一种酸胁迫抗性提高的毕赤酵母的制作方法

文档序号：12412140阅读：273来源：国知局

本发明涉及一种酸胁迫抗性提高的毕赤酵母，属于生物工程技术领域。

背景技术：

在利用有机酸生产菌株，发酵生产有机酸的过程中，随着有机酸的积累，胞外pH不断下降，有机酸的解离度也持续下降从而以未解离态进入细胞。细胞质中较高的pH使得有机酸解离，释放出质子不断积累，最终导致细胞质酸化并影响细胞代谢的代谢和生长从而影响发酵过程。在工业生产中，通常加入大量NaOH、CaCO₃等中和剂以维持培养基的pH稳定。但中和剂的添加也导致了发酵液的渗透压升高和后期产物纯化成本增加。因此提高微生物的有机酸耐受性是提高产量的途径之一。

毕赤酵母具有表达蛋白易于纯化，产量高等优点，因此使用较为广泛。但是毕赤酵母对酸胁迫的耐受能力较差，不利于研究毕赤酵母作为发酵产酸菌株。

技术实现要素：

为了克服上述问题，本发明提供了一种提高毕赤酵母酸胁迫抗性的方法，所述方法是以Pichia pastoris GS115为宿主、pPICZα为载体表达干酪乳杆菌来源的精氨酰琥珀酸裂解酶ArgH。

在一种实施方式中，所述ArgH的氨基酸序列是SEQ ID NO.1或者SEQ ID NO.2所示的序列。

本发明的第二个目的是提供了一种酸胁迫抗性提高的毕赤酵母基因工程菌，所述毕赤酵母基因工程菌以Pichia pastoris GS115为宿主、pPICZα为载体表达干酪乳杆菌来源的精氨酰琥珀酸裂解酶ArgH。

在一种实施方式中，所述毕赤酵母基因工程菌的构建方法，如下：

(1)通过PCR方法或者化学合成的方法获得精氨酰琥珀酸裂解酶基因；

(2)将步骤(1)获得的精氨酰琥珀酸裂解酶基因连接到毕赤酵母表达载体pPICZα上，得到重组质粒pPICZα-ArgH；

(3)将步骤(2)获得的重组质粒pPICZα-ArgH电转入Pichiapastoris GS115得到表达精氨酰琥珀酸裂解酶的基因工程菌株。

本发明的有益效果：

(1)本发明通过表达原核来源的精氨酰琥珀酸裂解酶基因，有效提高了真核微生物的酸胁迫抗性。

(2)本发明还优化了精氨酰琥珀酸裂解酶的氨基酸序列，发现优化后的序列能够更高幅度地提高毕赤酵母的耐酸水平。

具体实施方式

BMGY培养基(g/L)：酵母粉10g，胰蛋白胨20g，甘油20g，(NH₄)₂SO₄10g，YNB 3.4g，1moL/L KH₂PO₄-K₂HPO₄缓冲液(pH6.0)100mL，生物素4×10^-5g；

BMMY培养基(g/L)：酵母粉10g，胰蛋白胨20g，(NH₄)₂SO₄10g，YNB 3.4g，1moL/L KH₂PO₄-K₂HPO₄缓冲液(pH6.0)100mL，生物素4×10^-5g。

实施例1：重组菌的构建

(1)重组质粒pMD19-T-ArgH的构建

采用化学合成或者PCR的方法，得到含有编码氨基酸序列为SEQ ID NO.1或者SEQ ID NO.2的基因片段，然后将基因片段连接到pMD19-T质粒上，并转化大肠杆菌，验证正确的转化子，得到重组质粒pMD19-T-ArgH。抽提pMD19-T-ArgH和pPICZα质粒，然后双酶且pMD19-T-ArgH和pPICZα质粒4h，0.7％琼脂糖凝胶电泳分析。利用割胶回收试剂盒回收目的片段，16℃连接4h后，利用化学转化法，转化大肠杆菌DH5α。筛选正确的转化子，得到重组质粒pPICZα-ArgH。

(2)毕赤酵母基因工程菌的构建

以SacI线性化的表达载体pPICZα-ArgH电转化Pichiapastoris GS115。将验证正确的菌株保种，得到毕赤酵母基因工程菌Pichiapastoris GS115-pPICZα-ArgH。

