通过改造糖多孢红霉菌SACE_3980基因提高红霉素产量的方法与流程

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种通过改造糖多孢红霉菌SACE_3980基因提高红霉素产量的方法。

背景技术：

红霉素是由糖多孢红霉菌次级代谢产生，属于典型的聚酮类抗生素，其组分包括红霉素A(Er-A)、红霉素B(Er-B)、红霉素C(Er-C)、红霉素D(Er-D)、红霉素E(Er-E)和红霉素F(Er-F)等。该类抗生素有广谱抗菌作用，其抗菌谱与青霉素相似，对革兰阳性菌有较强的抑制作用。红霉素各组分中临床上广泛应用的是红霉素A，它的抑菌活性最高，而红霉素系列化学衍生物(克拉霉素、阿奇霉素、罗红霉素、泰利霉素等)也被广泛用来治疗感染性疾病，红霉素及其衍生物每年的销售额达数百亿美元。

红霉素在医药领域具有重要作用，但其产率仍有待提高。传统优化发酵条件提高红霉素A产量的方法耗时且不经济，不适合广泛应用。而通过基因工程的方法，在糖多孢红霉菌染色体中增加合成基因的拷贝数，或通过基因敲除的方法改造调控基因来获得红霉素高产菌株，有着很好的前景。

2003年Rodriguez等报道红霉素高产主要是由于其调控基因，而不是合成基因，更使我们将研究重点转向调节基因。2005年，Ramos等以序列相似性、结构和功能为标准将原核生物转录调控子分成LysR、AraC/XylS、TetR、LuxR、LacI、ArsR、IcIR、MerR、AsnC、MarR、NtrC(EBP)、OmpR、DeoR、Cold shock、GntR和Crp共16个家族。其中TetR家族调控基因在DNA结合结构域上有高度的保守性，广泛参与调控多药抗性、抗生素合成、渗透性应激反应等生物活动。近年来报道了多种参与抗生素或链霉菌形态分化的TetR家族转录调控子，比如SCO1712，SAV151，SAV576，jadY，atrA等，暗示着TetR家族调控基因在链霉菌次级代谢及抗生素生物合成中的重要性。糖多孢红霉菌全基因组中有101个TetR家族基因，然而关于糖多孢红霉菌次级代谢TetR家族调控基因研究依然很少，报道的仅有参与调控糖多孢红霉菌形态分化的调控基因SACE_7040、SACE_0012和调控红霉素合成代谢基因SACE_5599、SACE_3986，SACE_3446，SACE_7301等，且对于其调节红霉素产量的精确机制阐明的还未清楚。

技术实现要素：

本发明目的就是通过缺失糖多孢红霉菌中负调控基因SACE_3980，通过改造糖多孢红霉菌SACE_3980基因提高红霉素产量方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种通过改造糖多孢红霉菌SACE_3980基因提高红霉素产量方法，其特征在于：通过基因工程途径使糖多孢红霉菌中SACE_3980基因失活，获得糖多孢红霉菌红霉素高产工程菌株，用所述的菌株发酵生产红霉素。

所述的一种通过改造糖多孢红霉菌SACE_3980基因提高红霉素产量方法，其特征在于所述的SACE_3980基因产物可以负向调控红霉素生物合成。

SACE_3980基因在工业菌株中的应用，其特征在于：在工业高产菌株中缺失TetR家族转录基因SACE_3980，获得高产突变株，可用于红霉素生产。

本发明的优点是：

本发明研究中筛选到了红霉素生物合成负调控子SACE_3980，通过基因工程途径缺失糖多孢红霉菌染色体上SACE_3980基因拷贝，能够获得红霉素高产菌株，为工业生产提高红霉素发酵产量提供技术支持。

糖多孢红霉菌A226中敲除SACE_3980基因时红霉素产量提高了29.3％，而在ΔSACE_3980缺失突变株中回补SACE_3980基因，红霉素产量得到恢复，表明SACE_3980是一个参与红霉素生物合成的负调控因子。利用工业高产菌株WB作为出发菌株，在其染色体上缺失SACE_3980基因，使红霉素产量提高15.8％，说明缺失SACE_3980基因提高红霉素产量的技术在工业高产菌株中同样适用。

附图说明

图1：SACE_3980基因及周边邻近基因在染色体上的位置信息；

图2：本发明的染色体片段同源重组技术示意图及缺失突变株的PCR鉴定，

(A)ΔSACE_3980突变体构建示意图，

(B)ΔSACE_3980突变体的PCR鉴定：SACE_3980基因(639bp)被tsr抗性基因(1360bp)替换后长度变为1727bp；M,5000bp DNA Marker；

