本发明涉及一种重组人骨形态发生蛋白的制备方法。
背景技术：
近年来，因疾病、创伤、人口老龄化等原因导致的骨损伤患者数量剧增。骨缺损修复主要采用自体骨或同种异体骨移植以及人工骨替换等方法。其中自体骨移植因其良好的骨诱导性和生物相容性，迄今仍是骨修复的“金标准”。但由于来源受限、供骨部位易感染等问题，临床应用受到限制；而异体骨则存在不同程度的免疫排异反应及潜在的病源传播风险。尽管目前已经有不少骨修复材料获得临床应用，但单纯材料生物活性普遍不足，严重影响了其临床使用效果。
对骨生长和修复有促进作用的骨形态发生蛋白生长因子的发现为提高骨修复材料的活性提供了有效的手段。bmp属于转化生长因子tgf-β超家族成员，于1965年首次被发现。到目前为止，已发现20余种bmp成员。其中bmp-2研究最为广泛，其诱导成骨作用已得到证实，并且已分别获美国食品和药物管理局（fda）和欧洲药品管理局（emea）批准用于临床，具有广阔的应用前景。bmp是一种疏水性非胶原酸性糖蛋白，存在于动物骨组织中，但含量极低，每千克鲜骨中仅分离出几微克bmp，且分离过程繁杂，纯度低，重复性差，质量控制困难，难以满足临床需求。利用基因重组技术不仅可以实现规模化生产，还可以避免免疫排斥反应，具有极佳的发展前景。
目前，bmp-2可以采用真核细胞和原核细胞两种系统表达。真核细胞表达系统使用哺乳动物细胞，其表达产物可以糖基化，有更好的翻译后修饰，活性相对较高。目前的国外产品大多采用真核表达体系制备。但真核体系表达量低，因此表达产物回收及纯化均困难，导致生产成本很高。目前国外bmp产品的价格十分昂贵，临床推广难度很大。与真核表达系统相比，原核细胞表达系统具有表达效率高、对培养环境耐受性强、易于控制，产物稳定、生产成本低等优点，更利于临床推广。但其主要问题是较难正确加工和折叠形成有活性的蛋白质，特别是可重复性的复性和纯化的难度很大，致使大部分工作停留在实验室水平，无法实现产业化。
技术实现要素：
本发明提出一种重组人骨形态发生蛋白的制备方法。
一种重组人骨形态发生蛋白的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）根据大肠杆菌密码子使用频率采用密码子优化软件初步优化hbmp-2的cdna序列，再根据经验值计算，进一步更换其中部分核苷酸编码，得到优化的hbmp-2基因的dna序列；
（2）全基因合成hbmp-2基因dna序列，酶切后插入载体pbv220，获得优化的hbmp-2表达质粒，经酶切和测序验证插入片段与设计相符；
（3）先以常规氯化钙法采用分子克隆技术制备感受态表达系统，随后用所得的表达质粒转化大肠杆菌菌株，在抗性平板中挑取单菌落，培养并抽提质粒，酶切测序；
（4）挑取重组子，接种于装有含葡萄糖和抗生素的lb培养液的摇瓶中，在气浴振荡器中培养15h，温度30℃、转速180r·min，然后冰浴条件下加入无菌甘油，分装后在80℃冰箱保存，备用；
（5）从含正确表达质粒的大肠杆菌抗性平板中挑取单菌落，接种于含氨苄青霉素的lb培养液摇瓶中；在摇床中培养8h温度30℃、转速180r·min，再按体积比为1:10的比例将培养物接种到lb培养基中培养4h，条件：ph7.0±0.2，温度30℃，转速180r·min；
（6）随后升温至42℃进行诱导，继续培养6h；
（7）结束培养，在（4±2）℃温度下离心分离（转速7500r·min−1）收集菌体，裂解后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；
（8）将收集的菌体，与te缓冲溶液按1g:10ml的比例混合，再按1g:1mg的比例与溶菌酶混合，采用高压均质法进行菌体破碎，离心分离（转速10000r·min−1）并收集沉淀；
（9）加入洗涤溶液（1g沉淀物/20ml洗涤液），搅拌2h后，在（4±2）℃下离心分离，收集沉淀物；
（10）沉淀物用0.5%曲拉通水溶液洗涤数次后，加入10mmol·l−1的tris（ph7.5）溶液（1g沉淀物/20mltris），清洗后离心收集沉淀，得包涵体；
（11）包涵体/10ml的比例加入裂解液；
在（4±2）℃下，搅拌裂解8h，然后离心[转速10000r·min−1，温度（4±2）℃]30min，弃沉淀，取离心上清液加入含复性助剂的复性液中，稀释至蛋白含量为0.1mg·ml−1，复性7d；
（12）从复性液中回收有活性的融合蛋白二倍体，然后在30～7℃下冻干，得到目标蛋白。
本发明所述方法通过截取编码rhbmp-2羧基端氨基酸肽段的rhbmp-2的cdna制备大肠杆菌rhbmp-2菌株，通过发酵及工艺优化，获得bmp包涵体，经分离纯化与复性，制得成品纯度高。
具体实施方式
一种重组人骨形态发生蛋白的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）根据大肠杆菌密码子使用频率采用密码子优化软件初步优化hbmp-2的cdna序列，再根据经验值计算，进一步更换其中部分核苷酸编码，得到优化的hbmp-2基因的dna序列；
（2）全基因合成hbmp-2基因dna序列，酶切后插入载体pbv220，获得优化的hbmp-2表达质粒，经酶切和测序验证插入片段与设计相符；
（3）先以常规氯化钙法采用分子克隆技术制备感受态表达系统，随后用所得的表达质粒转化大肠杆菌菌株，在抗性平板中挑取单菌落，培养并抽提质粒，酶切测序；
（4）挑取重组子，接种于装有含葡萄糖和抗生素的lb培养液的摇瓶中，在气浴振荡器中培养15h，温度30℃、转速180r·min，然后冰浴条件下加入无菌甘油，分装后在80℃冰箱保存，备用；
（5）从含正确表达质粒的大肠杆菌抗性平板中挑取单菌落，接种于含氨苄青霉素的lb培养液摇瓶中；在摇床中培养8h温度30℃、转速180r·min，再按体积比为1:10的比例将培养物接种到lb培养基中培养4h，条件：ph7.0±0.2，温度30℃，转速180r·min；
（6）随后升温至42℃进行诱导，继续培养6h；
（7）结束培养，在（4±2）℃温度下离心分离（转速7500r·min−1）收集菌体，裂解后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；
（8）将收集的菌体，与te缓冲溶液按1g:10ml的比例混合，再按1g:1mg的比例与溶菌酶混合，采用高压均质法进行菌体破碎，离心分离（转速10000r·min−1）并收集沉淀；
（9）加入洗涤溶液（1g沉淀物/20ml洗涤液），搅拌2h后，在（4±2）℃下离心分离，收集沉淀物；
（10）沉淀物用0.5%曲拉通水溶液洗涤数次后，加入10mmol·l−1的tris（ph7.5）溶液（1g沉淀物/20mltris），清洗后离心收集沉淀，得包涵体；
（11）包涵体/10ml的比例加入裂解液；
在（4±2）℃下，搅拌裂解8h，然后离心[转速10000r·min−1，温度（4±2）℃]30min，弃沉淀，取离心上清液加入含复性助剂的复性液中，稀释至蛋白含量为0.1mg·ml−1，复性7d；
（12）从复性液中回收有活性的融合蛋白二倍体，然后在30～7℃下冻干，得到目标蛋白。