本发明属于棉花分子育种
技术领域：
：，涉及到一种棉花多基因聚合育种材料的分子检测方法，是一种快速棉花育种材料的分子检测方法，主要用于转高产（高衣分FBP：：IaaM）和抗虫等重要基因棉花品系聚合育种过程中棉花材料的分子检测。
背景技术：
：：棉花是关系国计民生的重要战略物资，是仅次于粮食的第二大农作物，涉及到农业和纺织工业两大产业，在国民经济中起着重要作用。近年来，在国家重点基础研究发展计划（973计划）、高技术研究发展计划（863计划）和转基因生物新品种培育重大专项等项目的支持下，以改良品质、提高产量、增强抗逆性等为特征的在第二代转基因技术在棉花遗传改良中取得了突破性进展，中国农业科学院棉花研究所、西南大学、复旦大学等单位在转基因高衣分棉花材料（转FBP：：IaaM基因）（ZhangM.etal.Spatiotemporalmanipulationofauxinbiosynthesisincottonovuleepidermalcellsenhancesfiberyieldandquality,NatureBiotechnology,2011,29(5):453-458.）、转基因大铃优质棉花材料（转RRM基因）（SunF,LiuC,ZhangC.etal.AconservedRNArecognitionmotif(RRM)domainofBrassicanapusFCAimprovescottonfiberqualityandyieldbyregulatingcellsize.MolecularBreeding,2011,30(1),93-101）、海岛棉优质渐渗系（兰孟焦，杨泽茂，石玉真等，陆海BC4F2和BC4F3代换系的评价及纤维产量与品质相关QTL的检测，中国农业科学，2011,44(15):3086-3097.）和棉花优质纤维品种培育(袁有禄,石玉真,李俊文等.转基因抗虫优质杂交棉-中棉所70，中国棉花，2009，2，17.)等方面取得了了突破性进展，要将将上述新材料快速应用于棉花育种实践，亟需发明一种简单、快速和准确性高的分子检测方法。首先，在棉花育种实践中，要将第二代高衣分等转基因新材料快速应用于棉花育种，并与常规育种有机结合起来，形成在棉花分子育种技术体系，亟需发展一系列简单、快速和准确性高的分子检测技术，以提高选择效率、缩短育种周期；其次，随着转Bt基因抗虫棉大面积推广，国内棉花育种单位普遍采用卡那霉素鉴定的方法进行材料抗虫性的早期筛选，但由于棉花遗传转化中应用的标记基因以NptII基因为主，因此，卡那霉素抗性鉴定在转基因高衣分、转基因大铃优质等材料与抗虫品系等育种群体的选择中，难以实现FBP：：IaaM、RRM基因与Bt基因的同步选择，因此，，需要对以卡那霉素鉴定为代表的转基因鉴定方法进行改良，发展一些快速、简便等分子检测方法，为开展棉花分子聚合育种，提高选择效率奠定良好的技术基础。有鉴于此，本发明将卡那霉素抗性鉴定、简化棉花总DNA提取、多重PCR扩增和非变性聚丙烯核酸电泳等技术进行组装，发明了棉花高衣分和抗虫等多基因聚合育种的快速检测方法，可以从多基因聚合育种群体中快速的鉴定出含有FBP：：IaaM基因与抗虫基因的个体，这对于快速利用转FBP：：IaaM基因棉花新材料，实现高衣分、抗虫等重要基因的有效聚合，提高育种效率等均具有重要意义，同时，该方法还可应用于携带有上述基因棉花材料的定性检测。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是提供一种快速实现转FBP：：IaaM亲本及其与转Bt抗虫棉花材料杂交、回交等不同世代材料的FBP：：IaaM与Bt基因的分子检测方法，可以从多基因聚合育种群体中快速的鉴定出含有FBP：：IaaM基因与抗虫基因的个体，技术可靠、操作简便、结果准确、成本低等有优点，可有效提高选择效率，缩短育种周期。