本发明涉及生物
技术领域：
，具体而言，涉及一种低频率基因融合的检测方法及装置。
背景技术：
：目前，组织样本的二代测序检测基因融合的一般流程包括：将基因组DNA打断成300～400bp的片段，使用捕获探针将目标区域捕获下来，然后边合成边测序，通过专注于目标区域的测序在相同数据量下提高测序深度，对尽量多的DNA进行高测序深度的测序。检测融合时通过双端测序的两个序列不在同一个区域判断融合信号。目前，检测组织中的基因融合的方案一般采用安捷伦探针捕获目标区域，使用illumina-Miseq或是Hiseq测序仪进行高通量测序。下机数据使用bwa软件比对上参考基因组，通过双端测序结果的两条序列在不同区域的信号找到融合。血液样本中的ctDNA较短，为170bp左右，通过双端测序的两端序列难以得到可靠的融合信号，而使用单端序列的软截断作为融合信号又被血浆中融合DNA少这个条件所限制，因为少量软截断会因为其截断序列长度短和种类少而难以和建库或测序错误区分。技术实现要素：本发明旨在提供一种低频率基因融合的检测方法及装置，以提高低频突变检测灵敏度。为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种低频率基因融合的检测方法。该检测方法包括以下步骤：S1，从全血中提取cfDNA；S2，对cfDNA进行末端修复及3’端添加A碱基；S3，将S2得到的cfDNA的末端连接含有随机标签序列的接头；S4，根据接头的序列及目标区域设计多重PCR的引物进行目标区域捕获，多重PCR的引物中上游引物为通用引物，匹配接头的序列，下游引物为扩增目标区域的特异性引物；S5，对S4的PCR产物进行磁珠纯化，去除掉未非特异性扩增的小片段DNA及引物二聚体；S6，对S5的产物进行PCR扩增，同时引入index序列，得到ctDNA超低频突变的文库；S7，采用IlluminaHiseqX平台对文库进行上机测序，S8，对文库测序后的数据通过随机标签序列进行聚类分析，排除掉PCR扩增错误及测序错误产生的序列数据；以及S9，剩余的数据质控合格后进入变异检测分析。进一步地，随机标签序列的长度为12bp。进一步地，接头为如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的脱氧核苷酸序列。进一步地，S8包括：S81，下机经过排除错误处理后的数据使用bwa软件比对上参考基因组，并使用samtools软件排序后建立索引；S82，对比对文件进行遍历，每个位点上前后两个标签相同的序列合并成1个，并且同时去掉相同标签中和其他大部分序列相比有任何不一致的序列；S83，合成的签序列重新使用bwa软件比对回参考基因组，并且使用samools软件进行排序和建立索引。进一步地，S9中的变异检测分析包括：S91，将S83得到的所有软截断中位置接近的软截断合成一条长的软截断序列，使用该序列在参考基因组上寻找融合的另一个基因位置；S92，对比数据库将与靶向用药相关融合提取出。根据本发明的另一方面，提供了一种低频率基因融合的检测装置。该检测装置依次包括以下模块：cfDNA提取模块，用于从全血中提取cfDNA；末端修复及加A碱基模块，用于对cfDNA进行末端修复及3’端添加A碱基；接头连接模块，用于将完成末端修复及3’端添加A碱基的cfDNA的末端连接含有随机标签序列的接头；目标区域捕获模块，用于根据接头的序列及目标区域设计多重PCR的引物进行目标区域捕获，多重PCR的引物中上游引物为通用引物，匹配接头的序列，下游引物为扩增目标区域的特异性引物；磁珠纯化模块，用于对PCR产物进行磁珠纯化，去除掉未非特异性扩增的小片段DNA及引物二聚体；index序列引入模块，用于对磁珠纯化模块的产物进行PCR扩增，同时引入index序列，得到ctDNA超低频突变的文库；测序模块，采用IlluminaHiseqX平台对文库进行上机测序，聚类分析模块，用于对文库测序后的数据通过随机标签序列进行聚类分析，排除掉PCR扩增错误及测序错误产生的序列数据；以及变异检测分析模块，用于将剩余的数据质控合格后进入变异检测分析。进一步地，随机标签序列的长度为12bp。进一步地，接头为如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的脱氧核苷酸序列。进一步地，聚类分析模块包括：第一分析模块，用于将下机经过排除错误处理后的数据使用bwa软件比对上参考基因组，并使用samtools软件排序后建立索引；第二分析模块，用于将比对文件进行遍历，每个位点上前后两个标签相同的序列合并成1个，并且同时去掉相同标签中和其他大部分序列相比有任何不一致的序列；第三分析模块，用于将合成的签序列重新使用bwa软件比对回参考基因组，并且使用samools软件进行排序和建立索引。进一步地，变异检测分析模块的变异检测分析包括：将第三分析模块得到的所有软截断中位置接近的软截断合成一条长的软截断序列，使用该序列在参考基因组上寻找融合的另一个基因位置；以及对比数据库将与靶向用药相关融合提取出。本发明实际上是一种基于液相杂交捕获二代测序进行基因结构变异突变检出的方法，主要对样本中低频率的体细胞突变进行检测，使用随机序列标记原始DNA分子，矫正建库和测序错误，去掉PCR中的指数扩增造成的影响，进而解决测序分析结果中的假阴性/假阳性问题，即单端序列的软截断作为信号检测血浆中稀少的融合突变。