其中酵母感受态的制备方法如下：

(a)从新鲜YPD平板上挑取毕赤酵母菌落于25mL YPD液体培养基中，30℃，200r/min培养20h；

(b)将0.5mL上述培养液转接到25mL YPD液体培养基中，30℃，200r/min培养8h(大约OD600＝1.3-1.5)；

(c)吸取1mL上述菌液于1.5mL无菌的EP管中，4000r/min离心2min，收集菌体，用1.5mL预冷的无菌水，吹打悬浮细胞；

(d)4000r/min离心2min，收集菌体，用1mL预冷的无菌水重新悬浮细胞；

(e)4000r/min离心2min，收集菌体，用1.5mL预冷的1moL/L山梨醇悬浮细胞；

(f)4000r/min离心2min，收集菌体，用100μL预冷的1moL/L山梨醇混匀细胞，5min后方可使用。

电穿孔转化法如下：

(I)提前预热电穿孔仪；

(II)取80μL酵母感受态细胞与20μL线性化的表达载体，轻轻混匀，冰浴5min；后转入预冷的0.2cm电击杯中；

(III)将电击杯外水汽彻底擦干净，放入电击室；

(IV)按电转参数：1.5kV，25μF，200，5ms进行电击；

(V)电击后立即加入1mL预冷的1moL/L山梨醇于电击杯中，轻轻吹打后，将内容物全部转入无菌的1.5mL EP管中，于30℃复活培养1h；

(VI)4000r/min离心5min，去除750μL上清液，将剩余的菌液涂布到含有100μg/mL zeocin的YPDS平板上，30℃培养3-5d。

按照上述方法，得到了2株毕赤酵母基因工程菌Pichiapastoris GS115-pPICZα-ArgH1(表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1的酶)、Pichiapastoris GS115-pPICZα-ArgH2(表达氨基酸序列如SEQ ID NO.2的酶)。

实施例2 ArgH蛋白的诱导表达与检测

(a)将实施例1得到的2株毕赤酵母工程菌分别取单菌落接种于50mL生长培养基BMGY/500mL三角瓶中，30℃，200r/min培养20h；

(b)将上述BMGY生长培养基中的菌液，室温静置1h，弃掉上清液，用30mL BMMY培养基重新悬浮菌体，加入100％甲醇至终浓度为1％(v/v)，30℃，200r/min培养，每隔24h补加100％甲醇至终浓度为1％(v/v)进行诱导48h。

并用SDS-PAGE蛋白电泳检测毕赤酵母工程菌中ArgH蛋白得到表达。

实施例3酸胁迫下生长性能试验

对于考察菌株在胁迫条件下的生长情况，将毕赤酵母基因工程菌Pichia pastoris GS115-pPICZα-ArgH1、Pichia pastoris GS115-pPICZα-ArgH2接种于BMGY生长培养基中的菌液，室温静置1h，弃掉上清液，用30mL BMMY培养基重新悬浮菌体，加入100％甲醇至终浓度为1％(v/v)，30℃，200r/min培养，诱导12h。

然后将诱导后的菌株接种至新鲜的BMMY培养基中，其中BMMY培养基用乳酸调节至pH 5.0。分别测定Pichiapastoris GS115-pPICZα-ArgH1、Pichiapastoris GS115-pPICZα-ArgH2在胁迫条件下的生长性能，以不表达外源基因的Pichiapastoris GS115-pPICZα为对照。

结果显示，经生长性能试验分析，Pichiapastoris GS115-pPICZα-ArgH1菌株相对于Pichia pastoris GS115-pPICZα生物量有约48％的提高，Pichia pastoris GS115-pPICZα-ArgH2菌株相对于Pichiapastoris GS115-pPICZα生物量有约21％的提高，说明在Pichiapastoris GS115中表达了ArgH蛋白后，菌株耐酸性显著提高。

实施例4酸胁迫条件下耐受性试验

对于考察菌株对酸的耐受性分析试验，分别测定了毕赤酵母基因工程菌Pichia pastoris GS115-pPICZα-ArgH1、Pichiapastoris GS115-pPICZα-ArgH2和对照菌株在pH 4.5条件下的存活率。

具体操作方式如下：将菌株诱导培养至OD 2.0，离心收集细胞，经0.85％的生理盐水洗涤两次后重悬于等体积的新鲜的pH 4.5(乳酸调节)的BMMY中，胁迫不同时间。胁迫后的菌悬液洗涤两次后重悬于等体积生理盐水中，取10μL重悬液，稀释不同梯度点种于BMMY平板上测定活菌数和存活率。

