精确鉴定燕麦成分的检测试剂及检测方法与流程

本发明属于核酸检测技术领域，更具体地，本发明涉及精确鉴定燕麦成分的检测试剂及检测方法。

背景技术：

燕麦是(拉丁学名：Avena sativa L.)为禾本科植物，一年生草本；根系发达，秆直立光滑，叶鞘光滑或背有微毛，叶舌大，没有叶耳，叶片扁平；圆锥花序(panicle)，穗轴直立或下垂，向四周开展，小穗柄弯曲下垂；颖宽大草质，外稃坚硬无毛，有或无芒；颖果腹面具有纵沟，被有稀疏茸毛；成熟时内外稃紧抱子粒，不容易分离。燕麦具顶生圆锥花序。小穗含2至数花，大都长过2厘米，柄弯曲，脱节于颖之上及诸小花之间，亦有不断者，颖具7～11脉，长于下部小花，外稃质地多坚硬，具5～9脉，有芒或无，芒多自稃体中部伸出，芒柱扭转而曲；雄蕊3枚，子房有毛。

燕麦中的β-葡聚糖可减缓血液中葡萄糖含量的增加，预防和控制肥胖症、糖尿病及心血管疾病。燕麦富含的膳食纤维具有清理肠道垃圾的作用。由于燕麦具有特殊的功能性及营养学特性，燕麦已很普遍地被运用于食品加工中，制造各种营养食品和饮品。但是，一些不法商家经常以次充好，以低廉的其它类似物种的成分代替燕麦成分应用于食品制品中。同时燕麦也是一种常见的过敏原成分，欧美等国外发达国家要求预包装食品强制性标识以提示过敏原人群，检测出燕麦成分，可以规范食品标识，有助于一些过敏性疾病患者在购买食品时作出合适的选择。

因此，本领域需要可方便地从样品中鉴定燕麦成分的检测手段，以满足食品监控、食品安全的需要，以及更好地保护消费者的合法权益。并且，由于燕麦被广泛地应用于各种食品加工品中，需要开发快速、方便、成本低廉、设备要求低的检测试剂及检测方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供精确鉴定燕麦成分的检测试剂及检测方法。

在本发明的第一方面，提供一种鉴定燕麦成分的方法，所述方法包括：

以待测样品的DNA为模板，以特异性扩增引物进行环介导等温扩增；若发生特异性扩增，则表明待测样品中包含燕麦成分；

所述的特异性扩增引物包括：正向外引物SEQ ID NO:1，反向外引物SEQ ID NO:2，正向内引物EQ ID NO:3，反向内引物SEQ ID NO:4，正向环引物EQ ID NO:5，反向环引物SEQ ID NO:6。

在一个优选例中，所述的环介导等温扩增在63±1℃恒温反应。

在另一优选例中，所述的环介导等温扩增的体系中包括所述的特异性扩增引物、Mg²⁺、甜菜碱、dNTP、DNA聚合酶。

在另一优选例中，Mg²⁺浓度8±1mM；甜菜碱浓度1±0.2M；dNTP浓度1.6±0.2mM。

在另一优选例中，所述的待测样品是食品、饮料或饲料。

在另一优选例中，所述方法对于燕麦的检测灵敏度为按照重量比0.05％。

在本发明的另一方面，提供用于鉴定燕麦成分的引物，所述引物是LAMP扩增引物，包括：上正向外引物SEQ ID NO:1，反向外引物SEQ ID NO:2，正向内引物EQ ID NO:3，反向内引物SEQ ID NO:4，正向环引物EQ ID NO:5，反向环引物SEQ ID NO:6。

在本发明的另一方面，提供所述的引物的用途，用于从待测样品中鉴定燕麦成分。

在本发明的另一方面，提供一种鉴定燕麦成分的试剂盒，其中包括所述的引物。

在一个优选例中，所述试剂盒中还包括：

含有燕麦成分的检测标准品；

DNA提取试剂；

pH缓冲试剂；

钾离子溶液；

镁离子溶液；

铵离子溶液；

Tween20；

甜菜碱；

dNTP；

Bst大片段DNA聚合酶；

荧光染料；和/或

说明鉴定燕麦成分的方法的使用说明书。

本发明的其它方面由于本发明的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、燕麦成分LAMP特异性检测结果；