图3：出发菌株A226及缺失突变株ΔSACE_3980的抑菌分析及红霉素A每日产量分析，

(A)A226出发菌株和ΔSACE_3980突变株发酵液的抑菌分析，

(B)出发菌株A226和缺失突变株ΔSACE_3980六天红霉素A产物的HPLC分析；

图4：SACE_3980基因回复、过表达菌株的构建及红霉素A产量分析，

(A)A226/pIB139-3980回补、过表达菌株的PCR鉴定:PCR产物为apr抗性基因(776bp)；M,5000bp DNA Marker，

(B)出发菌株A226、缺失突变株ΔSACE_3980、缺失回补菌株及回补空载对照菌株、过表达菌A226/pIB139-3980及过表达空载对照菌株红霉素A的HPLC分析；

图5：SACE_3980基因对菌株形态分化的影响及ΔSACE_3980突变株生物量的测定，

(A)ΔSACE_3980突变株和野生型A226菌株的孢子生长情况，其中1：A226菌株，2：ΔSACE_3980突变株，3：回复菌株ΔSACE_3980/pIB139-3980，4：过表达菌株A226/pIB139-3980，

(B)ΔSACE_3980突变株和野生型A226菌株菌丝体的生物量测定。

图6：红霉素工业高产菌株WB/SACE_3980缺失突变株的构建及红霉素A产量分析，

(A)WB/ΔSACE_3980突变体的PCR鉴定：SACE_3980基因(639bp)被tsr抗性基因(1360bp)替换后长度变为1727bp；M,5000bp DNA Marker，

(B)高产菌株WB及缺失突变株WB/ΔSACE_3980红霉素A产量的HPLC分析。

具体实施方式

实施例1

1.1菌株、质粒与生长条件

试验中使用到的菌株和质粒见表1。大肠杆菌在37℃的液体LB培养基或在添加1.25％琼脂的固体LB平板上培养。红霉素产生菌糖多孢红霉菌及其工程菌株在30℃胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养基或在含有2.2％琼脂的R3M平板上培养。

1.2材料、DNA操作与测序

PEG3350、溶菌酶、TES、酪蛋氨基酸、硫链丝菌肽、安普霉素从Sigma公司购买。TSB、酵母提取物、蛋白胨购买于Oxoid公司。甘氨酸、琼脂粉、氯化钠和其它生物学试剂都购于试剂公司。大肠杆菌和糖多孢红霉菌的一般操作技术按照标准操作。引物的合成和DNA测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

表1研究中所用的菌种和质粒

表2本发明构建合成的引物

1.3 SACE_3980基因缺失突变体的构建

试验中合成的引物序列见表2。pUCTSR质粒是在pUC18的BamH I和Sma I酶切位点之间插入1360bp的硫链丝菌肽抗性基因(tsr)。为了敲除糖多孢红霉菌中的SACE_3980基因，分别用3980-P1/3980-P2和3980-P3/3980-P4为引物、糖多孢红霉菌A226基因组为模板，PCR扩增SACE_3980基因的上、下游各约1.5kb的同源片段。

分别将上述两个3980-U和3980-D上下游片段分别连接到pUCTSR的tsr抗性基因序列两侧，完成构建质粒pUCTSRΔ3980；以3980-P1和3980-P4为引物、pUCTSRΔ3980质粒为模板，PCR扩增3980U-tsr-D大片段，利用染色体片段同源重组技术将3980U-tsr-D大片段转化糖多孢红霉菌原生质体中，根据硫链丝菌肽抗性筛选阳性突变株，获得SACE_3980基因被tsr替换的基因工程菌株。以3980-P5和3980-P6作为鉴定引物，以质粒pUCTSRΔ3980为阳性模板，A226基因组为阴性模板进行PCR鉴定，阳性缺失突变体命名为ΔSACE_3980(见图3A)。

1.4 SACE_3980基因回复菌株的构建

利用设计的引物3980-P7和3980-P8扩增出SACE_3980基因，并电泳回收，使用NdeI和Xba I内切酶分别对回收到的SACE_3980基因片段与pIB139进行双酶切并回收，通过T4DNA连接酶将SACE_3980基因片段连接到pIB139上，成功获得整合型质粒pIB139-3980。然后通过PEG介导的原生质体转化方法将pIB139-3980导入ΔSACE_3980原生质体中。通过安普霉素初步筛选，以安普霉素抗性基因(apr)为对象进行PCR鉴定，获得的回复菌株命名为ΔSACE_3980/pIB139-3980。

1.5出发菌株A226中过表达SACE_3980基因

pIB139-3980通过PEG介导的原生质体转化技术导入糖多孢红霉菌A226原生质体中，以安普霉素抗性基因(apr)为对象进行PCR鉴定，获得阳性菌株命名为A226/pIB139-3980。

1.6糖多孢红霉菌发酵产物HPLC检测

接种糖多孢红霉菌于TSB培养基，在30℃振荡培养48小时后，转接至R5液体培养基，30℃振荡培养144小时，然后利用有机溶剂对发酵液进行萃取，使用水浴锅蒸干后，加入1mL甲醇溶解并使用0.22μm有机滤膜处理，后上机检测样品中的红霉素A含量。