附图说明构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：图1示出了根据本发明一实施方式的低频率基因融合的检测方法的流程示意图。具体实施方式需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。根据本发明一种典型的实施方式，提供了一种低频率基因融合的检测方法。该检测方法包括以下步骤：S1，从全血中提取cfDNA；S2，对cfDNA进行末端修复及3’端添加A碱基；S3，将S2得到的cfDNA的末端连接含有随机标签序列的接头；S4，根据接头的序列及目标区域设计多重PCR的引物进行目标区域捕获，多重PCR的引物中上游引物为通用引物，匹配接头的序列，下游引物为扩增目标区域的特异性引物；S5，对S4的PCR产物进行磁珠纯化，去除掉未非特异性扩增的小片段DNA及引物二聚体；S6，对S5的产物进行PCR扩增，同时引入index序列，得到ctDNA超低频突变的文库；S7，采用IlluminaHiseqX平台对文库进行上机测序，S8，对文库测序后的数据通过随机标签序列进行聚类分析，排除掉PCR扩增错误及测序错误产生的序列数据；以及S9，剩余的数据质控合格后进入变异检测分析。本发明适用于所有基于杂交的目标区域捕获方法，包括但不限于Agilent、Nimblegen和Illumina的商业和定制化捕获芯片；本发明适用于Illumina所有二代测序机型，包括但不限于Hiseq系列、Miseq系列和Nextseq系列。本发明实际上是一种基于液相杂交捕获二代测序进行基因结构变异突变检出的方法，主要对样本中低频率的体细胞突变进行检测，使用随机序列标记原始DNA分子，矫正建库和测序错误，去掉PCR中的指数扩增造成的影响，进而解决测序分析结果中的假阴性/假阳性问题，即单端序列的软截断作为信号检测血浆中稀少的融合突变。优选的，随机标签序列为ATGC四种碱基组成，长度12bp，连接在reads的前后两端。根据本发明一种典型的实施方式，接头包括如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的脱氧核苷酸序列。根据本发明一种典型的实施方式，多重PCR扩增上游引物为SEQIDNO.3所示的脱氧核苷酸序列，多重PCR扩增下游引物为SEQIDNO.4所示的脱氧核苷酸序列，N代表针对不同的位点设计的不同特异性引物，具体的N部分序列包括如SEQIDNO.5，SEQIDNO.6，SEQIDNO.7，SEQIDNO.8，SEQIDNO.9，SEQIDNO.10，SEQIDNO.11，SEQIDNO.12，SEQIDNO.13，SEQIDNO.14，SEQIDNO.15，SEQIDNO.16，SEQIDNO.17，SEQIDNO.18，SEQIDNO.19，SEQIDNO.20，SEQIDNO.21，SEQIDNO.22，SEQIDNO.23，SEQIDNO.24，SEQIDNO.25，SEQIDNO.26，SEQIDNO.27，SEQIDNO.28，SEQIDNO.29，SEQIDNO.30，SEQIDNO.31，SEQIDNO.32，SEQIDNO.33，SEQIDNO.34，SEQIDNO.35，SEQIDNO.36，SEQIDNO.37，SEQIDNO.38，SEQIDNO.39，SEQIDNO.40，SEQIDNO.41，SEQIDNO.42，SEQIDNO.43，SEQIDNO.44，SEQIDNO.45，SEQIDNO.46，SEQIDNO.47所示的脱氧核苷酸序列。根据本发明一种典型的实施方式，S8包括：S81，下机经过排除错误处理(cleandata)后的数据使用bwa软件比对上参考基因组，并使用samtools软件排序后建立索引；S82，对比对文件进行遍历，每个位点上前后两个标签相同的序列合并成1个，并且同时去掉相同标签中和其他大部分序列相比有任何不一致的序列；S83，合成的签序列重新使用bwa软件比对回参考基因组，并且使用samools软件进行排序和建立索引。合成相同标签的序列可以把序列恢复到原始情况，消除PCR中发生的错误，比对并建立索引可以使后续流程加快速度。根据本发明一种典型的实施方式，S9中的变异检测分析包括：S91，将S83得到的所有软截断中位置接近的软截断合成一条长的软截断序列，使用该序列在参考基因组上寻找融合的另一个基因位置；S92，对比数据库将与靶向用药相关融合提取出。根据本发明一种典型的实施方式，提供一种低频率基因融合的检测装置。该检测装置依次包括以下模块：cfDNA提取模块，用于从全血中提取cfDNA；末端修复及加A碱基模块，用于对cfDNA进行末端修复及3’端添加A碱基；接头连接模块，用于将完成末端修复及3’端添加A碱基的cfDNA的末端连接含有随机标签序列的接头；目标区域捕获模块，用于根据接头的序列及目标区域设计多重PCR的引物进行目标区域捕获，多重PCR的引物中上游引物为通用引物，匹配接头的序列，下游引物为扩增目标区域的特异性引物；磁珠纯化模块，用于对PCR产物进行磁珠纯化，去除掉未非特异性扩增的小片段DNA及引物二聚体；index序列引入模块，用于对磁珠纯化模块的产物进行PCR扩增，同时引入index序列，得到ctDNA超低频突变的文库；测序模块，采用IlluminaHiseqX平台对文库进行上机测序，聚类分析模块，用于对文库测序后的数据通过随机标签序列进行聚类分析，排除掉PCR扩增错误及测序错误产生的序列数据；以及变异检测分析模块，用于将剩余的数据质控合格后进入变异检测分析。