用于检测肠出血性大肠杆菌O157:H7的LAMP检测用引物组及检测方法与流程

本发明涉及动物卫生和食品检验技术领域，特别涉及一种用于检测肠出血性大肠杆菌O157:H7的LAMP检测用引物组及检测方法。

背景技术：
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肠出血性大肠杆菌(Enterohaemorrhagic Escherichia coli，EHEC)O157:H7于1982年在美国被首次发现，EHEC O157:H7是肠出血性大肠杆菌的主要血清型，世界卫生组织于1997年将其列为新的食源性致病菌。EHEC O157:H7主要通过消化道传播，临床可引起出血性肠炎、溶血性尿毒综合症、血栓性血小板减少性紫癜等疾病。EHEC O157:H7引起的散发和暴发流行性病例在世界范围内不断发生，1996年在日本大阪地区发生流行，患者逾万，死亡11人，1999～2000年在中国江苏、安徽等地发生了多起食源性感染EHEC O157:H7事件，导致l77人死亡，2006年9月美国又爆发了毒菠菜事件，原因是人食用了被EHEC O157:H7感染了的生菠菜而被感染。EHEC O157:H7的感染因具有暴发流行趋势、强烈的致病性与致死性以及抗生素治疗可能会加剧病情等特点，已成为全球性的公共卫生问题。

对于突发性传染病，快速检测和鉴定病原体是控制疫情的关键。传统的EHEC O157:H7的实验室检测方法主要包括选择性培养、生化鉴定和免疫、毒素的细胞学试验等，都存在费时费力、检测时限长等弊端，而快速检测方法常见的有基于分子水平的PCR法、多重PCR法、荧光PCR法及基因芯片技术，这些方法自动化程度高，在一定程度上弥补了传统方法的不足。但除荧光PCR法外，扩增产物都需要开盖暴露，容易导致假阳性，但对检测人员要求高，且设备昂贵，不利于基层单位推广应用。因此，研究开发一种检测快速、操作简便、特异性高、灵敏度好、成本低廉、适于基层推广的检测方法，对EHEC O157:H7疫情的监控将起到积极作用。

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是Notomi等人在2000年发明的一种新的恒温核酸扩增技术。传统的PCR技术离不开反复升降温这个耗时耗能的过程，且反应程序设定也较繁琐。相比之下，LAMP技术克服了这些问题。根据LAMP技术的原理，它可实现在恒温条件下(一般在60～65℃)快速连续扩增，实现了实验过程快速、简便，仪器设备简单、便携，检测结果特异性强、灵敏度高的优点。LAMP扩增结果观察方式多，凝胶成像系统观察结果、肉眼观察颜色变化及试纸条技术，也可使用实时荧光法和实时浊度法，通过实时荧光PCR仪或实时浊度仪对扩增结果进行实时观察。

技术实现要素：
：

鉴于此，有必要设计一种检测快速、操作简便、特异性高、灵敏度好、成本低廉的用于检测肠出血性大肠杆菌O157:H7的LAMP检测用引物组，及利用该引物组检测肠出血性大肠杆菌O157:H7的LAMP检测方法。

一种用于检测肠出血性大肠杆菌O157:H7的LAMP检测用引物组，由内引物对FIP/BIP和外引物对F3/B3组成，FIP、BIP、F3、B3具体如下：

一种利用前述引物组检测肠出血性大肠杆菌O157:H7的LAMP检测方法，包括以下步骤：

步骤1、提取待测样品DNA；

步骤2、配制LAMP检测反应体系，反应体系包括引物：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4；

步骤3、以步骤1中提取的DNA为模版进行LAMP扩增反应，用实时浊度法鉴定扩增结果。

优选的，LAMP检测反应体系具体为：2×反应液RM 12～13uL，FIP、BIP各3.7～4.3uL，F3、B3各0.4～0.6uL，Bst DNA聚合酶0.9～1.2uL，待测样品DNA1.8～2.2uL，补超纯水至25uL。

优选的，FIP、BIP的浓度是40umol/L，F3、B3的浓度是5umol/L。

优选的，LAMP扩增反应的反应前的预热温度50.0℃，LAMP扩增反应的反应温度为64.0℃且进行40min，LAMP扩增反应的反应后的酶失活温度95℃进行2min。