A、LAMP扩增曲线；

B、LAMP扩增产物的鉴定结果；

其中，第一横排小管，从左至右所针对的依次为：燕麦、荞麦、小麦、大麦、玉米、大米、小米、大豆；

第二横排小管，从左至右所针对的依次为：羽扇豆、豌豆、白云豆、绿豆、赤豆、马铃薯、红薯、花生；

第三横排小管，从左至右所针对的依次为：莲子、扁桃仁、开心果、芹菜、芝麻、芥末、牛、羊；

第四横排小管，从左至右所针对的依次为：鸡、鸭、鹅、火鸡、鸽子、猪、梅花鹿、梭子蟹；

第四五横排小管，从左至右所针对的依次为：牛蛙、草鱼、甲鱼、黄鱼、大西洋鲑、阴性对照(ddH₂O)。

图2、燕麦成分LAMP灵敏度检测图；

A、LAMP扩增曲线，扩增曲线从左到右分别为：100％燕麦、10％燕麦、1％燕麦、0.1％燕麦、0.05％燕麦。

B、LAMP扩增产物的鉴定结果；1～8依次为：100％燕麦、10％燕麦、1％燕麦、0.1％燕麦、0.05％燕麦、0.01％燕麦、0％(w/w)燕麦、阴性对照(ddH₂O)。

图3、燕麦LAMP检测的稳定性实验；

A、20份1％燕麦样品的LAMP扩增曲线；

B、20份1％燕麦样品以及阴性对照的LAMP扩增产物的检测结果；其中，第一横排左起第1管为阳性对照；第一横排左起第2管为阴性对照；其它小管为1％燕麦样品。

图4、0.1％燕麦样品的稳定性检测图；

A、20份0.1％燕麦平行样品LAMP扩增曲线；

B、20份0.1％燕麦样品以及阴性对照的LAMP扩增产物的检测结果；其中，第一横排左起第1管为阳性对照；第一横排左起第2管为阴性对照；其它小管为0.1％燕麦样品。

图5、0.05％燕麦样品的稳定性检测图；

A、20份0.05％燕麦平行样品LAMP扩增曲线；

B、20份0.05％燕麦样品以及阴性对照的LAMP扩增产物的检测结果；其中，第一横排左起第1管为阳性对照；第一横排左起第2管为阴性对照；其它小管为0.05％燕麦样品。

图6、0％燕麦样品的稳定性检测图。

A、20份0％燕麦平行样品LAMP扩增曲线；

B、20份0％燕麦样品以及阴性对照的LAMP扩增产物的检测结果；其中，第一横排左起第1管为阳性对照；第一横排左起第2管为阴性对照；其它小管为0％燕麦样品。

图7、样品市售样品的LAMP检测图；

1-40：40份未含燕麦麦成分的食品(面粉、面条、面包、馒头等面制品，肉、肉肠、罐头等肉制品，牛奶、奶粉等奶制品，蛋制品，蔬菜制品、坚果、饮料等)；反应液呈橙色；

41-42：混合谷物粉(含燕麦)；反应液呈绿色；

43-44：混合谷物粉(含燕麦)；反应液呈绿色；

45-46：燕麦面包；反应液呈绿色；

47-48：燕麦馒头；反应液呈绿色；

49：阴性对照；反应液呈橙色；

50：阳性对照；反应液呈绿色。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究和试验，首次揭示一种燕麦成分的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)检测方法。经过比较筛选，本发明人揭示了对于燕麦特异性良好的LAMP扩增引物，所述引物针对含有燕麦成分的DNA可发生特异性扩增(获得阳性结果)，而对没有燕麦成分的DNA不发生特异性扩增(获得阴性结果)。本发明的方法可良好地应用于鉴定食品燕麦成分，并且具有良好的再现性、灵敏度、检测稳定性。

目前市场上的食品大多是混合成分制成的，各种成分在细加工后很难辨认。并且植物燕麦以外的其它一些禾本科植物与燕麦性状接近，更是增加了区分难度，即使采用一些基因或蛋白水平上的技术，也由于这些物种间在亲缘关系上较近，难以找到符合标准的、检测准确性高、实用性强的燕麦检测靶标。为此，本发明人经过深入的研究和大量的筛选，找到了合适的检测靶标，基于此开发了LAMP检测食品燕麦成分的方法。

如本文所用，所述的“燕麦成分”是指特异性来自于燕麦的成分，例如燕麦粉等。

如本文所用，所述的“待测样品”可以是食品、饮料或饲料。

本发明人通过对引物的筛选，获得一类可特异性鉴定燕麦成分的引物，其对于燕麦的DNA发生特异性扩增，而对没有燕麦成分的DNA不发生特异性扩增。

因此，本发明提供一种引物，所述的引物是LAMP扩增引物，包括：正向外引物SEQ ID NO:1，反向外引物SEQ ID NO:2，正向内引物EQ ID NO:3，反向内引物SEQ ID NO:4，正向环引物EQ ID NO:5，反向环引物SEQ ID NO:6。