本发明提供的技术方案是：一种快速实现转FBP：：IaaM亲本及其与转Bt抗虫棉花材料杂交、回交不同世代材料的FBP：：IaaM与Bt基因的分子检测方法，该方法包括以下步骤：（1）采用喷雾加涂抹的方法对棉花抗性进行卡那霉素鉴定；（2）提取提取含有目的基因棉花基因组DNA；（3）以第（2）步中提取的基因组DNA为模板，将FBP：：IaaM转基因系基因检测特异性引物（P1）、Bt毒蛋白基因（B1）和内标基因Sad1基因引物S1，分别进行单一PCR扩增和多重PCR扩增，其中，2个SSR特征引物碱基序列为：引物B1：Cry-F：5’-GAAGGTTTGAGCAATCTCTAC-3’；Cry-R：5’-CGATCAGCCTAGTAAGGTCGT-3’；引物P1：G-P1：5’-ttttggtgaaattctggtctgc-3’G-P2：5’-aaaacagggcttggattag-3’（4）对扩增产物进行凝胶电泳；（5）对电泳结果进行分析：卡那霉素抗性的植株初步认定为携带有Bt基因或/和转FBP：：IaaM基因材料，进入下一步试验；分别使用引物P1、引物B1和S1的目的片段与该三对引物的多重PCR目的片段的大小一致，说明该方法结果可靠；使用引物组合B1/P1，以FBP：：IaaM基因纯系与转基因抗虫棉F1代植株、非转基因纯系为模板时，在F1的5个单株中，均可以扩增出相应的目的条带，而非转基因系则未见有扩增产物，说明B1/P1的引物组合可以同时检测FBP：：IaaM基因和Bt基因；使用B1/S1引物组合，分别以转基因抗虫棉纯系和非转基因纯系为模板，转基因抗虫棉纯系的不同单株均可以检测到Bt和Sad基因，而非转基因纯系只能检测到Sad基因，说明B1/S1的引物组合可以区分抗虫棉和非抗虫棉系。本发明所述的分子检测方法，第（2）步中，PCR扩增反应体系为：反应体系为20μ1，其中各试剂终浓度为，10×Buffer为1×，dNTPs0.50nM，引物P10.2μM、引物B10.1μM、引物S10.01μM，模板DNA3.00ng，TaqDNA聚合酶0.20U/μL；反应程序为：94℃预变性4min，；94℃变性40s，58℃退火40s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存待用。本发明方法中，卡那霉素鉴定采用喷雾加涂抹的方法进行，棉花发育时期为三叶一心，卡那霉素（KanamycinSulphate）浓度为2500mg·kg-1，每亩用量为15.0kg，第一次鉴定采用喷雾法，对棉苗心叶喷雾，有黄化斑的转基因棉花苗即为阴性植株，转基因棉花子叶上没有黄化斑的绿苗即为阳性植株；第二次鉴定采用涂抹法，对部分不抗卡那霉素的植株采用涂抹的方法进行鉴定，有黄化斑的转基因棉花苗即为阴性植株，转基因棉花子叶上没有黄化斑的绿苗即为阳性植株。这些方法具有：（1）时期早，三叶一心，便于及时拔除非卡那霉素抗性植株；（2）简单易操作，第一次鉴定可使用喷雾器等简单农具进行，第二次对部分卡那霉素反应植株进行涂抹的方法进行，操作简便，可在田间大面积鉴定材料；（3）鉴定时间短，晴好天气4天可见效果，7天之内可以获得最终结果。本发明简化CTAB法提取棉花总DNA：将棉花基因组DNA提取方法（CTAB法，PattersonAH,BrubakerCLandWendelJF.Arapidmethodforextractionofcotton(Gossypiumssp)genomicDNAsuitableforRFLPorPCRanalysis.PlantMolecularBiologyReporter,1993,11:122-127.）进行了简化，对其裂解液配方和提取步骤（裂解液配方和提取步骤见本发明实施例部分）进行了优化，缩短了DNA提取时间，提高了工作效率，且可以得到了较高质量DNA。多重PCR：将FBP：：IaaM转基因系基因检测特异性引物（P1）、Bt毒蛋白基因（B1）和内标基因Sad1基因（Sad1，Stearoyl-acylcarrierproteindesaturase；GenbankNo.AJ132636，来源于陆地棉，与海岛棉、小麦、玉米、大麦、烟草、西红柿、油菜、水稻、向日葵等植物同源基因的序列相似性很低）引物S1，利用一次PCR扩增即可检测Bt毒蛋白、FBP：：IaaM等两个基因目的片段，同时利用内标基因Sad1监控反应体系；本发明对上述引物的扩增条件和引物浓度进行了优化，得到了最适引物浓度组合和扩增条件（反应体系见本发明具体实施方式）。