经耐受性实验分析，在pH 4.5的BMMY中胁迫6h后，Pichia pastoris GS115-pPICZα-ArgH1、Pichiapastoris GS115-pPICZα-ArgH2的存活率分别是对照菌株的2.56倍、1.49倍，说明毕赤酵母基因工程菌对酸胁迫的耐受性显著提高。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

<110> 吴银娣

<120> 一种酸胁迫抗性提高的毕赤酵母

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 467

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Gly Thr Ala Gly Met His Met Thr Asp Lys Leu Trp Gly Gly Arg

1 5 10 15

Phe Thr Glu Lys Ala Ala His Trp Val Asp Ala Phe Gly Ala Ser Ile

20 25 30

Gly Phe Asp Gln Gln Met Ala Ser Glu Asp Leu Glu Gly Ser Leu Ala

35 40 45

His Val Lys Met Leu Gly Lys Thr Gly Ile Ile Pro Gln Ala Asp Ala

50 55 60

Asp Thr Ile Thr Ala Gly Leu Gln His Leu Gln Lys Glu Leu Ala Ser

65 70 75 80

Gly Lys Leu His Phe Thr Val Glu Asn Glu Asp Ile His Leu Asn Met

85 90 95

Glu Ala Leu Leu Thr Ala Glu Ile Gly Pro Val Ala Gly Lys Leu His

100 105 110

Thr Ala Arg Ser Arg Asn Asp Gln Val Ala Thr Asp Leu His Leu Trp

115 120 125

Leu Lys His Arg Leu Pro Thr Ile Lys Glu Ala Leu Thr Asn Leu Gln

130 135 140

Thr Val Leu Val Gly Gln Ala Lys Val His Ala Ala Thr Ile Met Pro

145 150 155 160

Gly Tyr Thr His Met Gln His Ala Gln Pro Ile Thr Tyr Gly His Tyr

165 170 175

Leu Leu Ala Tyr Phe Glu Met Phe Gln Arg Asp Trp Glu Arg Phe Asp

180 185 190

Phe Thr Gln Lys His Thr Asp Ile Leu Pro Leu Gly Ala Ala Ala Leu

195 200 205

Ala Gly Thr Thr Phe Pro Ile Asp Arg Thr Leu Val Ala Gln Glu Leu

210 215 220

Gly Phe Asp Gln Ile Tyr His Asn Ser Leu Asp Ala Val Ser Asp Arg

225 230 235 240

Asp Phe Ala Leu Glu Phe Leu Ser Asn Ser Ala Ile Leu Met Gln His

245 250 255

Leu Ser Arg Met Ala Glu Glu Leu Ile Leu Trp Ser Thr Tyr Glu Phe

260 265 270

Asn Tyr Ile Glu Leu Gly Asp Asp Phe Ser Thr Gly Ser Ser Ile Met

275 280 285

Pro Gln Lys Lys Asn Pro Asp Phe Ala Glu Leu Ile Arg Gly Lys Thr

290 295 300

Gly Arg Val Tyr Gly Ala Leu Met Gly Leu Leu Thr Thr Met Lys Ala

305 310 315 320

Ile Pro Leu Ala Tyr Asn Lys Asp Met Gln Glu Asp Lys Glu Pro Ile

325 330 335

Phe Asp Ala Tyr Asn Thr Ile Leu Gly Ser Leu His Ile Phe Thr Gly

340 345 350

Met Leu Ser Asp Leu Thr Val His Glu Lys Arg Met Ala Glu Ala Thr

355 360 365

Thr His Asp Phe Ser Asn Ala Thr Glu Leu Ala Asp Tyr Leu Ala Thr

370 375 380

Lys Gly Val Pro Phe Arg Gln Ala His Ala Ile Val Gly Glu Leu Val

385 390 395 400

Leu Lys Gly Ile Lys Thr Asn Thr Ala Leu Gln Glu Met Pro Leu Ser

405 410 415

Glu Leu Gln Ala Ala Ala Pro Gln Ile Gln Gln Asp Val Tyr Ala Glu

420 425 430

Leu Thr Ser Lys Ala Ala Val Asp Arg Arg Thr Ser Leu Gly Gly Thr

435 440 445

Ala Val Ser Asn Val Leu Lys Glu Val Ala Arg Asp Glu Glu Met Ile

450 455 460

Ala Ser His

465

<210> 2