一种刺五加提取物诱导发酵黑木耳菌及其菌丝体制备方法与流程

本发明属于食用菌领域，涉及一种利用中药材-刺五加提取物制备黑木耳菌丝体的方法，还涉及到通过该方法制备具有保健功能的黑木耳菌丝体。

背景技术：

黑木耳（Auricularia auricula）隶属真菌门、担子菌亚门、木耳目、木耳科、木耳属真菌，主要由菌丝体和子实体组成。其中菌丝体是黑木耳的营养器官，相当于高等绿色植物的根、茎、叶，是黑木耳的主体；黑木耳的子实体，又称担子果，是我们烹饪食用的部分。黑木耳含有丰富的碳水化合物（胶质）、蛋白质、膳食纤维、钙、铁、维生素等，具有清胃涤肠、抗凝血、预防血栓等病的发生，有防治动脉粥样硬化和冠心病的作用。

刺五加（Eleutherococcus senticosus）是一种传统中药材，具有调节机体紊乱、益气健脾、补血安神、抗疲劳、改善体内循环系统等功能；目前利用刺五加茎、干作为黑木耳栽培基料，生产刺五加黑木耳的栽培技术已在黑龙江省获得推广，栽培方法已获得了“一种黑木耳的生产方法”（CN1762193A）专利权，但尚无涉及到以中药材-刺五加提取物为诱导物，通过液体发酵法制备黑木耳菌丝体的方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种利用刺五加提取物诱导发酵黑木耳菌制备菌丝体的方法，以刺五加提取物为诱导物，通过液体发酵法制备黑木耳菌丝体。

本发明首先提供了一种刺五加提取物诱导发酵黑木耳菌及其菌丝体制备方法，以野生黑木耳菌为出发菌株，在培养基中添加了刺五加提取物，通过液体深层发酵，获得黑木耳菌丝体。

为了实现上述目的，本发明主要按照下述步骤进行：

本发明的刺五加提取物诱导黑木耳菌深层发酵生产菌丝体的方法包括下述步骤：

一种制备刺五加提取物诱导发酵黑木耳菌发酵液的方法，将黑木耳菌种子培养液接入灭菌后的发酵培养基，接种量为10 ～ 20％ (v/v)，通风量为每分钟罐容积的50 ～ 100％，发酵罐压力为0.02 ～ 0.05Mpa，在25 ～ 28℃下发酵培养7 ～ 9 天，得到黑木耳菌发酵醪；其中所述的发酵培养基配方为：葡萄糖5 ～ 9g/L、玉米粉8 ～ 12 g/L、豆粉1 ～ 3 g/L、刺五加0.5 ～ 2.5 g/L、消泡剂0.1 ～ 0.5 g/L、调节pH 值5.5 ～ 6.5。

所述的消泡剂可以为植物油( 豆油、菜籽油) 类、有机醚类等物质。

其中，所述的黑木耳种子培养液优选通过以下方法制备得到：

液体种子培养：将经活化的摇瓶菌种接入灭菌后的液体种子培养基，接种量为0.1 ～ 2.0 %，通风量为每分钟罐容积的50 ～ 100％，罐压为0.02 ～ 0.05Mpa，在24 ～ 28℃下培养4 ～ 6 天，得到黑木耳液体种子培养液；

所述的液体种子培养基配方优选为：葡萄糖15 ～ 25 g/L、马铃薯淀粉3.5 ～ 5 g/L，调节pH 值5.0 ～ 6.5。

所述的发酵培养终点为：还原糖降至最低，且还原糖控制0.3％ (g/100g) 以下；镜检菌丝细长，无杂菌污染。

所述的刺五加提取物，通过扩大刺五加提取物主要化学成分与黑木耳菌丝体的接触面积，加入刺五加提取物的量与产生的菌丝体生物量成正比。但是，加入到液体培养基中刺五加提取物的比例有一定的限制，刺五加提取物占培养基的重量体积浓度为0.5 ～ 5 g/L，更优选1 ～ 2.5 g/L。

所述的发酵菌丝体的干燥：发酵7-9天后，发酵醪经过滤，得到发酵液和黑木耳菌丝体。菌丝体匀浆后，再经冷冻干燥（条件为：温度-10℃～ -50℃，真空1.3 ～ 13帕）或喷雾干燥（条件为：进口温度180℃，出口温度100℃）或热风干燥（条件为：热风温度80℃），得到黑木耳菌丝体。

本发明的优点及效果：

本发明根据生物体的生物酶作用机制和产物的累积作用，在普通培养基中添加中药材-刺五加提取物，制备的黑木耳菌丝体及其产品具有色泽天然美观、风味独特、营养丰富和一定的保健作用的特点。

