一种应用可回收磁性纳米固定酶水解秸秆的方法与流程

本发明涉及一种应用可回收磁性纳米固定酶水解秸秆的技术，属于生物新材料应用领域。

背景技术：

作为农业大国，我国每年会产生7-9亿吨各类秸秆，其中玉米、小麦与水稻三种作物的秸秆占80％左右。由于秸秆产量巨大，自2005年起，秸秆综合处理项目成为国家重点支持项目，尤其是以秸秆为原料水解生产葡萄糖继而发酵乙醇的产业。然而，秸秆中可以水解为葡萄糖的主要成分是纤维素，需要在纤维素酶的作用下才能水解成单体，而纤维素的使用成本相对较高，使得该技术的实际应用受到很大制约。根据实际测算，酶制剂在纤维素乙醇工业中的总成本占近三分之一，是产业发展的主要瓶颈。

在2015-04-08公开的申请号为201410637435.7的一种磁性固定化纤维二糖酶纳米介孔材料及其制备方法。该材料通过对酶进行固定，实现了酶的多次利用，并通过磁性材料提高了回收的操作性。该发明通过实验证实，固定化纤维二糖酶在实验室中针对纤维二糖水解成葡萄糖的过程是有效的，可以通过磁铁有效富集。但将这类材料用于实际秸秆的处理，目前尚无实践数据，也没有可以采纳的方法。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种应用可回收磁性纳米固定酶水解秸秆的方法，确立秸秆的处理方式与水解条件，解决秸秆水解的实际问题，磁性固定化酶可以反复使用，活性得到保持，将这一生产技术的成本控制在合理空间下。

为实现上述目的，本发明技术方案为：

一种应用可回收磁性纳米固定酶水解秸秆的方法，该方法实施步骤如下：步骤1：在预处理后的秸秆中加入浓度为0.1mol/L的缓冲溶液进行水解反应，产生固液比为1∶3-1∶20的固液混合物，该固液混合物的pH值为4-6；所述的缓冲溶液包括醋酸-醋酸钠缓冲溶液，或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液；步骤2：在步骤1的固液混合物中加入纤维素酶，所述纤维素酶包括添加量为秸秆干重0.1-0.5％的纤维素酶，和活力在1-100IU/g的纤维素酶；步骤3：在40-60℃温度中，进行24-72小时的水解反应，获得最终水解反应溶液；步骤4：检测最终水解反应溶液中的葡萄糖浓度；步骤5：最终水解反应溶液经过葡萄糖浓度测定后用于发酵乙醇。

上述技术方案的有益之处在于：

在本发明应用可回收磁性纳米固定酶水解秸秆的方法是将秸秆在经过预处理之后，加入少量纤维素酶，在恒温条件下进行水解。水解后，采用磁铁回收固定酶，回收率在80-100％之间，可以达到10次以上仍保持一定活力，且得到酶的活力保持在75-100％之间。水解反应后的葡萄糖溶液经过测定后用于发酵乙醇。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明磁性固定化酶的生产方法实施例所使用的设备示意图；

图2是本发明实施例一中回收酶的活力保持率的示意图；

图3是本发明实施例二中回收酶的活力保持率的示意图；

图4是本发明实施例三中回收酶的活力保持率的示意图。

具体实施方式

为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚、明白，以下结合附图和实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明公开的一种应用可回收磁性纳米固定酶水解秸秆的方法，所述的秸秆包括但不仅限于玉米秸秆、小麦秸秆、水稻秸秆、红薯秸秆、大豆秸秆等，该方法中涉及的秸秆是经过预处理的秸秆，预处理技术包括但不仅限于切割粉碎、水煮、蒸汽、球磨、爆破、微波等物理手段，并包括但不限于酸洗、碱洗、有机溶剂等各类化学手段，也包括酶解、真菌处理等生物手段，由此脱除其中有抑制作用的副产物，如多酚类物质。

本发明涉及的纤维素测定方法如下：

准确称取1.0000～1.0500g试样(G1)于洁净的250mL磨口锥形瓶中，加入25mL 20％硝酸乙醇溶液，装上回流冷凝管于沸水浴中加热1h，在预先恒重的玻璃砂芯滤器中小心倾倒出上清液，真空抽滤，将滤渣小心移回原锥形瓶中，重复上述操作数次，直至纤维变白为止。最后将锥形瓶中全部内容物移入过滤器，抽真空过滤，用10mL 20％硝酸乙醇溶液洗涤残渣，再用热水洗涤至洗液用甲基橙试剂检验不呈酸性，最后用10mL乙醇分2次洗涤，滤渣于105℃烘干至恒重(G2)。纤维素含量公式：

所述的应用可回收磁性纳米固定酶水解秸秆的方法，实施步骤如下：

步骤1：取切割粉碎、水煮、蒸汽、球磨、爆破、微波等物理手段后的玉米秸秆、小麦秸秆、水稻秸秆、红薯秸秆、大豆秸秆等，。

步骤2：在预处理后的秸秆中加入浓度为0.1mol/L的缓冲溶液进行水解反应，产生固液比为1∶3-1∶20的固液混合物，该固液混合物的pH值为4-6；所述的缓冲溶液包括醋酸-醋酸钠缓冲溶液，或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液；

