本发明涉及生物技术领域中，番茄212个SNP位点及其在鉴定番茄品种真实性和种子纯度中的应用。
背景技术：
番茄(Lycopersicon esculentum L.)是我国设施蔬菜生产的主要作物之一，也是北京市种植面积最大和产值较高的蔬菜作物，在保障首都市民菜篮子供应中起到了重要作用。由于番茄及其制品的独特食用、保健及辅助治疗的功效，在世界农业生产和贸易中占有重要的地位。根据世界加工番茄理事会(WPTC)发布的统计数据：2013年全球加工番茄产量为3,301.2万吨。伴随着我国番茄种业的优势发展，市场上出现了一些套牌品种，以次充好，影响了种植户的产量和收入；甚至有人非法盗取育种材料进行繁种，严重影响了我国育种单位的利益及我国番茄种业的健康发展。但是目前对番茄品种真实性鉴定在国内并没有统一的标准可依。如何对我国番茄种子市场进行规范，并加强自主知识产权品种的培育和保护，提供优良番茄品种真实性的快速、准确鉴定的方法以服务于种子执法单位的监管检测及育种单位种子质量内部控制，成为番茄生产中迫切需要解决的问题之一。
传统鉴定番茄品种真实性的方法主要有形态学田间小区鉴定法。田间小区鉴定方法主要是对番茄的子叶、叶片、第一束花的形成时间和果实的颜色、果实室数、果实表面构造和抗病特性等主要园艺形状进行鉴别，从而判断品种真实性及种子纯度。这种方法较费时、费工，占用大量的土地，需要经过3-5个月的生长成熟期；有时可用于品种鉴定的形态特征数目有限，且多数形态性状易受环境因素的影响，所以仅靠形态特征来鉴别品种真实性及种子纯度的准确率会受到影响。快速测定法中有一些是生化技术，特别是聚丙烯酰胺电泳法，用于检测种子中贮藏蛋白和同工酶遗传组成的差异，是目前使用较多的室内检测方法。用于番茄品种种子纯度鉴定的同工酶主要有POD，EST，ACP，ADH，MDH等，但由于栽培番茄遗传变异小、多态性较低、可利用的酶种类少，且表达与组织发育及发育时期有关，难以用于一些F1杂种的品种鉴定与纯度检测。
以DNA为基础的分子标记如RFLP、RAPD、SSR、AFLP与ISSR等，具有检测位点数量多、多态性高、遗传稳定、不受环境条件影响等优点，已开始应用于蔬菜作物品种真实性鉴定与纯度检测中。
单核苷酸多态性(Single-nucleotide polymorphism，SNP)是指基因组核苷酸序列中由单个核苷酸水平上的变异而引起的基因组水平上的DNA序列多态性，主要包括单个碱基的缺失、插入、转换及颠换等。SNP标记即为在此基础上发展起来的第三代分子标记，该标记类型具有突变频率低，遗传稳定性高；位点丰富，分布广泛；检测快速，筛选规模化等特点。与第二代分子标记相比，SNP标记不需要根据DNA片段大小进行分型，能够摆脱传统凝胶电泳这种步骤相对繁琐，低通量，价格又较贵的检测方法。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是如何鉴定番茄品种真实性和种子纯度。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了212个SNP位点在鉴定番茄品种真实性或种子纯度中的应用。
本发明所提供的212个SNP位点在鉴定番茄品种真实性或种子纯度中的应用中，所述212个SNP位点的物理位置是基于番茄品种Heinz 1706的全基因组序列比对确定的，所述番茄品种Heinz 1706的全基因组序列的版本号为SL2.50；所述212个SNP位点的编号为001-212；编号为001-212的所述212个SNP位点见实施例1。
为解决上述技术问题，本发明还提供了用于检测212个SNP位点基因型的成套引物。
本发明所提供的用于检测212个SNP位点基因型的成套引物中，所述212个SNP位点用于鉴定番茄品种真实性或种子纯度，所述212个SNP位点为实施例1中所述212个SNP位点；所述成套引物由636条引物组成；所述636条引物的序列为如下c1)、c2)、c3)或c4)：
c1)下述c11)、c12)和c13)：
c11)序列表中序列3n-2的第22位至末位核苷酸所示的212条序列；
c12)序列表中序列3n-1的第22位至末位核苷酸所示的212条序列；
c13)序列表中序列3n所示的212条序列；其中，n为1-212中的一个自然数；
c2)在c1)中c11)、c12)或c13)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的序列；
c3)与c1)或c2)限定的序列具有85％以上的同一性的序列；
c4)在严格条件下与c1)或c2)限定的序列杂交的序列。