上述的LAMP检测方法中，检测结果通过实时浊度仪实时测量浊度值来判断核酸有无扩增。

本发明采用上述技术方案，根据EHEC O157:H7抗原基因rfbE的序列，设计4条特异性LAMP引物，用来建立EHEC O157:H7LAMP检测方法，结果表明，建立的LAMP检测方法对EHEC O157:H7的检测特异性良好，且方法的灵敏度高。与现有技术相比，使用本发明的引物组检测样品中的EHEC O157:H7，不受培养条件的限制，可在50min内完成核酸的检测；本发明对EHEC O157:H7定性检测灵敏度可达到3.45×10⁴CFU/mL，优于一般PCR检测方法，其检测灵敏度是普通PCR的10倍。

附图说明：

附图1是LAMP引物筛选试验图，NO.1-5分别为空白对照、rfbE-1引物组、rfbE-2引物组、rfbE-3引物组和rfbE-4引物组。

附图2是60℃时温度对LAMP反应的影响试验图。

附图3是61℃时温度对LAMP反应的影响试验图。

附图4是62℃时温度对LAMP反应的影响试验图。

附图5是63℃时温度对LAMP反应的影响试验图。

附图6是64℃时温度对LAMP反应的影响试验图。

附图7是65℃时温度对LAMP反应的影响试验图。

附图8是30min时时间对LAMP反应的影响试验图。

附图9是40min时时间对LAMP反应的影响试验图。

附图10是50min时时间对LAMP反应的影响试验图。

附图11是60min时时间对LAMP反应的影响试验图。

附图12是引物特异性鉴定试验图，NO.2-8依次为EHEC O157:H7、致病性大肠埃希氏菌、致泻性大肠埃希氏菌、产肠毒素大肠杆菌、单增李斯特菌、痢疾志贺菌、金黄色葡萄球菌扩增曲线；Left反应槽的NO.1和Right反应槽的NO.9均为空白对照。

附图13是是引物特异性鉴定试验图，NO.10-16依次为宋氏志贺菌、鲍氏志贺菌、阪崎杆菌、甲型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌扩增曲线；Left反应槽的NO.1和Right反应槽的NO.9均为空白对照。

附图14是LAMP反应灵敏度试验图，NO.1为空白对照，NO.2-8分别是菌液浓度为3.45×10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10、10^-1CFU/ml。

附图15是普通PCR反应灵敏度试验图，M为DL1000Marker，N为空白对照，泳道1-7分别是菌液浓度为3.45×10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10、10^-1CFU/ml。

具体实施方式：

以下叙述中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

一、引物设计

按照LAMP引物设计原则，根据GenBank数据库中的EHEC O157:H7抗原基因rfbE基因组序列，进行多序列比对，寻找一段高度保守区作为扩增对象，然后通过分子生物学软件LAMPD Designer5设计4组引物，采用HPLC纯化方式。合成后的引物用超纯水稀释成100pmol/pL溶液，-20℃保存备用。各引物序列见表1。

表1 EHEC O157:H7的LAMP检测用引物

二、检测标准方法的建立

细菌基因组DNA快速抽提试剂盒为生工生物工程(上海)股份有限公司产品，LAMP扩增体系的2×反应液RM、Bst DNA聚合酶为荣研生物科技(中国)有限公司产品。

日本荣研LT-16alpha恒温扩增基因检测系统，ABI Veriti 96Well Thermal Cycler核酸扩增仪、Biorad GelDoc XR凝胶成像系统。

EHEC O157:H7实验用标准菌株购自中国工业微生物保存中心和北京路桥技术股份有限公司(见表2)。

表2实验用菌种名称及编号

1、样品DNA的提取

样品为EHEC O157:H7、致病性大肠埃希氏菌、致泻性大肠埃希氏菌、产肠毒素大肠杆菌、单增李斯特菌、痢疾志贺菌、金黄色葡萄球菌、宋氏志贺菌、鲍氏志贺菌、阪崎杆菌、甲型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌14株标准菌株的液体纯培养物。