本发明的这些引物还可以用放射性同位素、生物素、酶、荧光素或其他化学发光物质进行标记。

利用本发明的引物，进行LAMP反应，并通过浊度仪检测或显色观察，就可以准确、快速地判断待测样品是否含有燕麦成分，而且所需的样品量很少。

本发明还提供了一种鉴定食品燕麦成分的方法，所述方法包括：以待测样品的DNA为模板，以本发明的LAMP引物进行扩增；若发生特异性扩增，则表明待测样品中包含燕麦成分。更优选地，基于本发明所提供的适用于鉴定食品燕麦成分的特异性引物，所述方法包括：以待测样品的DNA为模板，以SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的引物进行扩增；若发生特异性扩增，则表明待测样品中包含燕麦成分。

LAMP是近年来发展的一种新颖和较成熟的等温核酸扩增技术。LAMP是针对靶基因的多个区域设计特异引物，利用链置换DNA聚合酶在等温条件下，即可完成的核酸扩增反应。与PCR方法相比，LAMP不需要热循环仪(PCR仪)，且由于LAMP反应中产生大量的副产物-白色焦磷酸镁沉淀，扩增产物通过肉眼观察或浊度计即可判定结果；因此LAMP适合于现场或条件较差的实验室进行快速检测。LAMP技术具有快速、准确和操作简便等优点。

获取待测样品的DNA的方法是本领域技术人员所熟知的技术，例如可采取传统的酚/氯仿/异戊醇法，或者可采用一些商购的DNA提取试剂盒，这类试剂盒是本领域技术人员熟知的。

本发明还涉及一种用于鉴定燕麦成分的试剂盒，所述试剂盒中含有针对燕麦的LAMP扩增引物。

此外，所述的试剂盒还可含有其它鉴定燕麦成分的试剂，如(但不限于)：含有燕麦成分的检测标准品；DNA提取试剂；pH缓冲试剂(如Tris-HCl(PH8.8))；钾离子溶液；镁离子溶液；铵离子溶液；Tween20；甜菜碱；dNTP；Bst大片段DNA聚合酶；荧光染料(如SYBR Green I荧光染料)。

此外，所述的试剂盒中还可含有鉴定燕麦成分的使用说明书和/或标准操作程序。

本发明所述的试剂盒可实现快速检测、批量检测食品燕麦成分的目的。

本发明的主要优点在于：

(1)首次揭示一种可特异性鉴定燕麦成分的引物，所述的引物特异性良好，对于燕麦来源的成分能够实现特异性扩增，而对于燕麦以外的其它成分不能特异性扩增。并且，所述引物具有良好的再现性、结果稳定可靠。

(2)利用所述的引物或含有所述引物的检测试剂盒，可快速、大批量地检测燕麦成分，从待测样品中快速准确地区分燕麦成分，并且所需样品量少，操作简单。

(3)本发明的方法用于食品安全突发事件现场的检测和食品生产企业生产过程控制中的样品检测，填补食品现场快速检测方法的空白。本发明的方法的推广应用对保障产品的质量，保护消费者知情权和选择权，维护正常的经济秩序等提供了技术支持。为食品的市场监督部门和检验检疫部门提供了技术支持。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

1.1 样品

燕麦产品(麦片谷物粉、面包、馒头)4份；其他未含燕麦成分的食品(面粉、面条、面包、馒头等面制品，肉、肉肠、罐头等肉制品，牛奶、奶粉等奶制品，蛋制品，蔬菜制品、坚果、饮料等)40份，购自上海超市，用于实际样品检测。

1.2 主要试剂和耗材

LAMP反应试剂：Bst DNA polymerase large fragment，New England Biolabs公司。

甜菜碱(Betaine)、MgCl₂，Sigma公司。

dNTPs，宝生物工程(大连)有限公司。

SYTO-9荧光染料，Invitrogen公司。

1.3 主要仪器设备

台式离心机，PICO17，Thermo Fisher Scientific。

荧光PCR，7500，Applied Biosystems。

漩涡混合器，MS 2，德国IKA公司。

微量移液器，1000μL、200μL、100μL、10μL，2.5μL，德国Eppendorf公司。

1.4 引物设计

本发明人进行了大量的研究、分析，包括燕麦种间比较以及燕麦与大量其它物种的比较。经过比对和实验验证，找到了针对同燕麦品种特异性的核苷酸序列，并在此基础上设计了LAMP特异性检测引物。所述的引物序列见表1。