检测每个SNP位点的脱氧核苷酸均需要三条引物，两条上游引物(记为P1和P2)和一条下游引物(记为P3)。其中，序列表中序列3n、序列3n-1与序列3n-2检测同一个SNP位点，序列3n-1与序列3n-2均为上游引物的序列，序列3n为下游引物的序列。序列表中序列1-636中，各序列的第1位均为相应引物的5’端。
c2)所述在c1)中c11)、c12)或c13)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的序列可为在c1)中c11)、c12)和c13)的636条序列中的至少一条的5′端和/或3′端添加一至三十个核苷酸得到的序列。在本发明的实施例中，所述P1和所述P2的序列为在序列3n-2和序列3n-1的5’端添加21个核苷酸得到的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明所述的成套引物中的任一引物的序列具有85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
上述85％以上同一性，可为85％、90％或95％以上的同一性。
上述成套引物中，c11)可为序列表中序列3n-2所示的212条序列；和/或，c12)可为序列表中序列3n-1所示的212条序列；
和/或，c11)所述212条序列和c12)所述212条序列所示的引物均可由荧光物质标记。
其中序列3n-2的第1-21位核苷酸均为gaaggtcgga gtcaacggat t，序列3n-1的第1-21位核苷酸均为gaaggtgacc aagttcatgc t
上述成套引物中，所述荧光物质具体可为FAM或VIC。
在本发明的实施例中，每个SNP位点的两条上游引物中一条的5’端由FAM标记，另一条的5’端由VIC标记。进行检测时，三条引物混在一起进行检测。
上述成套引物中的各对引物可以单独使用分别进行单独的PCR扩增，也可一起使用进行多重PCR。各对引物一起使用时，所述成套引物中的各引物的摩尔数均相同。各对引物单独使用时，这引物对间的配比没有要求。每种引物对中的三条引物的摩尔比均可为1∶1∶1。
所述成套引物中的各引物对均可独立包装，各单链DNA也均可独立包装。
为解决上述技术问题，本发明还提供了番茄品种真实性的鉴定方法。
本发明所提供的番茄品种真实性的鉴定方法，包括比较待测番茄样品基因组DNA的212个SNP位点基因型；根据比较结果确定所述待测番茄样品是否为同一品种；所述212个SNP位点为实施例1中所述的212个SNP位点；所述待测番茄样品的个数为两个或两个以上。
为解决上述技术问题，本发明还提供了番茄种子纯度的鉴定方法。
本发明所提供的番茄种子纯度的鉴定方法，包括比较待测番茄样品基因组DNA的212个SNP位点基因型；根据比较结果确定所述待测番茄种子纯度；所述212个SNP位点为实施例1中所述的212个SNP位点；所述待测番茄样品的个数为两个或两个以上。
为解决上述技术问题，本发明还提供了番茄SNP指纹图谱构建方法。
本发明所提供的番茄SNP指纹图谱构建方法，包括比较待测番茄样品基因组DNA的212个SNP位点基因型，根据所述212个SNP位点基因型构建所述待测番茄样品的SNP指纹图谱；所述212个SNP位点为实施例1中所述的212个SNP位点。
上述番茄品种真实性的鉴定方法、上述番茄种子纯度的鉴定方法和上述番茄SNP指纹图谱构建方法中，所述待测番茄样品基因组DNA的212个SNP位点基因型均可通过包括如下步骤的方法进行检测：利用所述成套引物对所述待测番茄样品基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR产物，检测所述PCR产物确定所述待测番茄样品基因组DNA的212个SNP位点基因型。
上述番茄品种真实性的鉴定方法、上述番茄种子纯度的鉴定方法和上述番茄SNP指纹图谱构建方法中，所述PCR扩增可为荧光定量PCR扩增。进行所述荧光定量PCR扩增的反应体系中各条引物的浓度均可为1.4pmol/L。进行所述荧光定量PCR扩增的反应体系具体可为：基因组DNA 50ng，引物混液0.07μL(引物混液中的实施例1的成套引物的各条引物的浓度为均100pmol/L)，LGC公司2×KASP Mix(Low Rox)2.5μL。所述荧光定量PCR扩增可利用荧光定量PCR仪AB-Q6Flex进行。
所述PCR扩增也可利用Douglas Scientific公司的ArrayTape平台进行。利用ArrayTape平台进行PCR扩增的反应体系中各条引物的浓度均可为1.4pmol/L。利用ArrayTape平台进行PCR扩增的反应体系具体可为基因组DNA(50ng/μL)0.8μL，引物混液0.03μL(引物混液中的实施例1的成套引物的各条引物的浓度为均100pmol/L)，LGC公司2×KASP Mix(Std Rox)0.8μL。