优选的，随机标签序列为ATGC四种碱基组成，长度12bp，连接在reads的前后两端。根据本发明一种典型的实施方式，接头包括如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的脱氧核苷酸序列。根据本发明一种典型的实施方式，多重PCR扩增上游引物为SEQIDNO.3所示的脱氧核苷酸序列，多重PCR扩增下游引物为SEQIDNO.4所示的脱氧核苷酸序列，N代表针对不同的位点设计的不同特异性引物，具体的N部分序列包括如SEQIDNO.5，SEQIDNO.6，SEQIDNO.7，SEQIDNO.8，SEQIDNO.9，SEQIDNO.10，SEQIDNO.11，SEQIDNO.12，SEQIDNO.13，SEQIDNO.14，SEQIDNO.15，SEQIDNO.16，SEQIDNO.17，SEQIDNO.18，SEQIDNO.19，SEQIDNO.20，SEQIDNO.21，SEQIDNO.22，SEQIDNO.23，SEQIDNO.24，SEQIDNO.25，SEQIDNO.26，SEQIDNO.27，SEQIDNO.28，SEQIDNO.29，SEQIDNO.30，SEQIDNO.31，SEQIDNO.32，SEQIDNO.33，SEQIDNO.34，SEQIDNO.35，SEQIDNO.36，SEQIDNO.37，SEQIDNO.38，SEQIDNO.39，SEQIDNO.40，SEQIDNO.41，SEQIDNO.42，SEQIDNO.43，SEQIDNO.44，SEQIDNO.45，SEQIDNO.46，SEQIDNO.47所示的脱氧核苷酸序列。根据本发明一种典型的实施方式，聚类分析模块包括：第一分析模块，用于将下机经过排除错误处理(cleandata)后的数据使用bwa软件比对上参考基因组，并使用samtools软件排序后建立索引；第二分析模块，用于将比对文件进行遍历，每个位点上前后两个标签相同的序列合并成1个，并且同时去掉相同标签中和其他大部分序列相比有任何不一致的序列；第三分析模块，用于将合成的签序列重新使用bwa软件比对回参考基因组，并且使用samools软件进行排序和建立索引。根据本发明一种典型的实施方式，变异检测分析模块的变异检测分析包括：将第三分析模块得到的所有软截断中位置接近的软截断合成一条长的软截断序列，使用该序列在参考基因组上寻找融合的另一个基因位置；以及对比数据库将与靶向用药相关融合提取出。根据本发明一种典型的实施方式，如图1所示，应用本发明的技术方案主要包括实验部分和分析部分两大部分，实施上述技术方案包括具体以下步骤(图1示出了最主要的步骤，并非全部步骤)：1)从全血中分离血浆，得血浆样本，并对血浆样本进行样本处理，提取cfDNA；2)含有随机标签序列的接头制作；3)cfDNA片段末端修复及3’端添加A碱基；4)接头的连接，将末端连接A碱基的DNA片段末端连接步骤2)中的含有随机标签序列的接头；5)基于多重PCR的目标区域捕获：根据步骤4)中添加的接头序列及目标区域(感兴趣的研究位点)，设计多重PCR的引物，其中上游引物为通用引物，匹配步骤4)中添加的接头序列；下游引物为目标区域特异性引物；6)对步骤5)中的PCR产物进行磁珠纯化，去除掉未非特异性的小片段DNA及引物二聚体；7)文库的扩增及index的引入：采用特定的引物对步骤6)后的产物进行PCR扩增，同时对文库添加index序列；8)文库检测：使用安捷伦2100Bioanalyzer检测插入片段大小；使用qPCR定量检测文库产量；9)文库上机：采用IlluminaHiseqX平台对文库检测后的文库进行上机测序；10)下机数据的分析：下机经过排除错误处理(cleandata)后的数据使用bwa软件比对上参考基因组，并使用samtools软件排序后建立索引；对比对文件进行遍历，每个位点上前后两个标签相同的序列合并成1个(融合基因1上提取软截断序列)，并且同时去掉相同标签中和其他大部分序列相比有任何不一致的序列；合成的签序列重新使用bwa软件比对回参考基因组，并且使用samools软件进行排序和建立索引；将得到的所有软截断中位置接近的软截断合成一条长的软截断序列，使用该序列在参考基因组上寻找融合的另一个基因位置(融合基因2)；对比数据库将与靶向用药相关融合提取出(融合检测结果)。下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果，本发明中没有详细描述的技术手段可以采用本领域的常规技术手段实现。实施例1本实施例中用到的样本为非小细胞肺癌患者血浆样本，为基因融合阳性血浆样本，其组织RNA通过PCR的方法检测出EML4-ALK.E6bA20.AB374362融合。下面按照本发明的方法进行检测。1.非小细胞肺癌患者全血10ml，采用streck公司的BCT管进行收集和运输，运输温度为室温，运输时间不超过72h。