表1、燕麦检测用的LAMP引物

1.5 样品制备

使用冷冻研磨机将燕麦和小麦磨成粉末状，并60℃烘干6h。用小麦粉配成燕麦粉含量为100％、10％、1％、0.1％、0.05％、0.01％、0％(w/w)的燕麦粉样品，用于燕麦成分的灵敏度测试。

1.6 DNA提取及制备

使用天根动物基因组提取试剂盒(天根生化科技有限公司，目录号：DP323)提取动物样品的DNA，使用植物DNA小量提取试剂盒(OMEGA公司，HPE.Z.N.HP Plant DNA Kit，货号D2485)提取植物样品的DNA，提取方法详见试剂盒操作说明书。使用BioPhotometer plus核酸蛋白含量测定仪(德国Eppendorf公司)测定核酸浓度。

1.7 LAMP反应体系

25μL的LAMP反应体系，其成分包括：FIP和BIP各1.6μM，F3和B3各0.2μM，FLP和BLP各0.8μM，20mM Tris-HCl(PH8.8)，10mM KCl，8mM MgSO₄，10mM(NH₄)₂SO₄，0.1％Tween20，1M甜菜碱，1.6mM dNTP，8U Bst大片断DNA聚合酶，0.5μL SYTO-9，2μL DNA模板。

LAMP扩增反应程序为：63℃30s；63℃1min，60个循环；80℃5min,使用实时荧光PCR仪收集荧光信号，其LAMP扩增结果也可显色观察。实际应用是，如果仅目测观察实验结果，不使用实时荧光PCR仪，使用恒温装置即可，LAMP扩增反应程序可修改为：63℃30s；63℃1h；80℃5min,通过目测显色观察反应情况，若是反应液呈绿色，表示发生了LAMP特异性扩增，燕麦成分阳性。若是反应液保持橙色，则表示反应阴性。

1.8 LAMP引物特异性实验

用燕麦、荞麦、小麦、大麦、玉米、大米、小米、大豆、羽扇豆、豌豆、白云豆、绿豆、赤豆、马铃薯、红薯、花生、莲子、扁桃仁、开心果、芹菜、芝麻、芥末、牛、羊、鸡、鸭、鹅、火鸡、鸽子、猪、梅花鹿、梭子蟹、牛蛙、草鱼、甲鱼、黄鱼、大西洋鲑DNA作为LAMP反应的模板，进行LAMP反应。

1.9 LAMP灵敏度实验

对100％、10％、1％、0.1％、0.05％、0.01％、0％(w/w)燕麦样品DNA进行LAMP实验，以ddH₂O代替DNA模板作为阴性对照，进行LAMP扩增。

1.10 LAMP稳定性实验

1.10.1 1％稳定性实验

用小麦粉分别将燕麦配制成1％燕麦粉样品，以20份1％燕麦样品作为模板，以ddH₂O代替DNA模板作为阴性对照，以燕麦DNA(100ng/μL)作为阳性对照，进行LAMP扩增。

1.10.2 0.1％稳定性实验

用小麦粉分别将燕麦配制成0.1％燕麦粉样品，以20份0.1％燕麦样品作为模板，以ddH₂O代替DNA模板作为阴性对照，以燕麦DNA(100ng/μL)作为阳性对照，进行LAMP扩增。

1.10.3 0.05％稳定性实验

用小麦粉分别将燕麦配制成0.05％燕麦粉样品，以20份0.05％燕麦样品作为模板，以ddH₂O代替DNA模板作为阴性对照，以燕麦DNA(100ng/μL)作为阳性对照，进行LAMP扩增。

1.10.4 0％稳定性实验

用100％小麦粉作为0％燕麦粉样品，以ddH₂O代替DNA模板作为阴性对照，以燕麦DNA(100ng/μL)作为阳性对照，进行LAMP扩增。

1.11 实际样品检测

使用本发明建立的检测方法对市售的4份含燕麦成分产品以及40份未含燕麦成分的食品进行检测，判定新建立的检测方法能否适用于市售样品中燕麦成分的检测。

实施例1、燕麦成分的LAMP特异性检测

使用本方法的检测引物和检测体系对燕麦、荞麦、小麦、大麦、玉米、大米、小米、大豆、羽扇豆、豌豆、白云豆、绿豆、赤豆、马铃薯、红薯、花生、莲子、扁桃仁、开心果、芹菜、芝麻、芥末、牛、羊、鸡、鸭、鹅、火鸡、鸽子、猪、梅花鹿、梭子蟹、牛蛙、草鱼、甲鱼、黄鱼、大西洋鲑DNA进行LAMP检测。