步骤3：在步骤1的固液混合物中加入纤维素酶，所述纤维素酶包括添加量为秸秆干重0.1-0.5％的纤维素酶，和活力在1-100IU/g的纤维素酶的；

步骤4：在40-60℃温度中，对固液混合物混合加热、搅拌或震荡进行24-72小时的水解反应，获得最终水解反应溶液；其中的搅拌的速度为60-180转/分，震荡的频率为25-150转/分。所述的搅拌或震荡形式包括且不限于搅拌桨、磁子、震荡箱。水解反应中的反应器皿包括且不限于玻璃反应容器、塑料反应容器及金属反应容器。

步骤5：检测最终水解反应溶液中的葡萄糖浓度。。

步骤5：检测最终水解反应溶液中采用酶活仪进行测定葡萄糖浓度。

步骤6：最终水解反应溶液经过测定后用于发酵乙醇。。

上述步骤2中所述的添加量为秸秆干重0.1-0.5％的纤维素酶为市售自由酶，所述的活力在1-100IU/g的纤维素酶为磁性固定化酶；请结合图1所示。

该磁性固定化酶的生产方法，包括如下步骤：

步骤一：按质量份称取下列组份：反应底物100份、模板溶液100份、四氧化三铁粉末2份、纤维素酶20份；反应底物为正硅酸四乙酯和二甲基二硅氧烷，其中正硅酸四乙酯质量占比80％、二甲基二硅氧烷质量占比20％；模板溶液为葡萄糖溶液，葡萄糖质量百分比为30％；

步骤二：按步骤一中称取的反应底物的物质量，并按以下摩尔比称取盐酸，反应底物与盐酸的摩尔比为150∶1，所述的盐酸浓度为0.17mol/L；

步骤三：将步骤一中称取的反应底物置于储罐1中，并通过泵11加入反应釜5中；

步骤四：通过冷水浴将反应底物冷却至10℃；

步骤五：将步骤二中的盐酸置于储罐2中，并通过泵21向反应釜5中的反应底物滴加盐酸并用搅拌器52搅拌直至得到的溶液变得澄清透明，控制反应温度不超过30℃，搅拌速度为100转/分钟；

步骤六：将步骤一中称取的模板溶液置于储罐3中，并通过泵31向步骤五得到的溶液加入模板溶液，并用搅拌器52搅拌至混合均匀，搅拌速度为100转/分钟；

步骤七：通过真空泵6和冷却器7对反应釜5中步骤6所得溶液进行减压蒸馏直至不再产生挥发，以去除反应溶液中的副产物乙醇，得到溶胶；所述的减压蒸馏压力为0.005MPa，温度为25℃，副产物乙醇冷却回到到回收罐8中

步骤八：关停真空泵6和冷却器7，将浓度为0.4mol/L的氢氧化钠溶液加入储罐4中，通过泵41向步骤7得到的溶胶滴加上述氢氧化钠溶液并用搅拌器52搅拌，滴加速率为1L/min，并实时监测PH值，直至pH值达到3.5，通过加料口52向反应釜5加入步骤1中称取的四氧化三铁粉末和纤维素酶，继续滴加氢氧化钠溶液，直至pH值达到4.2，搅拌速度为100转/分钟；

步骤九：将步骤八得到的反应产物从反应釜5转移至开口容器9中，冷却至0℃并保持12小时，得到凝胶；

步骤十：将所述的凝胶采用粉碎机粉碎成粒度为0.2mm以下的颗粒，并进行干燥，采用铝箔袋包装干燥后的磁性固定化酶。

上述实施例中，在步骤一中，通过在反应底物中添加二甲基二硅氧烷调节最终产品的特点，使磁性固定化酶具有更好的韧性，避免在使用过程中易破碎的问题。在步骤四中通过冷水浴将反应底物温度控制在10℃，有效避免了常温下反应导致热量聚集造成的生产危险，确保工业生产的可操作性。在步骤五中，通过滴加方式添加盐酸，避免一次性加入导致反应过于剧烈，以便于更好地控制反应速率，提高反应安全性。在步骤七中通过减压蒸馏去除反应副产物乙醇，避免了乙醇对纤维素酶的活力造成影响，同时也可避免后续的凝胶速率过慢。在步骤八中通过在中和过程中间加入四氧化三铁和纤维素酶的方式，避免了在反应前期加入，由于粘度小、酸性高，四氧化三铁和纤维素酶直接加入时容易发生团聚的问题，同时也避免到了在反应后期加入，由于体系粘度高，四氧化三铁和纤维素酶不易分散的问题，从而根本上解决了包覆不均匀问题。在步骤九中采用酸性条件下进行凝胶，避免了中性条件下凝胶不易转移的问题，并避免了中性条件下凝胶出现的凝胶不均匀的问题。在步骤十中，采用铝箔袋包装生产的磁性固定化酶，可避免酶失活，从而提高磁性固定化酶的存储稳定性。由于本发明的实施例主要步骤均在反应釜中实现，因此本生产方法具有对设备要求不高、工艺简便、可操作性高等优势。上述步骤4水解反应后，可以采用磁铁回收磁性固定化酶，留作下一次使用。采用的磁铁为永磁铁或电磁铁，且所述的永磁铁采用钕铁硼磁铁；将磁铁放置于步骤4中的水解反应的设备中，搅拌最终水解反应溶液，即可通过磁铁吸附回收出磁性固定化酶。所述的磁性固定化酶的的回收方法还可以采用磁场强度在0.2-0.4T之间的电磁铁将最终水解反应溶液中的磁性固定化酶吸取之后，断电即可回收。

