KIT基因突变检测试剂盒的制作方法

本发明涉及一种试剂盒，具体涉及一种肿瘤相关基因KIT基因突变检测试剂盒。
背景技术：
：胃肠道间质瘤（GIST）是消化道最常见的间叶源性肿瘤。绝大部分的GIST均表达c-kit基因编码的Kit蛋白（CD117），c-kit基因位于人染色体4q12-13，属于原癌基因，其产物是Ⅲ型酪氨酸激酶。在分子层面上，大部分的GIST均存在c-kit基因突变，从而导致kit蛋白的活化不需要配体SCF参与就能刺激肿瘤细胞的持续增殖和抗凋亡信号的失控。格列卫（Glivec）是一种酪氨酸激酶抑制剂，经FDA批准可用于治疗c-kit阳性、不能手术切除和/或转移性的恶性GIST，其临床疗效令人振奋。其作用机理在于药物结合于Kit蛋白胞浆内酪氨酸激酶功能区的ATP结合位点，阻断磷酸基团由ATP向底物酪氨酸残基的转移，从而抑制细胞增殖并恢复细胞凋亡程序。GIST中c-kit基因突变率约为90%，且突变形式多样。其中位于11号外显子Lys550-Val560区段的变异最为常见（约占70-80%），位于9号外显子Ala502-Tyr503区段的6碱基重复突变约占5-10%。临床研究表明GIST中c-kit基因的突变情况与格列卫分子靶向治疗的疗效相关：存在11号外显子突变患者的疗效最好，存在9号外显子突变的患者疗效次之，而野生型GIST的疗效最差。另外，对于9号外显子突变的患者，提高用药剂量可显著提高疗效。检测c-kit基因突变对于指导GIST患者的合理用药，具有重要的参考价值。另外，c-kit的配体为干细胞生长因子。c-kit受体正常表达于造血干/祖细胞，在急性淋巴细胞白血病中极少或不表达，而在急性髓性白血病(AML)中则表达较高，但在AML的各亚型表达不尽一致，因而c-kit受体检测有助于急性白血病(AL)的分类诊断和分型诊断。c-kit在原发性AML患者的表达高于MDS转变的AML，因此，c-kit检测有助于两种不同AML的鉴别诊断。SCF/c-kit诱导的细胞凋亡耐受与AML患者化疗疗效差有关，抗c-kit单抗可逆转AL细胞对化疗的凋亡耐受，这为难治性AML的治疗提供了新的思路。KIT基因突变的检测主要有Sanger测序法、ARMS、RT-PCR等。其中RT-PCR技术采用等位基因特异性扩增法对样本的基因突变进行区分，该方法成本较低，但检测率较高，容易出现假阴性结果；ARMS技术是目前国内应用最为广泛的技术，但只能检测已知的位点，且要将样本分成多个管进行实验才能实现分型，对样本量要求高；而Sanger测序法是DNA序列分析的经典方法，最直接的、可检测已知和未知突变的一种方法。由于该方法可直接读取DNA的序列，因此被认为是基因分型的金标准，其主要优点是测序长度较长，可发现新的变异位点，包括一些新的少见的突变形式及突变的确切类型，如点突变、片段缺失。所以探索一种可以采用Sanger测序法检测KIT基因的技术具有重要的临床意义。技术实现要素：本发明的目的是为了解决上述问题，提供一种KIT基因突变检测试剂盒，可直接利用含人体某组织部位的石蜡包埋样本通过Sanger测序法检测出样本中KIT基因主要突变位点型别，检测位点包括KIT基因9、11、13、14和17五个外显子的主要突变位点，包括但不限于9号外显子上c.15091510insGCCTAT突变位点；11号外显子上c.16481680del缺失突变位点；13号外显子上c.1961T>C突变位点；14号外显子上c.2009C>T突变位点，17号外显子上c.2247A>T突变位点。本发明的KIT基因突变检测试剂盒具体包括：（1）用于扩增样本中KIT基因Exon9、11、13、14和17五个外显子的特异性引物，具体序列如下:（2）用于测序PCR的测序引物，分别用于对KIT基因Exon9、11、13、14和17五个外显子进行测序分析，具体序列如下：外显子名称序列号Reverse5’-3’9SEQ-K9SEQIDNo.11AGCCAGGGCTTTTGTTTTCT11SEQ-K11SEQIDNo.12AAACAAAGGAAGCCACTGGA13SEQ-K13SEQIDNo.13GTTCCTGTATGGTACTGCATGCG14SEQ-K14SEQIDNo.14TCTCACCTTCTTTCTAACCTTTTCTT17SEQ-K17SEQIDNo.15TTTGACTGCTAAAATGTGTGA3）5个装有KIT野生型质粒和突变型质粒按1:1质量比例混合的阳性质控品管和1个装有PCR反应预混液的试管；其中突变型质粒包括9号外显子上c.15091510insGCCTAT突变位点；11