附图说明

图1 不同浓度刺五加提取物对黑木耳菌丝体生物量的影响。

图2 黑木耳多糖对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞增殖能力。

具体实施方式

所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W)百分比浓度、质量/体积(W/V)百分比浓度或体积/体积(V/V)百分比浓度。

实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1 ：不同浓度刺五加提取物诱导发酵对黑木耳菌丝生长的影响

1、黑木耳发酵液的制备：将活化好的黑木耳菌按接种量1％接种于1L种子培养基中，其中种子培养基为，在BD PDA^TM 培养基( 一种标准培养基，美国生产)，在25±0.1℃下培养4 天，得到黑木耳液体种子培养液；将黑木耳种子培养液接入灭菌后的发酵培养基，发酵培养基配方为：葡萄糖7 g/L、玉米粉10 g/L、豆粉2 g/L、刺五加提取物浓度分别为0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g/L ，调节pH 值为5.5，接种量为8％(v/v)，28℃下发酵培养7天。

2、菌丝干重测定: 取 100 mL 发酵醪, 3000 r/min 离心10 min, 收集菌丝体，

水洗多次后, 于55 ℃烘干至恒重, 分析天平称重。

3、结果

不同浓度刺五加提取物对黑木耳菌丝体生长的影响结果见图1，由图可知，刺五加提取物能明显提高黑木耳菌丝体产量，刺五加提取物添加量在1 g/L时对黑木耳生长的促进作用达到最大，菌丝体干重为不添加的1.29倍。

实施例2：刺五加提取物诱导发酵对黑木耳菌丝体形态及其多糖产量的影响

1、黑木耳发酵液的制备：将活化好的黑木耳摇瓶菌株按接种量1％接种于种子培养基，其中种子培养基为，在BD PDA^TM 培养基( 一种标准培养基，美国生产)，在25±0.1℃下培养4 天，得到黑木耳液体种子培养液；将黑木耳种子培养液接入灭菌后的发酵培养基(4L)，发酵培养基配方为：葡萄糖7 g/L、玉米粉10 g/L、豆粉2 g/L、刺五加提取物2.5 g/L、消泡剂0.2 g/L、调节pH 值5.5，接种量为12％(v/v)，通风量为每分钟罐容积的50 ～ 100％，罐压0.02～0.05Mpa，在28℃下发酵培养7天，还原糖降至最低0.2％并略有波动；镜检菌丝细长，无杂菌污染。即得黑木耳发酵液3.1Kg。

2、黑木耳菌丝体多糖制备：将黑木耳菌丝体干燥后，料液比1:40（m/v）,装入5L酶解反应釜中，升温至50℃（40 ～ 50℃均可），调节pH 6.0（5.0 ～ 6.0均可），然后加入菌体干重1 ～ 2％（具体为2.0g）的复合酶（纤维素酶：果胶酶：木瓜蛋白酶=2:1:1，质量比），搅拌酶解3小时（3 ～ 6小时均可）；95℃下保持20min灭酶活，离心取上清液，浓缩，加入4V体积的无水乙醇，4℃下过夜醇沉，然后除去乙醇，冻干后得到菌丝体多糖。

3、单糖组成分析方法：1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮柱前衍生高效液相色谱（PMP- HPLC）法测定单糖组成。取2 mg待测样品，加入1 mL的0.2 mol/L三氟乙酸， 120 ℃下水解120 min，冷却，N₂吹干，加入50 μL的 0.3 mol/L NaOH，再加入50 μL 的0.5 mol/L PMP，在70 ℃下反应60 min，衍生结束后，加50 μL 的0.3 mol/L HCl中和剩余碱，加1 mL的0.1 mol/L PBS缓冲液和1 mL氯仿萃取，收集上层水相，重复萃取3 ～ 4次，上机分析。

液相分析条件为:色谱柱: ZORBAX Eclipse XDB -C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相: 0.1 mol /L， pH 6.8磷酸盐缓冲液与乙腈的混合溶剂(两者体积比为83:17)；柱温：30 ℃，紫外检测波长: 248 nm；流速: 1 mL/min；进样体积: 10μL。

4、抗氧化性测试方法：采用ABTS自由基清除能力与氧自由基清除能力（Oxygen radical absorbance capacity，ORAC_FL）测试。测试结果均以水溶性的维生素E衍生物Trolox为标准对照，计算每克多糖样品相当于Trolox物质的量 (μmol)，最终抗氧化性以μmol Trolox /g表示。