上述番茄品种真实性的鉴定方法、上述番茄种子纯度的鉴定方法和上述番茄SNP指纹图谱构建方法中，所述PCR扩增的退火温度可为55-62℃。所述PCR扩增的退火温度具体可为55-57℃。进行所述PCR扩增的条件具体可为a1)或a2)：95℃ 10min；95℃ 20s，55℃ 60s，40个循环；a2)94℃ 10min，94℃ 15s，57℃ 1min，40个循环。其中循环数均不限于40个。
上述番茄品种真实性的鉴定方法、上述番茄种子纯度的鉴定方法和上述番茄SNP指纹图谱构建方法中，可根据仪器自带软件对所述PCR产物进行分析，得到所述待测番茄样品基因组DNA的212个SNP位点基因型，如荧光定量PCR仪AB-Q6Flex或所述ArrayTape平台的自带软件。
上述番茄品种真实性的鉴定方法中，确定所述待测番茄是否为同一品种的具体方法可为：在两个待测番茄的所述212个SNP位点中，如两个待测番茄的差异个数≥5，这两个待测番茄为或候选为“不同品种”；如两个待测番茄的差异个数≥2且＜5，这两个待测番茄为或候选为“近似品种”；如两个待测番茄的差异个数＜2，这两个待测番茄为或候选为“极近似或相同品种”。
上述番茄种子纯度的鉴定方法中，根据所述待测番茄样品基因组DNA的所述212个SNP位点基因型的比较结果确定所述待测番茄种子纯度具体可为根据公式1和公式2计算待测番茄种子纯度；
种子纯度p＝(NT-ND)/NT×100％(公式1)，其中p表示利用一个SNP位点得到的种子纯度，NT表示供检种子数目，ND表示利用一个SNP位点得到的杂种子数目；
种子纯度P＝利用所述212个SNP位点中各个SNP得到的种子纯度之和/n(公式2)，其中n表示所用的所述212个SNP位点中的SNP数目。
上述番茄种子纯度的鉴定方法中，在鉴定种子纯度时，可先利用所述212个SNP位点对待测样本进行测试选出有利于鉴定所述待测样本种子纯度的SNP位点，选出的SNP位点可为1-212个(即212≥n≥1，n为自然数)，然后再利用选出的SNP位点进行进一步的检测。
为解决上述技术问题，本发明还提供了用于番茄品种真实性或种子纯度鉴定的212个SNP分子标记。
本发明所提供的用于番茄品种真实性或种子纯度鉴定的212个SNP分子标记，为实施例1中所述212个SNP位点的脱氧核苷酸。
为解决上述技术问题，本发明还提供了下述任一应用：
X1)所述成套引物在制备鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性产品中的应用；
X2)所述成套引物在制备鉴定或辅助鉴定番茄种子纯度产品中的应用；
X3)所述成套引物在鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性中的应用；
X4)所述成套引物在鉴定或辅助鉴定番茄种子纯度中的应用；
X5)所述成套引物在番茄育种中的应用；
X6)所述番茄SNP指纹图谱构建方法在鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性中的应用；
X7)所述番茄SNP指纹图谱构建方法在鉴定或辅助鉴定番茄种子纯度中的应用；
X8)所述番茄SNP指纹图谱构建方法在番茄育种中的应用；
X9)所述212个SNP分子标记在制备鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性产品中的应用；
X10)所述212个SNP分子标记在制备鉴定或辅助鉴定番茄种子纯度产品中的应用；
X11)所述212个SNP分子标记在鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性中的应用；
X12)所述212个SNP分子标记在鉴定或辅助鉴定番茄种子纯度中的应用；
X13)所述212个SNP分子标记在番茄育种中的应用；
X14)检测212个SNP位点核苷酸的物质在制备鉴定番茄品种真实性产品中的应用；
X15)检测212个SNP位点核苷酸的物质在鉴定番茄品种真实性中的应用；
X16)检测212个SNP位点核苷酸的物质在制备鉴定番茄种子纯度产品中的应用；
X17)检测212个SNP位点核苷酸的物质在鉴定番茄种子纯度中的应用；
X18)检测212个SNP位点核苷酸的物质在番茄育种中的应用；
所述212个SNP位点为实施例1中所述的212个SNP位点。