号外显子上c.16481680del缺失突变位点；13号外显子上c.1961T>C突变位点；14号外显子上上c.2009C>T突变位点；17号外显子上c.2247A>T突变位点；PCR反应预混液由以下组份组成：组份体积（μl）10PCRbuffer2.55Qsolution525mMMgCl22.525mMdNTPs0.4H2O9.35其中10×PCRbuffer中含有500mMKCl，100mMTris-HCl(pH8.3)，100mM(NH4)2SO4，和15mMMgCl2；5×Qsolution中含有1MTricine[pH8.7(withKOH)]，8%(v/v)Glycerol和5%(v/v)DMSO；25mMdNTPs中含有25mMdATPs、25mMdTTPs、25mMdCTPs和25mMdGTPs。本试剂盒主是根据KIT基因的Exon9、11、13、14和17五个外显子的保守序列分别设计KIT基因四个外显子的特异性引物，分别将Exon9、11、13、14和17号外显子使用PCR的方法进行扩增，纯化回收扩增产物。本发明的各种引物长度在20-25个碱基之间，无特殊修饰。反应液预混液采用独特的配方及比例。不同外显子的PCR扩增条件一致，且能在样本浓度较低时检测到目的基因，结果无非特异性扩增。具体操作流程包括：（1）引物设计：利用引物设计软件，如PrimerPremier5，从KIT基因DNA序列中挑选特定的序列，然后根据碱基互补特点，设计KIT基因Exon9、11、13、14和17五个外显子的特异性引物，用于扩增样本中DNA。测序引物的设计与用于扩增样本中DNA的特异性引物的设计类似，不过测序引物只需要一段即可，引物序列分别是SEQIDNOs：1-15。长度在20-25个碱基左右（2）PCR扩增：利用试剂盒中含特定序列的引物PCR扩增临床样本中的DNA。（3）琼脂糖凝胶电泳及胶回收：将扩增得到的目的基因KIT的Exon9、11、13、14和17五个外显子片段回收用于测序。附图说明以下是附图的说明，以便于理解上述发明的目的和具体特征。图1为KIT基因的Exon9、11、13、14和17五个外显子的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果。图1中各标号的具体表示如下：1：1号样本；2：2号样本；3：3号样本；9：KIT基因第9号外显子；11：KIT基因第11号外显子；13：KIT基因第13号外显子；14：KIT基因第14号外显子；17：KIT基因第17号外显子；M：DNAmaker，从上到下大小依次为2000、1000、750、500、250和100。图2-1为KIT基因的Exon9外显子的测序结果截图，测序结果为野生型。图2-2为KIT基因的Exon9外显子的测序结果截图，测序结果为突变体。图2-3为KIT基因的Exon11外显子的测序结果截图，测序结果为野生型。图2-4为KIT基因的Exon11外显子的测序结果截图，测序结果为突变体。图2-5为KIT基因的Exon13外显子的测序结果截图，测序结果为野生型。图2-6为KIT基因的Exon13外显子的测序结果截图，测序结果为突变体。图2-7为KIT基因的Exon14外显子的测序结果截图，测序结果为野生型。图2-8为KIT基因的Exon14外显子的测序结果截图，测序结果为突变体。图2-9为KIT基因的Exon17外显子的测序结果截图，测序结果为野生型。图2-10为KIT基因的Exon17外显子的测序结果截图，测序结果为突变体。具体实施方式1、引物设计根据KIT基因在肺癌等疾病中的突变情况及个体化治疗后产生的耐药机制，利用引物设计软件，如PrimerPremier5，从KIT基因DNA序列中挑选特定的序列，然后根据碱基互补特点，设计KIT基因Exon9、11、13、14和17五个外显子的特异性引物，用于扩增样本中DNA。引物序列分别是SEQIDNos：1-10。测序引物的设计与用于扩增样本中DNA的特异性引物的设计类似，不过测序引物只需要一段即可，引物序列分别是SEQIDNos：11-15。长度在20-25个碱基。2、PCR扩增2.1、质控品准备阳性质控品为KIT野生型质粒和突变型质粒按1:1质量比例混合的混合物，阴性质控品为无菌水。使用前室温融化，旋涡振荡10秒，瞬时离心10秒。2.2、试剂配制提前将试剂取出，室温融化，旋涡振荡10秒，瞬时离心10秒。确定反应数N，N=待检样本数（n）×5+质控品数+1。