非变性聚丙烯核酸电泳：主要用于多重PCR扩增产物的检测，凝胶浓度为8.0%，由于该方法具备无电渗作用、样品用量少(1.2-2.0μl)、分辨率高(1-100ng)、重复性好等特点，可以有效提高检测效率，并适用于较小体积（≤10μl）PCR体系扩增产物的检测，降低检测成本；由于该凝胶电泳具备较高的分辨率，通过与对照比较，可减少引物二聚体、非特异性扩增等阳性DNA片段的检测，可提高检测准确性，与琼脂糖电泳比较，由于该方法点样量较小，较小体积（≤10μl）PCR体系可以进行多次电泳检测，便于不同批次间样品的比较。与现有方法比较，本发明具有以下优点：本发明用于棉花高衣分与抗虫等基因分子聚合育种过程中材料的分子检测，本发明将卡那霉素抗性、简化CTAB法提取棉花总DNA、多重PCR和非变性聚丙烯酰胺DNA凝胶电泳等技术进行有效组合，可快速实现转FBP：：IaaM亲本及其与转Bt抗虫棉花材料杂交、回交等不同世代材料的FBP：：IaaM与Bt基因的分子检测，并从中快速鉴定出含有FBP：：IaaM和Bt基因的个体，为高衣分、抗虫等基因的分子聚合育种提供了简单、快速和准确性高的分子检测方法。本方法能够弥补已有卡那霉素抗性鉴定技术的不足，可用于转FBP：：IaaM基因棉花新材料与转Bt基因抗虫棉品系育种群体后代材料的分子检测和带有上述基因棉花材料的定性检测，与传统方法比较，具有技术可靠、操作简便、结果准确、成本低等有优点，可有效提高选择效率，缩短育种周期。附图说明图1为样品DNA完整性检测图。图2为单一PCR扩增和多重PCR扩增对比图。图3为B1/P1的引物组合扩增结果图。图4为B1/S1的引物组合扩增结果图。图5为利用三对引物对FBP：：IaaM基因纯系与转基因抗虫棉聚合育种群体部分单株进行多重PCR扩增结果图。具体实施方式该发明方法可用于FBP：：IaaM与Bt基因聚合育种及携带有FBP：：IaaM和Bt基因棉花材料的定性鉴定。实施例11.对棉花抗性进行卡那霉素鉴定：在棉花苗期（三叶一心）用2500mg/L的卡那霉素溶液喷雾，4-7天后观察叶片颜色，对于叶片出现黄斑的植株，用相同浓度的卡那霉素溶液涂抹倒二叶，4-7天进行确认，如果仍然出现黄斑，则认为分离出来的非转基因杂株，直接淘汰。卡那霉素抗性的植株初步认定为携带有Bt基因或（和）转FBP：：IaaM基因材料，进入下一步试验。提取提取含有目的基因棉花基因组DNA：取卡那霉素抗性单株的幼叶100.0mg，提取DNA，DNA提取方法如下。棉花总DNA采用简化CTAB法提取，具体步骤如下：1)取单株幼叶一片（约50-100mg），置于2.0mL离心管中，液氮速冻，使用RetschMM400将样品研磨成粉末，加入约0.6mL裂解缓冲液（氯化钠1.4M、EDTA0.02M、Tris-HCl0.1M、2%十六烷基三甲基溴化铵、3%PVP(K40)、0.3%抗坏血酸、pH8.0)摇匀，65℃水浴30min，每10min摇一次。2)加等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提液，冷却后，摇匀至乳浊液，离心10min（13000g，16℃）。3)吸取上清，转入新的1.5mL离心管，加入0.6倍体积的冰冻异丙醇，缓慢摇匀至沉淀析出。4)钩出沉淀，转入灭菌1.5mL离心管，70％酒精浸泡30min；换无水乙醇洗一遍，倒干净乙醇，风干，在DNA沉淀仍有些潮湿的时候，用适量体积的TE溶解。随机取部分DNA，利用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性（每100mL琼脂糖溶液中加入5µL溴化乙锭溶液），利用凝胶成像仪进行DNA检测，DNA浓度及纯度用ThermoScientificNaNoDrop2000cSpectrophotometer检测，上述的DNA提取方法可以得到质量较好的棉花总基因组DNA，其电泳条带边缘较为清晰，基本无降解较，RNA残留较少（图1），通过检测DNA样品的230、260和280nm的吸光值可以发现，260/280和260/230比值在2.0附近（表一），DNA纯度较好，浓度平均值为590.36ng/ul，浓度较高，可以用于下一步试验。