本发明利用212个SNP位点建立了快速准确、经济简便、稳定可靠的番茄DNA指纹鉴定标准实验体系，并在此基础上开发了一种适用于番茄指纹图谱库构建及品种真实性鉴定、种子纯度鉴定的方法。本发明利用本发明的用于检测212个SNP位点基因型的成套引物进行番茄品种鉴定，在时间上充分提高了实验效率，具有快速、准确、操作方便等优势，并且鉴定结果不受环境影响。本发明建立的精确、快速、高通量和高度自动化的基于SNP标记的番茄品种真实性鉴定及种子纯度鉴定技术体系，为保护我国番茄育种单位产权利益、维护我国番茄育种产业健康快速发展提供技术支撑，对规范、监管种子市场、保护种植户的产量和收入具有重要的现实意义。
附图说明
图1为100份番茄品种的聚类分析结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、用于检测212个SNP位点基因型的成套引物的制备
(1)通过查找文献，获得覆盖番茄12条染色体的7,000个SNP位点信息(Sim SC，et al.(2012)High-Density SNP Genotyping of Tomato(Solanum lycopersicum L.)Reveals Patterns of Genetic Variation Due to Breeding.Plos One 7(9)：e45520-e45520.)。
(2)从以上SNP位点中选出212个SNP位点，这212个SNP位点的物理位置及其侧翼序列是基于番茄品种Heinz 1706的全基因组序列(版本号SL2.50)比对确定的，将这212个SNP位点进行编号001-212，这212个SNP位点具体如表1所示。
表1、212个SNP位点信息
检测每个SNP位点的脱氧核苷酸均需要三条引物，两条上游引物(记为P1和P2)和一条下游引物(记为P3)。检测这212个SNP位点由636条引物组成的成套引物(用于检测212个SNP位点基因型的成套引物)进行，这636条引物的两条上游引物和下游引物的序列依次为序列表中序列1-636所示的636条序列，序列表中序列3n、序列3n-1与序列3n-2检测同一个SNP位点，序列3n-1与序列3n-2均为上游引物的序列，序列3n为下游引物的序列，n为1-212中的一个自然数，其中序列3n-2的第1-21位核苷酸均为gaaggtcgga gtcaacggat t，序列3n-1的第1-21位核苷酸均为gaaggtgacc aagttcatgc t。序列表中序列1-636中，各序列的第1位均为相应引物的5’端，每个SNP位点的两条上游引物中一条的5’端由FAM标记，另一条的5’端由VIC标记。进行检测时，三条引物混在一起进行检测。
用于检测212个SNP位点基因型的成套引物中的各条引物均独立包装，各条引物的摩尔数均相等。
实施例2、利用用于检测212个SNP位点基因型的成套引物进行番茄品种真实性鉴定
(1)构建图谱的番茄材料由北京农林科学院蔬菜中心李常保老师提供，从402份材料中，随机选取100份品种材料(表2)。
表2、100份供试番茄品种
(2)提取供试番茄品种的DNA
采用CTAB法提取供试品种的DNA：取番茄幼叶20mg～30mg至2.0mL离心管中，研磨机中研磨10min；加入750μL预热的CTAB提取液后，充分摇匀，65℃水浴45min；加入750μL氯仿，上下混匀3min，12000g离心5min；吸取500μL上清液至另一只2.0mL离心管中，加入0.7倍体积预冷的异丙醇，颠倒离心管数次，12000g离心10min，弃上清液；加入75％乙醇漂洗2次，离心后弃上清液，自然风干；加入100μL 1.0×TE缓冲液，充分溶解后得到供试番茄品种DNA，4℃保存备用。
其中，CTAB提取液的配制方法为：称取20g CTAB和81.816g NaCl溶于适量水中，然后加入1mol/L Tris-HCl(pH＝8.0)100mL，0.5mol/L EDTA溶液(pH＝8.0)40mL，定容至1000mL，在103.4kPa(121℃)条件下灭菌20min。于4℃贮存。
(3)SNP标记检测及反应体系
利用荧光定量PCR仪AB-Q6Flex和Douglas Scientific公司ArrayTape平台进行SNP标记检测：
a.荧光定量PCR仪AB-Q6Flex检测：
5μL PCR荧光定量仪检测反应体系包括：基因组DNA 50ng，引物混液0.07μL(引物混液中的实施例1的成套引物中各条引物的浓度均为100pmol/L)，LGC公司2×KASP Mix(Low Rox)2.5μL。按照荧光定量PCR仪AB-Q6仪器操作手册，编辑样品表，执行运行程序，保存数据。
扩增程序：25℃反应前收集荧光90s，94℃预变性10min，94℃变性15s，57℃复性延伸1min，40个循环。
b.Douglas Scientific公司ArrayTape平台检测：