5、结果

添加刺五加提取物对黑木耳菌丝体生长的影响结果见表1。

表1：刺五加提取物诱导发酵对黑木耳菌球生长的影响

由表1可知，随着发酵时间的延长，小型菌球（D<1）数目在逐渐减小，中型（1≤D≤2）和大型菌球（2 <D≤3）数目逐渐增加。与对照相比，添加刺五加提取物后，黑木耳的大型菌球在发酵中后期（5 ～ 9d）积累速度明显增快。发酵9d时，大型菌球的比例高达94.47%。说明刺五加提取物诱导发酵促进黑木耳菌丝体快速生长，提前进入代谢产物流向。

刺五加提取物对黑木耳菌丝体生物量和多糖组成及抗氧化性的影响结果见表2。

表2 刺五加提取物对黑木耳菌体生物量和多糖组成及抗氧化性的影响

从表2得知，与对照比，发酵液中添加刺五加提取物可将黑木耳菌丝体生物量提高33.3%，胞内多糖组成中半乳糖含量增加35.3%、葡萄糖含量下降39.1%，抗氧化性增强5.8倍。

实施案例3、刺五加提取物诱导发酵黑木耳菌丝体多糖体外免疫试验

1、材料

（1）刺五加提取物诱导发酵黑木耳菌丝体多糖 按本发明方法制备

添加刺五加提取物诱导发酵所得黑木耳菌丝体多糖 自制

（2）小鼠巨噬细胞RAW264.7 来源于天津科技大学

2、方法

（1）细胞毒性测试：采用MTT比色法。计数RAW264.7细胞，细胞浓度达到5×10⁴cell/mL，取100μL加入到96孔板，在37℃下，于含5% CO₂细胞培养箱内贴壁培养24h，移除上清培养基，加入浓度为50 ～ 250µg/mL的待测样品，置含5% CO₂细胞培养箱继续培养24h后，加入10μL MTT（5mg/mL），37℃孵育4h，去除上清，再加入150μL DMSO，溶解活细胞与MTT生成的甲瓒物质，震荡20min，490nm下测定吸光值，以空白培养基为对照。

细胞存活能力（%）= 样品OD₄₉₀nm值/空白OD₄₉₀nm值×100

（2）NO释放量和细胞因子分泌量测试：NO释放量采用Griess法测试。计数RAW264.7细胞，浓度达到2×10⁶cell/mL时，取100μL加入到96孔板，在37℃条件下，含5% CO₂ 细胞培养箱内贴壁培养24h，移除上清培养基，加入浓度为50 ～ 200µg/mL的待测样品，以1μg/mL LPS和空白培养基为对照，置细胞培养箱培养24h后，吸取50μL的细胞上清液与50μL的Griess试剂（1%的磺胺与0.1%的NDP溶于5%的磷酸）置于室温反应5min，于540nm测OD值，以NaNO₂（10 ～ 100μM）为标准品绘制标准曲线，其中横坐标x为NaNO₂浓度，纵坐标y为吸光度值。细胞因子TNF-α、IL-6、IL-10释放量采用ELISA酶联免疫试剂盒进行测试。

3、结果

刺五加提取物诱导发酵黑木耳菌丝体多糖对小鼠巨噬细胞RAW264.7毒性实验的结果见图2。由图2可知，多糖在50-250μg/mL范围内无细胞毒性，且具有促进RAW264.7细胞增殖的作用。

刺五加提取物诱导发酵黑木耳菌丝体多糖激活小鼠巨噬细胞RAW264.7释放NO和细胞因子（TNF-α、IL-6和IL-10）的结果见表3。

表3 黑木耳多糖激活细胞RAW264.7释放细胞因子

从表3可知， 50 μg/mL刺五加黑木耳多糖显著激活巨噬细胞RAW264.7释放细胞因子TNF-α、IL-6和IL-10，在200 μg/mL浓度下促进NO的释放量。说明刺五加提取物诱导发酵黑木耳菌丝体多糖对巨噬细胞RAW264.7具有调节免疫活性的能力。

实施案例4、刺五加提取物诱导发酵黑木耳菌制备的菌丝体干品营养成分检测

蛋白质采用GB5009.5 - 2010第一法；总糖采用GB/T15672 - 2009；膳食纤维采用GB5009.88 - 2014；微量元素钙采用GB/T5009.92 - 2003；铁采用GB/T5009.90 - 2003。

检测结果表明本发明制备的黑木耳菌丝体营养成分（见表4）包括：

蛋白质15％（质量百分含量）或以上，蛋白质是指菌丝体蛋白；

总糖56％（质量百分含量）或以上，总糖是指可溶性多糖和单糖，具体包括大分子聚糖、葡萄糖等；

膳食纤维42％或以上，膳食纤维是指菌体中的不含低聚糖、抗性淀粉、抗性麦芽糊精等的膳食纤维；

微量元素钙500mg/100g或以上，钙是指菌体中总的钙元素；

微量元素铁25mg/100g或以上，铁是指菌体中总的铁元素；

表4黑木耳菌丝体的营养成分