在雌鼠体内更为明显。由于乳酸杆菌可以调节肥胖、糖尿病，腹泻等多种肠道疾病，这为高硫酸化硫酸角质素治疗相关疾病提供了理论依据。

实施例5：高硫酸化硫酸角质素对免疫的调节作用

取对数生长期RAW264.7细胞50000个/孔接种于96孔板，90 μL/孔；24h后加入待测高硫酸化硫酸角质素样品（10 μL/孔）。药物作用24h后终止孵育，轻轻吸走培养基，加PBS洗一次，加入0.075%中性红(100 μL/孔)，培养箱孵育30 min，吸走中性红，加PBS洗三次，加裂解液（无水乙醇：冰乙酸=1:1体积比）200 μL/孔，裂解后测OD540。如图8所示，不同浓度的高硫酸化硫酸角质素具有增强巨噬细胞吞噬功能的作用，且在100 μg/mL时效果最好，说明其具有增强免疫的功效。

综上，本发明以鲨鱼软骨为原料纯化制备高硫酸化硫酸角质素，发现其分子量为20~100 kDa。基于HILIC-UPLC-FTMS技术对高硫酸化硫酸角质素进行结构分析，所得高硫酸化硫酸角质素溶于酶解缓冲液中，加入Keratanase II（100~800 U·g^-1），37 ℃摇床反应24~48 h使其完全酶解，酶解产物进行HILIC-UPLC-FTMS分析，通过生物信息学分析发现该多糖主要由 6位硫酸化半乳糖和6位硫酸化乙酰氨基葡萄糖以β-1,3和β-1,4糖苷键交替连接而成，其二硫酸化二糖含量为80~95%，非还原端存在唾液酸化的三硫酸基取代KS四糖，唾液酸与半乳糖之间为α-2,3连接。本发明所制备高硫酸化硫酸角质素具有调节肠道微生物中的作用，可改变雌鼠和雄鼠体内肠道微生物的结构，明显增加了雌雄鼠体内乳酸杆菌的丰度，并且这种改变与性别密切相关。同时，本发明所制备高硫酸化硫酸角质素还具有良好的免疫调节作用。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。