1.6μL PCR ArrayTape平台检测反应体系包括：基因组DNA(50ng/μL)0.8μL，引物混液0.03μL(引物混液中的实施例1的成套引物中各条引物的浓度均为100pmol/L)，LGC公司2×KASP Mix(Std Rox)0.8μL。根据ArrayTape平台仪器操作手册，编写样品表，运行程序，读取数据。
扩增程序：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性20s，55℃退火60s，40个循环。
(4)数据记录
根据仪器自带软件读取的数据对上述两种检测平台获得的数据进行分析，形成每个番茄品种的指纹图谱。纯合位点的基因型数据记录为Allele1/Allele1或者Allele2/Allele2，杂合位点的基因型数据记录为Allele1/Allele2，其中Allele1，Allele2分别为该变异位点上两个等位碱基；缺失位点基因型数据记录为0。示例1：样品在某个位点上基因型为Allele1/Allele1，该位点的等位碱基为A/C，Allele1代表碱基A，在该位点的基因型记录为A/A。示例2：样品在某个位点上基因型为Allele1/Allele2，该位点的等位碱基为A/C，Allele1代表碱基A，Allele2代表碱基C，在该位点的基因型记录为A/C。
依据检测结果确定待测番茄是否为同一品种：当两个番茄样品间差异位点数≥5，这两个样品为“不同品种”；当两个番茄样品间差异位点数≥2且＜5，这两个样品为“近似品种”；当两个番茄样品间差异位点数＜2，这两个样品为“极近似或相同品种”。
结果分析：通过以上检测，获得100份番茄品种的指纹数据，进行比较后发现，两两品种间的差异SNP位点数都大于5，且利用荧光定量PCR仪AB-Q6Flex和Douglas Scientific公司ArrayTape平台得到的结果相同，说明这212个SNP可以有效的把100份番茄品种鉴别开；利用NTSYS软件进行品种聚类，分析品种间的遗传关系，从图中可以看出可以把所有100份品种全部区别开(图1)。
实施例3、利用用于检测212个SNP位点基因型的成套引物进行番茄种子纯度鉴定
实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：
(1)样品：从送检的JF101番茄品种(北京市农林科学院)的种子中随机选取100-200粒番茄种子进行培育，获得不少于94个番茄单株，连同以及该品种的父本与母本Y15-013\Y15-049(父本与母本作为对照样品，北京市农林科学院)植株，共获得96个样品。
(2)提取供试番茄品种的DNA：采用CTAB法提取上述96个样品的DNA，具体提取方法同实施例2步骤(2)。
(3)PCR扩增：利用荧光定量PCR仪AB-Q6Flex和Douglas Scientific公司ArrayTape平台进行SNP标记检测，反应体系与条件同实施例2步骤(3)。
(4)数据记录：通过水和参照品种作为对照检测反应是否正常，根据仪器自带软件读取的数据对上述两种检测平台获得的数据进行分析，形成每个番茄样品的指纹图谱。纯合位点的基因型数据记录为Allele1/Allele1或者Allele2/Allele2，杂合位点的基因型数据记录为Allele1/Allele2，其中Allele1，Allele2分别为该变异位点上两个等位碱基；缺失位点基因型数据记录为0。示例1：样品在某个位点上基因型为Allele1/Allele1，该位点的等位碱基为A/C，Allele1代表碱基A，则该位点的基因型记录为A/A。示例2：样品在某个位点上基因型为Allele1/Allele2，该位点的等位碱基为A/C，Allele1代表碱基A，Allele2代表碱基C，则该位点的基因型记录为A/C。
指纹数据中与其他种子不一致的种子即为杂种子，利用扩增SNP108的引物对得到的杂种子数目为1，即利用该引物对得到的种子纯度为98.9％，利用SNP110的引物对得到的杂种子数目为1，即利用该引物对得到的种子纯度为98.9％。其余各SNP的结果显示待测的94粒种子均为父本与母本Y15-013\Y15-049的后代，即纯度为100％。
(5)利用公式1与公式2计算种子纯度：种子纯度p＝(NT-ND)/NT×100％(公式1)，其中p表示利用一个SNP位点得到的种子纯度，NT表示供检种子数目，ND表示利用一个SNP位点得到的杂种子数目；种子纯度P＝利用所用的SNP得到的种子纯度之和/n(公式2)，其中n表示所用的SNP数目。
根据公式1与公式2计算该待测番茄种子的种子纯度，n＝212，P＝(100％×210+98.9％×2)/212＝99.99％。