LAMP扩增结果如图1A，燕麦成分样品出现荧光扩增曲线，其他物种成分均未出现扩增曲线。

LAMP鉴定结果如图1B，燕麦成分样品LAMP扩增产物呈绿色(以箭头标示该样品)，其他物种成分和阴性对照的扩增产物均呈橙色(非箭头标示样品)。

上述实验表明，本发明建立的检测引物和检测体系具有物种特异性。

实施例2、LAMP灵敏度实验

将100％、10％、1％、0.1％、0.05％、0.01％、0％(w/w)含量的燕麦样品DNA作为模板，以ddH₂O作为阴性对照，用于进行LAMP反应。

LAMP扩增结果如图2A，100％、10％、1％、0.1％、0.05％燕麦样品出现扩增，0.01％、0％燕麦和阴性对照未出现扩增。

LAMP鉴定结果如图2B，100％、10％、1％、0.1％、0.05％燕麦样品扩增产物呈绿色(以箭头标示该样品)，0.01％、0％燕麦和阴性对照扩增产物呈橙色(非箭头标示该样品)。

上述结果表明，本发明建立的检测引物和检测体系的检测灵敏度为0.05％。

实施例3、燕麦LAMP检测的稳定性实验

1、1％燕麦样品的稳定性实验

对20份1％燕麦平行样品进行LAMP扩增，20份燕麦样品均出现扩增，结果如图3A。

对20份1％燕麦平行样品进行LAMP扩增产物检测，阳性对照(除了第一横排左起第1管)和20份燕麦样品(除了第一横排左起第1-2管)扩增产物呈绿色，阴性对照扩增产物呈橙色(第一横排左起第2管)，结果如图3B。

上述实验表明，本发明建立的检测引物和检测体系能稳定检出1％燕麦样品。

2、0.1％燕麦样品的稳定性实验

对20份0.1％燕麦平行样品进行LAMP扩增。结果如图4A，20份燕麦样品均出现扩增。

对20份0.1％燕麦平行样品进行LAMP扩增产物的检测，结果如图4B，阳性对照和20份燕麦样品扩增产物呈绿色，阴性对照扩增产物呈橙色。

上述实验表明，本发明建立的检测引物和检测体系能稳定检出0.1％燕麦样品。

3、0.05％燕麦样品的稳定性实验

对20份0.05％燕麦平行样品进行LAMP扩增。结果如图5A，20份燕麦样品均出现扩增。

对20份0.05％燕麦平行样品进行LAMP扩增产物检测，结果如图5B，阳性对照和20份燕麦样品扩增产物呈绿色，阴性对照扩增产物呈橙色。

上述实验表明，本发明建立的检测引物和检测体系能稳定检出0.05％燕麦样品。

4、0％燕麦样品的稳定性实验

对20份0％燕麦平行样品进行LAMP扩增。结果如图6A，20份燕麦样品均出现扩增。

对20份0％燕麦平行样品进行LAMP扩增产物检测，结果如图6B，阳性对照扩增产物呈绿色，20份燕麦样品和阴性对照扩增产物呈橙色。

上述实验表明，本发明建立的检测引物和检测体系具有优异的稳定性。

实施例4、LAMP实际样品检测实验

对市售的4份燕麦产品(麦片、面包、馒头)和40份未含燕麦麦成分的食品(面粉、面条、面包、馒头等面制品，肉、肉肠、罐头等肉制品，牛奶、奶粉等奶制品，蛋制品，蔬菜制品、坚果、饮料等)提取DNA，进行LAMP检测。

LAMP扩增结果如图7A，4份含燕麦成分的样品均出现扩增，其他40份未含燕麦麦成分的食品未出现扩增。

LAMP扩增产物检测结果如图7B，阳性对照和4份含燕麦成分的样品均出现扩增，阴性对照和其他40份未含燕麦麦成分的食品未出现扩增。

上述实验表明，本发明建立的检测引物和检测体系能应用于市售样品的实际检测。

结论

综上，本发明建立的燕麦成分LAMP检测方法具有物种特异性和稳定性，检测灵敏度为0.05％燕麦粉，能用于市售样品的检测。且费用成本低廉，操作简便，快速准确，能应用日常检测工作。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。