1.7糖多孢红霉菌菌丝体生物量检测

以相同的接种量分别将ΔSACE_3980突变株与A226接种于30mL的液体TSB中，30℃摇床培养48小时后，转接到R5培养基中30℃转速220rpm摇床培养144小时，期间设置不同时间段取样，用无水乙醇清洗后烘干称量菌体干重，每次重复取样两次，并取得平均值，测量结束后根据实验数据绘制菌体生物量曲线。

1.8红霉素工业高产菌株WB/ΔSACE_3980菌株的构建及HPLC检测

在红霉素工业高产菌株WB中缺失SACE_3980，验证正确菌株命名为WB/ΔSACE_3980。并将WB高产菌株与缺失突变株WB/ΔSACE_3980的发酵产物进行HPLC检测。突变株构建过程和HPLC检测参考上述1.3和1.6方法。

结果分析：

2.1缺失突变株ΔSACE_3980较出发菌株A226红霉素产量提高。

SACE_3980与临近基因在糖多孢红霉菌染色体上的位置见图1。SACE_3980基因缺失突变株A226/ΔSACE_3980构建过程见图2A。SACE_3980基因缺失突变体在含有30μg ml^-1硫链丝菌肽的R3M平板上筛选并通过PCR证实(见图2B)。

ΔSACE_3980在R5液体培养基中发酵6天(144h)，离心收集发酵上清液；点样于含枯草芽孢杆菌菌液的LB平板表面，37℃培养12小时后观察平板上抑菌圈大小，结果显示：ΔSACE_3980的发酵液抑菌圈较A226明显偏大(见图3A)，初步推断SACE_3980基因可能是负调节于红霉素的产量。

将发酵液萃取后，经HPLC检测每日红霉素A产量，发现第六天ΔSACE_3980较出发菌株A226的产量提高了28.3％(见图3B)，HPLC结果再次表明SACE_3980是参与红霉素生物合成的负向调控子。

2.2 SACE_3980基因回复与过表达。

为了验证突变体ΔSACE_3980中红霉素产量的提高是因为SACE_3980基因缺失引起的，将SACE_3980基因表达载体pIB139-3980和pIB139载体(作为对照)，分别导入ΔSACE_3980突变株和出发菌株A226的原生质体中，获得回复菌株及空载ΔSACE_3980/pIB139-3980、ΔSACE_3980/pIB139，过表达菌株及空载A226/pIB139-3980、A226/pIB139，PCR鉴定证实(见图4A)。后将A226及ΔSACE_3980系列突变株进行摇瓶发酵，HPLC检测结果显示：ΔSACE_3980的红霉素A产量较A226升高29.3％；回复菌株ΔSACE_3980/pIB139-3980的红霉素A产量较A226基本恢复；A226/pIB139-3980的红霉素A产量相比于A226降低约20％(见图4B)；HPLC检测结果进一步表明SACE_3980基因能够负调红霉素A的生物合成。

2.3缺失SACE_3980基因对菌体生长及孢子形态分化的影响。

测定发酵6天的ΔSACE_3980突变株与A226菌株的菌体干重，绘制相应变化曲线，结果显示ΔSACE_3980较A226的生物量差异不大(见图5A)，暗示着SACE_3980基因的缺失并未影响菌体的初级代谢。

为了确定SACE_3980基因是否调控菌体的孢子形成，将突变株ΔSACE_3980、回复菌株ΔSACE_3980/pIB139-3980、过表达菌株A226/pIB139-3980以及野生型对照菌株A226同时涂于R3M平板上，30℃培养72小时，观察菌株孢子生长情况。结果显示相比于A226，ΔSACE_3980突变体的孢子形态无明显差异(图5B)，说明SACE_3980基因的缺失不影响孢子的形成。

2.4改造的工业高产菌株WB/ΔSACE_3980使红霉素产量提高。

首先进行WB/ΔSACE_3980突变株的构建，构建过程参照图2A，PCR鉴定见图6A。后将WB/ΔSACE_3980突变株及工业高产菌株WB涂板活化，然后分别接入工业种子培养基的摇瓶中，30℃转速220rpm下培养2天后，转接工业发酵培养基中，继续培养6天。发酵结束后萃取浓缩经HPLC分析，相比较出发菌株WB，WB/ΔSACE_3980的红霉素产量分别提高了15.8％(见图6B)。这说明高产菌株WB中SACE_3980基因同样参与调节红霉素的产量。

CCCAAGCTTGCGGTGTTCATCAGCGCGAT

GCTCTAGAGCTCGACGAACAGCCGGATG

CGGGGTACCAGATCACCACCGTCCTGCG

CCGGAATTCAGCCTCAACGTGCGGTTCA

GCATGCCACAAAGGCTAACTCGGT

AAGTCAGCACAGGCGTCCTCAGT

GGAATTCCATATGATGGCGGTCATGAGCGAGCC

GCTCTAGATCAGCCGCAGCAGGCGGCC

GGAGTGCATATGGTGCAATACGAATGGCGAAAAG

CTCAAAGCTTCAGCCAATCGACTGGCGAGCG