血浆的分离采用两步离心法，即1600g离心10min，取上清，再16000g离心10min，上清即为分离好的血浆，该血浆保存于-80℃中。血浆中cfDNA的提取采用Qiagen公司的循环DNA(circulating)提取试剂盒，提取好的cfDNA存放在-20℃中备用。样本名称及提取量见表1。表12.合成带有标签序列的接头。接头序列见表2(本例中采用的标签序列长度为12个碱基)，最多可以标记412个DNA分子。合成好的引物采用ElutionBuffer洗脱缓冲液进行溶解，终浓度为100uM，等比例摩尔数混合之后95℃加热5min，然后缓慢降温至室温完成退火。采用乙醇沉淀法对退火完成后的接头进行纯化，最后采用100ul无核酸酶水溶解，终浓度为20uM。表2名称序列(5’-3’)SEQIDNO.1TCTACACTCTTTCCCTACACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNTSEQIDNO.2CACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGANNNNNNNNNNNN注：含有标签序列的接头，其中N代表随机碱基。3.末端修复及3’端加A碱基参照下表3配比准备反应混合液，用枪轻柔地上下吹吸混匀。表3放入PCR仪，按下表4设置程序进行反应(盖温设为70℃，前30min不盖热盖，温度到达65℃，立即盖上热盖)。表44.接头连接按照下表5的配比准备反应混合液，用枪轻柔地上下吹吸混匀。表5分为2管，每管55ul，放于PCR仪上，20℃反应15min。反应结束后，使用0.8×的AMPureXP(Beckman公司)磁珠纯化DNA样本。5.PCR扩增捕获目标区域按照下表6的配比准备反应混合液，用枪轻柔地上下吹吸混匀。表6用于多重PCR扩增的上下游引物的序列见表7。表7名称序列(5’-3’)SEQIDNO.3TCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTSEQIDNO.4GGAGTTCAGACCGTGTGCTCTTCCGATCTN注：下游引物为混合物，N代表针对不同的位点设计的不同特异性引物，具体的N部分序列见表8。表8放入PCR仪，按下表9设置程序反应。表9反应结束后，采用1.2×的AMPureXP磁珠对扩增产物进行纯化，最后将文库溶于25ulNF-water(Ambion公司)中。6.文库的富集及引入index序列采用含有Illumina的index引物对上一步的文库进行扩增，同时引入index序列在上机时区分文库，在本实施例中，采用的index序列为1号，按照下表10配制反应液。表10上下游引物序列见表11。表11引物名称序列(5’-3’)SEQIDNO.48AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACASEQIDNO.49CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCA放入PCR仪，按下表12设置程序反应。表12反应结束后，采用1.2×的AMPureXP磁珠对扩增产物进行纯化，最后将文库溶于30ulNF-water中。采用Qubit荧光计对文库进行精确定量。7.文库检测及上机测序将步骤6中的纯化产物稀释到2ng/ul，取出1ul进行安捷伦2100Bioanalyzer(美国安捷伦公司)检测；另外，再取出1ul用于qPCR检测，根据检测结果决定上机浓度。根据上步所得的浓度，将文库稀释到上机要求后(2nmol)，在Illumina公司的HiseqX测序平台上进行PE150测序。8.下机质控在本实施例的第二部分数据分析中，使用bwa软件将测序结果比对上参考基因组，合成标签后的序列平均测序深度为3869X，质控信息如下表13所示。表139.拷贝数变异检出结果如下表14所示。表14融合基因1外显子1融合基因2外显子2支持融合序列融合占比ALK20EML4650.1％从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：本发明通过在每个原始分子上添加唯一标签，后续信息分析中对测序数据同一标签的序列合并，可以排除PCR或是测序错误引入的假融合序列。实施例中的0.1％低丰度的融合，一般来说在多次没有加标签的测序数据中可能为有或者可能没有，波动较大，不利于判断样本是不是有融合。而本发明在多次测序波动较小，对准确判断低丰度融合变异有利。以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。SEQUENCELISTING<110>北京诺禾致源科技股份有限公司<120>一种低频率基因融合的检测方法及装置<130>PN59542NHZY<160>49<170>PatentInversion3.5<210>1<211>46<212>DNA<213>artificial<220><223>含有随机标签序列的接头<220><221>misc_feature<222>(34)..(45)<223>nisa,c,g,ort<400>1tctacactctttccctacacgctcttccgatctnnnnnnnnnnnnt46<210>2<211>46<212>DNA<213>artificial<220><223>含有随机标签序列的接头<220><221>misc_feature<222>(35)..