计算加到反映混合物中的各个试剂的量，计算如下：组分PCRmix3（即PCR反应预混液）Taq酶体积（μl）19.75×N0.25×N取一个灭菌离心管配制上述反应体系，试剂全部加入后旋涡振荡10秒，瞬时离心。然后将上述混合液按20μl/管分装至PCR反应管中。2.3、加样将KIT阳性质控品、阴性质控品和样本DNA分别取2.5μl加入到PCR反应管中，其中样本要稀释至20ng/μl；然后再将相应的引物加入到对应的PCR反应管中，每个样本需要引物各加1.25μl（引物用之前先稀释1/10至10µM），同时作好标记，盖紧管盖后，瞬时离心15秒，将管壁上的液体全部甩至管底，消除气泡，可重复离心至气泡完全消除。然后立即进行PCR扩增反应。2.4、PCR扩增配置完成后，将PCR管放入PCR仪进行反应，PCR反应程序如下：3、PCR产物的琼脂糖凝胶电泳及回收由于PCR产物长度较短，配制2%（w/w）的琼脂糖凝胶；电泳条件为120V，20min。电泳完成后，取出凝胶，使用Bio-Rad凝胶成像系统拍照，并记录扩增条带情况。如果PCR产物电泳结果良好，即可回收目的片段用于测序。回收得到的产物即可用于测序。序列表<110>广州凯普医药科技有限公司<120>KIT基因突变检测试剂盒<160>15<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>KITEx9-F<400>1agccagggcttttgttttct20<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>KITEx9-R<400>2cagagcctaaacatcccctta21<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>KITEx11-F<400>3cctttgctgattggtttcgt20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>KITEx11-R<400>4aaacaaaggaagccactgga20<210>5<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>KITEx13-F<400>5gttcctgtatggtactgcatgcg23<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>KITEx13-R<400>6cagtttataatctagcattgcc22<210>7<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>KITEx14-F<400>7tctcaccttctttctaaccttttctt26<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>KITEx14-R<400>8aacccttatgaccccatgaa20<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>KITEx17-F<400>9tttcttttctcctccaacct20<210>10<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>KITEx17-R<400>10tttgactgctaaaatgtgtga21<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>SEQ-K9<400>11agccagggcttttgttttct20<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>SEQ-K11<400>12aaacaaaggaagccactgga20<210>13<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>SEQ-K13<400>13gttcctgtatggtactgcatgcg23<210>14<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>SEQ-K14<400>14tctcaccttctttctaaccttttctt26<210>15<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>SEQ-K17<400>15tttgactgctaaaatgtgtga21当前第1页1 2 3