磁铁回收磁性固定化酶前，酶的活力需要先进行测定，一个IU是指一分钟催化1微摩尔底物所需的酶量。具体测定方式为，采用1克滤纸作为底物，投入m克酶(自由酶或固定酶均可)，反应t分钟后，有c克滤纸转变为了葡萄糖，葡萄糖的摩尔质量为M克/摩尔(酶的活力公式)：

在得到一个IU代表的酶量后，根据底物的质量，计算所需的酶量。

作为进一步改进，本发明中的磁性固定化酶回收方法为磁性回收方法，采用的磁铁为永磁铁或电磁铁。永磁铁通常采用钕铁硼磁铁，放置于反应设备中搅拌，即可回收出磁性固定化酶。采用电磁铁回收较永磁铁更为便捷，磁场强度在0.2-0.4T之间，将固定化酶吸取之后，断电即可回收。

回收后的磁性固定化酶，回收率在80-100％之间。磁性固定化酶回收率的计算方式：

将回收的酶按照同样的反应条件，测定反应速率，得到酶的活力保持在75-100％之间。测定方法为，首次反应，反应周期内的纤维素转化率为x1，回收之后，同样反应周期内的纤维素转化率为x2，则酶的活力保持率公式：

本实施例将固定化酶用磁铁进行回收，并用于下一次反应，其他反应条件均不变。

本发明证实，磁性固定化酶用于秸秆水解，可以达到10次以上仍保持一定活力。

实施例一

取蒸汽爆破后的玉米秸秆100克，爆破温度150℃，压力15atm。经过测试，爆破后的秸秆烘干后，纤维素含量为41％。经过热水洗涤后，纤维素含量上升至50％。

取干燥秸秆10克放入圆底烧瓶中，按照固液比1∶10加入100克醋酸-醋酸钠缓冲溶液，使pH保持在4.8。混合溶液加热到50℃，采用磁子搅拌的形式进行反应，并按照100IU/g的比例，加入4g磁性固定化酶，另加入10μg市售自由酶，即添加比例为秸秆干重的0.1％。反应24小时后，测定出葡萄糖浓度为2，430mg/dL，折合葡萄糖的转化率为44％。

将磁性固定化酶用磁铁进行回收，并用于下一次反应，其他反应条件均不变。回收酶的活力保持率如下图2所示。

实施例二

取少量水稻秸秆，采用球磨机进行研磨，研磨时间24小时。经过测试，秸秆的纤维素含量为32％，经过热水洗涤后，纤维素含量上升至38％。

取干燥秸秆粉末3克，加入塑料离心管中，按固液比1∶3投入醋酸醋酸钠缓冲溶液，将pH值调节到6，放入恒温震荡箱中，震荡频率为40转/分，温度控制在60℃，按照底物活力1IU/g的标准加入0.15克固定化酶，另加入15μg市售自由酶，即相当于秸秆干重的0.5％，反应72小时，测定出反应后葡萄糖浓度为3,310mg/dL，折合葡萄糖转化率为26％。

将固定化酶用磁铁进行回收，并用于下一次反应，其他反应条件均不变。回收酶的活力保持率如图3所示。

实施例3

取小麦秸秆100克，加入0.4mol/L的氢氧化钠溶液，煮沸1小时，将碱液滤去，处理后的秸秆经测定，纤维素含量为36％。

称取秸秆10克加入不锈钢罐中，按照固液比1∶20投入柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，采用搅拌桨搅拌的形式进行反应，搅拌速率为100转/分，pH值控制在4.0，开动搅拌，温度控制在40℃，按照底物活力20IU/g的标准加入1g固定化酶，另加入20μg市售自由酶，即秸秆干重的0.2％，反应48小时，测定出反应后的葡萄糖浓度为550mg/dL，折合葡萄糖转化率为30.6％。

将固定化酶用磁铁进行回收，并用于下一次反应，其他反应条件均不变。回收酶的活力保持率如图4所示。

上述说明示出并描述了本发明的优选实施例，如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。