(46)<223>nisa,c,g,ort<400>2cactgacctcaagtctgcacacgagaaggctagannnnnnnnnnnn46<210>3<211>26<212>DNA<213>artificial<220><223>用于多重PCR扩增的上游引物<400>3tctacactctttccctacacgacgct26<210>4<211>30<212>DNA<213>artificial<220><223>用于多重PCR扩增的下游引物<220><221>misc_feature<223>N代表针对不同的位点设计的不同特异性引物<220><221>misc_feature<222>(30)..(30)<223>nisa,c,g,ort<400>4ggagttcagaccgtgtgctcttccgatctn30<210>5<211>24<212>DNA<213>artificial<220><223>NRAS_1R<400>5cacccccaggattcttacagaaaa24<210>6<211>23<212>DNA<213>artificial<220><223>NRAS_2R<400>6caagtgtgatttgccaacaagga23<210>7<211>24<212>DNA<213>artificial<220><223>NRAS_3R<400>7gttcttgctggtgtgaaatgactg24<210>8<211>26<212>DNA<213>artificial<220><223>PIK3CA_1R<400>8agaaaaccattacttgtccatcgtct26<210>9<211>25<212>DNA<213>artificial<220><223>PIK3CA_2R<400>9gcacttacctgtgactccatagaaa25<210>10<211>27<212>DNA<213>artificial<220><223>PIK3CA_3R<400>10cataagagagaaggtttgactgccata27<210>11<211>27<212>DNA<213>artificial<220><223>PIK3CA_4R<400>11caaacaagtttatatttccccatgcca27<210>12<211>24<212>DNA<213>artificial<220><223>PIK3CA_5R<400>12tgctgttcatggattgtgcaattc24<210>13<211>28<212>DNA<213>PIK3CA_6R<400>13agcatcagcatttgactttaccttatca28<210>14<211>28<212>DNA<213>artificial<220><223>PIK3CA_7R<400>14gtggaagatccaatccatttttgttgtc28<210>15<211>22<212>DNA<213>artificial<220><223>PIK3CA_8R<400>15ggttgaaaaagccgaaggtcac22<210>16<211>33<212>DNA<213>artificial<220><223>PIK3CA_9R<400>16tttaagattacgaaggtattggtttagacagaa33<210>17<211>28<212>DNA<213>artificial<220><223>PIK3CA_10R<400>17tcaatcagcggtataatcaggagttttt28<210>18<211>28<212>DNA<213>artificial<220><223>PIK3CA_11R<400>18ccttttgtgtttcatccttcttctcctg28<210>19<211>28<212>DNA<213>artificial<220><223>EGFR_1R<400>19tcagtccggttttatttgcatcatagtt28<210>20<211>23<212>DNA<213>artificial<220><223>EGFR_2R<400>20gtgccagggaccttaccttatac23<210>21<211>22<212>DNA<213>artificial<220><223>EGFR_3R<400>21tccagaccagggtgttgttttc22<210>22<211>20<212>DNA<213>artificial<220><223>EGFR_4R<400>22cggacatagtccaggaggca20<210>23<211>21<212>DNA<213>artificial<220><223>EGFR_5R<400>23ccccatggcaaactcttgcta21<210>24<211>26<212>DNA<213>artificial<220><223>EGFR_6R<400>24gcatgtgttaaacaatacagctagtg26<210>25<211>20<212>DNA<213>artificial<220><223>EGFR_7R