DNA的提取方法按照DNA提取试剂盒说明书中关于细菌DNA提取要求进行，具体步骤如下：

(1)吸取1mL过夜培养的细菌菌液，加入1.5mL离心管中，室温8000rpm离心1min，弃上清，收集菌体。加入400uL Buffer Digestion，震荡混匀。65℃水浴1h至细胞完全裂解。

(2)加入200uL Buffer PB，充分颠倒混匀，-20℃冰箱放置5min。

(3)室温10000rpm离心5min，将上清液转移到新的1.5mL离心管中。

(4)加入等体积的异丙醇，颠倒5～8次使之充分混匀，室温静置2-3min。室温10000rpm离心5min，弃上清。

(5)加入1mL75％乙醇，颠倒漂洗1～3min，10000rpm离心2min，弃上清。

(6)重复步骤5一次。

(7)开盖室温倒置5～10min至残留的乙醇完全挥发。

(8)得到的DNA用50～100uLTE Buffer溶解。

获得的DNA模板的260/280比值均在1.8-2.0之间,浓度在200-500ng/uL。提取的DNA质量和浓度较高，适合后续的扩增反应。

2、LAMP反应体系

反应体系为：2×反应液RM 12.5uL，内引物FIP、BIP各4uL，外引物F3、B3各0.5uL，Bst DNA聚合酶1uL，DNA模版2.O uL，补水至25uL。

内引物FIP、BIP的浓度是40umol/L，外引物F3、B3的浓度是5umol/L。

DNA模版由各细菌的培养物提取而得。

3、最优引物的筛选

将表1的4组引物(rfbE-1、rfbE-2、rfbE-3、rfbE-4)以EHEC O157:H7 DNA为模板，在荣研LT-16alpha恒温扩增基因检测系统上同时进行LAMP反应，并设空白对照，如附图1所示。

扩增反应的程序为：反应温度为63℃，反应时间为50min，反应结束后读取数值。结果显示，引物组rfbE-3扩增开始时间(Tt值)最早(见附图1)，且曲线峰值高度(Df)值较高，引物组rfbE-3扩增开始时间(Tt值)和曲线峰值高度(Df值)具体数值见表3。

表3 LAMP引物筛选试验Tt值和Df值

4、LAMP反应条件的优化

4.1、反应温度的优化：以上述筛选的最优引物组rfbE-3作为扩增引物，以EHEC O157:H7 DNA为模板，95℃酶失活2min，做6组对照，分别将反应混合物放在60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃反应条件下进行LAMP反应，并设空白对照，附图2～7分别为60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃扩增曲线图，Left反应槽的NO.1和Right反应槽的NO.9均为空白对照，反应时间为50min，反应结束后读取数值。结果显示，当反应温度为62℃时,扩增效果最好，各反应组扩增开始时间(Tt值)和曲线峰值高度(Df值)具体数值见表4。因此，引物组rfbE-3扩增反应的最佳温度为62℃。

表4 LAMP反应温度优化试验Tt值和Df值

4.2、反应时间的优化：以上筛选的最优引物组rfbE-3作为扩增引物，以EHEC O157:H7 DNA为模板，以上述最优62℃为反应温度，95℃酶失活2min，做4组对照，分别将反应混合物放在30min、40min、50min、60min反应条件下进行LAMP反应，并设空白对照，附图8～11分别为30min、40min、50min、60min扩增曲线图，Left反应槽的NO.1和Right反应槽的NO.9均为空白对照，反应结束后读取数值。结果显示，当反应时间为40℃时，扩增效果最好，用时最短，各反应组扩增开始时间(Tt值)和曲线峰值高度(Df值)具体数值见表5。因此，引物组rfbE-3扩增反应的最佳温度为40min。

表5 LAMP反应时间优化试验Tt值和Df值

通过反复实验验证，对EHEC O157:H7的LAMP反应条件进行调整，调整优化后的LAMP反应温度为64℃，反应时间为40min，95℃酶失活2min。

三、引物的特异性鉴定:

为了验证设计引物对EHEC O157:H7检测的特异性，用第二部分(检测标准方法的建立)所述反应体系和优化后条件，以13种非EHEC O157:H7细菌和一株阳性对照EHEC O157:H7细菌培养物提取的DNA为模板进行LAMP扩增检测，并设置空白对照，NO.2-8(a)依次为EHEC O157:H7、致病性大肠埃希氏菌、致泻性大肠埃希氏菌、产肠毒素大肠杆菌、单增李斯特菌、痢疾志贺菌、金黄色葡萄球菌扩增曲线图，NO.10-16(b)依次为宋氏志贺菌、鲍氏志贺菌、阪崎杆菌、甲型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌扩增曲线图，Left反应槽的NO.1和Right反应槽的NO.9均为空白对照，反应结束后读取数值。

检测结果见附图12～13，可以看出，只有以EHEC O157:H7细菌纯培养物提取的DNA模板有扩增曲线出现，其他反应孔均无扩增曲线出现，其它样品为阴性。结果表明，引物组rfbE-3对EHEC O157:H7细菌具有专一性，可用于对EHEC O157:H7细菌的特异性检测。

四、灵敏度实验：

1、原菌液浓度的定量

经37℃过夜培养的处于对数生长期的EHEC O157:H7菌液，用生理盐水10倍系列稀释，平板菌落计数，推算原菌液浓度。通过平板菌落计数法测得EHEC O157:H7原菌液浓度为3.45×107cfu/ml，菌落计数结果见表6。

表6肠出血性大肠杆菌O157：H7平板计数

2、模板的稀释以及LAMP反应：:将上一步骤中(原菌液浓度的定量)测得的原菌液依次做10倍梯度稀释，稀释度为10-1-10-7，分别标记为1号、2号、3号、4号、5号、6号、7号，然后每个稀释度取2uL作为模板,用第二部分(检测标准方法的建立)所述反应体系和条件进行LAMP反应，反应结束后读取数值。同时，也使用传统的PCR方法进行扩增，反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，进行35个循环；72℃延伸7min，4℃保存反应产物，反应结束后，取反应产物进行凝胶电泳检测，PCR产物长度为196bp。

3、检测结果见附图14和附图15，图14中NO.1为空白对照，NO.2-8分别是菌液浓度为3.45×106、105、104、103、102、10、10-1CFU/ml；图15中M为DL1000Marker，N为空白对照，泳道1-7分别是菌液浓度为3.45×106、105、104、103、102、10、10-1CFU/ml。结果表明：传统的PCR扩增的敏感性测定结果1、2号泳道有特异性条带，其它泳道无特异性扩增，即PCR的扩增的最低灵敏度为3.45×105CFU/ml。LAMP扩增反应结果见附图14，NO.1-3号反应孔有扩增曲线出线，及LAMP扩增最低灵敏度为3.45×104CFU/ml，与普通PCR相比，灵敏度提高了10倍。

通过以上实验最终确定了本发明的一种用于检测肠出血性大肠杆菌O157:H7的LAMP检测用引物组，由内引物对FIP/BIP和外引物对F3/B3组成，FIP、BIP、F3、B3具体如下：

一种利用前述引物组检测肠出血性大肠杆菌O157:H7的LAMP检测方法，包括以下步骤：

步骤1、提取待测样品DNA；

步骤2、配制LAMP检测反应体系，反应体系包括引物：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4，2×反应液RM 12.5uL，FIP、BIP的浓度是40umol/L且各4uL，F3、B3的浓度是5umol/L且各0.5uL，Bst DNA聚合酶1.0uL，待测样品DNA2.0uL，补超纯水至25uL；

步骤3、以步骤1中提取的DNA为模版进行LAMP扩增反应，LAMP扩增反应的反应前的预热温度50.0℃，LAMP扩增反应的反应温度为64.0℃且进行40min，LAMP扩增反应的反应后的酶失活温度95℃进行2min，用实时浊度法鉴定扩增结果。

序列表

<110>宁夏出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心

<120>用于检测肠出血性大肠杆菌O157:H7的LAMP检测用引物组及检测方法

<170>PatentIn version 3.5

<160>4

<210>1

<211>50

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

TGCCTATGTACAGCTAATCCTTGGTTTTATGACAAAACACTTTATGACCG 50

<210>2

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

ATTGGCATGACGTTATAGGCTACTTTTGCTTGTTCTAACTGGGCTAA 47

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

GTGGAATGGTTGTCACGA 18

<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

AGCAATTTCACGTTTTCGT 19