表一：DNA浓度编号A260A280260/230260/280浓度（ng/ul）11.020.4661.792.2511.1021.020.4771.642.15512.2131.250.5991.82.10629.6241.040.5271.51.98522.9050.900.4131.722.18451.8161.220.5551.992.21613.9371.330.6231.902.14666.8081.230.5731.792.15616.9091.570.7462.002.11788.00平均值1.180.551.792.14590.363.进行单一PCR扩增和多重PCR扩增：用于证明的多重PCR体系的可靠性，选择FBP：：IaaM基因纯系与转基因抗虫棉F1代的7个单株用于多重PCR体系可靠性的验证工作，分别用表四中的4个PCR反应体系进行目标基因的扩增，多重PCR扩增体系如下：选用Bt毒蛋白基因通用引物（Cry1Ac基因、Cry1Ab基因、以及Cry1Ac与Cry1Ab融合基因）、FBP：：IaaM转基因系基因特异性引物和内标基因（Sad1基因），利用一次PCR扩增Cry1ac、FBP：：IaaM和sad基因等片段，本发明引物序列如下：Bt毒蛋白基因序列通用引物B1（cry1Ac基因、cry1Ab基因、以及cry1Ac与cry1Ab融合基因）,扩增片段大小为340bp，用于检测Bt蛋白基因（王奕海，谢家建，张永军等.一种检测抗虫棉中不同Bt基因表达盒结构的PCR方法,农业生物技术学报2009,17(5):914-919）。Cry-F：5’-GAAGGTTTGAGCAATCTCTAC-3’；Cry-R：5’-CGATCAGCCTAGTAAGGTCGT-3’；转FBP：：IaaM基因高衣分棉花材料检测引物P1,扩增片段大小为660bp，用于检测FBP：：IaaM基因：G-P1：5’-ttttggtgaaattctggtctgc-3’G-P2：5’-aaaacagggcttggattag-3’Sad1基因（Sad1，Stearoyl-acylcarrierproteindesaturase；GenbankNo.AJ132636，来源于陆地棉，与海岛棉、小麦、玉米、大麦、烟草、西红柿、油菜、水稻、向日葵等植物同源基因的序列相似性很低）扩增引物S1，产物大小为108bp，主要用于检测PCR扩增体系(YangL,PanA,ZhangK.etal.,QualitativeandquantitativePCRmethodsforeventspecificdetectionofgeneticallymodifiedcottonMon1445andMon531,2005,14(6):817-831)：s-F:5’-CCAAAGGAGGTGCCTGTTCA-3’s-R:5’-TTGAGGTGAGTCAGAATGTTGTTC-3’经过对PCR扩增体系的优化，引物P1、B1和S1的最佳组合浓度组合为（P1：B1：S1=0.2：0.1：0.01），其中，20μL反应体系见表二和表三：表二引物组合120μ1体积的扩增反应体系表三：PCR的反应体系PCR程序如下：P1、B1和S1等引物组合反应程序：（1）94℃预变性4min；（2）94℃变性40s，58℃退火40s，72℃延伸1min，循环数为30，（3）72℃延伸10.0min。目标基因的扩增产物用凝胶银染分析，具体方法如下：多重PCR扩增的产物利用8%非变性聚丙稀酰胺凝胶电泳检测（配方见表四），凝胶大小180×120mm，厚度1.0mm，电泳缓冲液为1×TBE（Tirs-硼酸缓冲液），电泳电压180V，电泳时间为50-60min。电泳结束后，按照张军（张军,武耀廷,郭旺珍,张天真.棉花微卫星标记的PAGE/银染快速检测.棉花学报,2000,12(5):267-269.）的方法进行银染，并稍作修改。1)固定：将取下的凝胶置于盛有固定液(340mL无离子水+40mL95%酒精＋20mL10％乙酸)的盒子中，并于摇床上轻摇，固定至少5~6min，用纯水冲洗一次凝胶。2)渗透：加入300mL渗透液(0.6gAgNO3＋300mL无离子水)，在摇床上渗透12min，用纯水漂洗两遍，每次约30s。