<400>25ctgaggttcagagccatgga20<210>26<211>25<212>DNA<213>artificial<220><223>EGFR_8R<400>26cccaaagactctccaagatgggata25<210>27<211>23<212>DNA<213>artificial<220><223>MET_1R<400>27agaagttgatgaaccggtccttt23<210>28<211>27<212>DNA<213>artificial<220><223>MET_2R<400>28tctgacttggtggtaaacttttgagtt27<210>29<211>27<212>DNA<213>artificial<220><223>MET_3R<400>29gcaaaccacaaaagtatactccatggt27<210>30<211>27<212>DNA<213>artificial<220><223>MET_4R<400>30ggagacatctcacattgtttttgttga27<210>31<211>29<212>DNA<213>artificial<220><223>MET_5R<400>31cggtagtctacagattcatttgaaaccat29<210>32<211>27<212>DNA<213>artificial<220><223>MET_6R<400>32gcttttcaaaaggcttaaacacaggat27<210>33<211>23<212>DNA<213>artificial<220><223>MET_7R<400>33aggccccatacaatttgatgaca23<210>34<211>21<212>DNA<213>artificial<220><223>RET_1R<400>34ccttgttgggacctcagatgt21<210>35<211>26<212>DNA<213>artificial<220><223>RET_2R<400>35actttgcgtggtgtagatatgatcaa26<210>36<211>21<212>DNA<213>artificial<220><223>RET_3R<400>36gtggtagcagtggatgcagaa21<210>37<211>18<212>DNA<213>artificial<220><223>RET_4R<400>37ccatggtgcacctgggat18<210>38<211>22<212>DNA<213>artificial<220><223>ERBB2_1R<400>38gccatagggcataagctgtgtc22<210>39<211>23<212>DNA<213>artificial<220><223>ERBB2_2R<400>39ccttggtccttcacctaaccttg23<210>40<211>23<212>DNA<213>artificial<220><223>ERBB2_3R<400>40gtcatatctccccaaaccccaat23<210>41<211>21<212>DNA<213>artificial<220><223>ALK_1R<400>41ggaagagtggccaagattgga21<210>42<211>22<212>DNA<213>artificial<220><223>ALK_2R<400>42gcccagactcagctcagttaat22<210>43<211>29<212>DNA<213>artificial<220><223>KRAS_1R<400>43gtaaaaggtgcactgtaataatccagact29<210>44<211>27<212>DNA<213>artificial<220><223>KRAS_2R<400>44gactctgaagatgtacctatggtccta27<210>45<211>27<212>DNA<213>artificial<220><223>KRAS_3R<400>45aggcctgctgaaaatgactgaatataa27<210>46<211>27<212>DNA<213>artificial<220><223>BRAF_1R<400>46tttctttttctgtttggcttgacttga27<210>47<211>28<212>DNA<213>artificial<220><223>BRAF_2R<400>47gcttgctctgataggaaaatgagatcta28<210>48<211>41<212>DNA<213>artificial<220><223>引入index序列的上游引物<400>48aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctaca41<210>49<211>44<212>DNA<213>artificial<220><223>引入index序列的下游引物<400>49caagcagaagacggcatacgagatcgtgatgtgactggagttca44当前第1页1 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