3)显色：加入400mL显色液(6gNaOH＋4mLCH2O＋4mL0.2%Na2S2O3＋400mL无离子水)，摇动至条带清晰地显出，倒去显色液，然后用纯水洗两遍。4)终止：加入400mL终止液(3gNa2CO3＋400mL无离子水)，暂时保存，分析结果。表四：凝胶配制（8％）结果显示，分别使用P1（图2中D）、B1（图2中C）和S1（图2中B）的目的片段与多重PCR（三对引物，图2中A）目的片段的大小一致，证明该方法结果可靠（请参见图2）。实施例2该实施例用于证明的引物组合B1/P1、以及B1/S1引物组合的可靠性，分别选择转FBP：：IaaM基因纯系与转基因抗虫棉F1代植株、转基因抗虫棉纯系和非转基因纯系进行。PCR扩增体系分别用表五中所述的两个PCR反应体系进行（PCR程序同实施例1），目标基因扩增产物的分析方法与实施例1中所述一致。结果显示，使用引物组合B1/P1，以FBP：：IaaM基因纯系与转基因抗虫棉F1代植株、非转基因纯系为模板时，在F1的5个单株中，均可以扩增出相应的目的条带（图3中1-5），而非转基因系则未见有扩增产物（图3中6），说明B1/P1的引物组合可以同时检测FBP：：IaaM基因和Bt基因；使用B1/S1引物组合，分别以转基因抗虫棉纯系和非转基因纯系为模板，转基因抗虫棉纯系的不同单株均可以检测到Bt和Sad基因（图4中1、3-7），而非转基因纯系只能检测到Sad基因（图4中2），说明B1/S1的引物组合可以区分抗虫棉和非抗虫棉系。表五：实例2的反应体系实施例3育种后代群体的多重PCR分析用实施例2表五中的扩增体系1对FBP：：IaaM基因纯系与转基因抗虫棉聚合育种群体部分单株进行多重PCR扩增，并分别选用转FBP：：IaaM基因纯系与转基因抗虫棉F1代植株、转基因抗虫棉纯系和非转基因纯系作为对照，（PCR程序同实施例1），目标基因的扩增产物分析方法同实施例1（结果见图2）。结果显示，转FBP：：IaaM基因纯系与转基因抗虫棉F1代单株、转基因抗虫棉纯系单株和非转基因纯系单株作为对照分别使用分别扩增除了与目的条带分子量一致的3、2和1个条带（图5中1.、2和3）、其他单株的DNA分别扩增出3个（图5中5、8和9）、2个（图5中4、6、7和10）和1个条带（图5中11）。实施例4育种后代群体的结果分析利用卡那霉素鉴定鉴定后，提取阳性植株的DNA作为模板，如果三对引物的多重PCR反应中，FBP：：IaaM基因、Bt基因（cry1Ac基因或cry1Ab基因或cry1Ac与cry1Ab融合基因）和Sad1内标基因的序列得到了扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，而在阴性对照中仅扩增出Sad1基因片段，空白对照中没有任何扩增片段，表明PCR反应体系正常工作。如果Sad1内标基因没有扩增，则表明PCR反应体系不正常，需要查找原因重新检测。在PCR反应体系正常工作的前提下，育种群体后代的检测结果通常有以下几种情况：（1）在试样PCR反应中，只有Sad1内标准基因得到扩增，则该单株不携带有Bt（cry1Ac基因或cry1Ab基因或cry1Ac与cry1Ab融合基因）抗虫基因和FBP：：IaaM基因。（2）在试样PCR反应中，Sad1内标准基因和Bt（cry1Ac基因或cry1Ab基因或cry1Ac与cry1Ab融合基因）抗虫基因得到了扩增，则该单株携带有Bt（cry1Ac基因或cry1Ab基因或cry1Ac与cry1Ab融合基因）抗虫基因。（3）在试样PCR反应中，Sad1内标准基因和FBP：：IaaM基因得到了扩增，则该单株携带有FBP：：IaaM基因。（4）在试样PCR反应中，Sad1内标准基因、Bt（cry1Ac基因或cry1Ab基因或cry1Ac与cry1Ab融合基因）抗虫基因和FBP：：IaaM基因均得到了扩增，则该单株携带有Bt（cry1Ac基因或cry1Ab基因或cry1Ac与cry1Ab融合基因）和FBP：：IaaM基因，该单株为中选单株，可用于下一步研究。当前第1页1 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