以碱性橙‑溴化十六烷基三甲基铵为探针检测DNA的方法与流程

本发明涉及DNA检测方法技术领域，尤其涉及一种以碱性橙-溴化十六烷基三甲基铵(CTMAB)为探针检测DNA的方法。

背景技术：

核酸是遗传信息的载体，是生命的最基本物质之一。核酸分析技术是分子生物学领域研究的基础，对于研制新药物和疾病治疗具有非常重要的意义，是生命科学中受到广泛关注和研究的课题。

目前，核酸分析测定的方法有很多。紫外分光光度法操作简单，被广泛使用；但由于灵敏度低﹑易受干扰，使其在应用上受到限制。荧光分析法具有较好的选择性和灵敏度，近些年应用较多；但荧光试剂价格昂贵，部分荧光试剂被证实具有致癌性。1993年，Pasternack等人第一次使用普通荧光分光光度计建立了共振光散射技术。核酸的共振光散射分析方法在普通荧光分光光度计即可实现，具有灵敏度高﹑选择性好﹑操作简便﹑应用安全﹑试剂便宜等优点。近年来，共振光散射技术在核酸分析中得到迅速发展，受到越来越广泛的关注。

碱性橙为闪绿色结晶，遇硫酸呈黄色，稀释呈橙色。熔点Mp为118-118.5℃，可溶于水，乙醇。碱性橙广泛应用于染色，其结构式为：溴化十六烷基三甲基铵(CTMAB)为一种常见的阳离子表面活性剂。

技术实现要素：

本发明提供了一种以碱性橙-CTMAB为探针检测DNA的方法。

一种以碱性橙-CTMAB为探针检测DNA的方法，包括以下步骤：

A、于10mL容量瓶中依次加入适量的碱性橙、BR缓冲液和CTMAB，然后用水定容至刻度，混匀，静置15分钟后进行测试；在200-800nm的波长范围内，在Δλ＝0nm的条件下同步扫描激发和发射单色器，狭缝宽度为5.0nm，波长扫描速度为200nm/min，得到共振光散射光谱，然后在最大共振光散射峰处(λ＝560.0nm)测量溶液的共振光散射强度；

B、于10mL容量瓶中依次加入适量的碱性橙、BR缓冲液、CTMAB和DNA，然后用水定容至刻度，混匀，静置15分钟后进行测试；在200-800nm的波长范围内，在Δλ＝0nm的条件下同步扫描激发和发射单色器，狭缝宽度为5.0nm，波长扫描速度为200nm/min，得到共振光散射光谱，然后在最大共振光散射峰处(λ＝560.0nm)测量溶液的共振光散射强度；

C、通过检测得到的DNA加入前后碱性橙-CTMAB体系的共振光散射峰强度增加值来计算DNA浓度大小。

DNA对碱性橙-CTMAB体系共振光散射峰强度的增加程度用ΔI_RLS＝I_RLS–I⁰_RLS表示，其中，I⁰_RLS和I_RLS分别代表DNA加入前后体系的共振光散射强度。ΔI_RLS值反映DNA浓度大小，ΔI_RLS值越大说明DNA浓度越高。

以下为本发明提供的检测方法的原理：对下列体系进行检测，得到共振光散射光谱。

分别配置下列体系：ctDNA，CTMAB，CTMAB-ctDNA，碱性橙，碱性橙-ctDNA，碱性橙-CTMAB，碱性橙-CTMAB-ctDNA，测定各体系的共振光散射光谱，实验结果如图1所示。(a)ctDNA；(b)CTMAB；(c)CTMAB-ctDNA；(d)碱性橙(e)碱性橙-ctDNA；(f)碱性橙-CTMAB；(g)碱性橙-CTMAB-ctDNA。

检测条件为:碱性橙,3.0×10^-4mol/L；CTMAB,1.6×10^-5mol/L；ctDNA,1.0×10^-6g/mL；pH＝7.50。

由检测结果可知：碱性橙在303nm和560nm处有两个弱的共振光散射峰。从图1(曲线a，b)可以看出，ctDNA和CTMAB的共振光散射强度很弱，在实验条件下没有共振光散射峰。从图1(曲线c)可以看出，CTMAB-ctDNA复合体系在300nm处有一个共振光散射峰，说明CTMAB与核酸发生作用，其作用力为静电引力和疏水作用力。图1(曲线d,e)说明ctDNA对碱性橙的共振光散射光谱几乎没有影响，表明ctDNA和碱性橙间的静电力和疏水作用力比较弱。从图1(曲线f)可以看出，CTMAB能明显增强碱性橙的共振光散射强度。通过静电力和疏水作用力，碱性橙溶于CTMAB胶束中而形成聚集体。图1(曲线g)说明ctDNA能使碱性橙-CTMAB复合物的共振光散射光强度明显增强，这表明以CTMAB为媒介，ctDNA能与碱性橙-CTMAB复合体系发生作用形成离子缔合物。ctDNA对碱性橙-CTMAB复合体系共振光散射峰强度的增加程度(ΔI_RLS)能反映ctDNA浓度大小。

通过进一步的检测，确定最佳实验条件。

1、确定碱性橙的最佳浓度

当碱性橙浓度低于1.6×10^-4mol/L时，随着碱性橙浓度的增大，碱性橙-CTMAB和碱性橙-CTMAB-ctDNA体系的共振光散射峰从475nm左右红移至560nm处。当碱性橙浓度大于1.6×10^-4mol/L时，随着碱性橙浓度的增加，位于560nm处的共振光散射峰位置不再发生变化。

碱性橙浓度对ΔI_RLS的影响如图2所示。随着碱性橙浓度的增加，ΔI_RLS先增强，后减弱。当碱性橙浓度为3.0×10^-4mol/L时，ΔI_RLS最强。实验条件为:CTMAB,1.6×10^-5mol/L；ctDNA,1.0×10^-6g/mL；pH＝7.50。

2、确定CTMAB的最佳浓度

CTMAB浓度对ΔI_RLS的影响如图3所示。同样，随着CTMAB浓度的增加，ΔI_RLS先增强后减弱。当CTMAB浓度为1.6×10^-5mol/L时，体系ΔI_RLS达最大值。实验条件为：碱性橙,3.0×10^-4mol/L；ctDNA,1.0×10^-6g/mL；pH＝7.50。

3、确定最佳pH值

通过改变BR缓冲液的pH值，我们考察了pH对△I_RLS的影响，结果如图4所示。在4.10-10.20pH范围内，随着pH增大，△I_RLS逐渐增强，在pH为中性7.00时达到最大值并保持稳定。在考察范围内，pH值7.50最接近中性pH，为最佳pH值。实验条件为：碱性橙,3.0×10^-4mol/L；CTMAB,1.6×10^-5mol/L；ctDNA,1.0×10^-6g/mL。

4、确定最佳孵育时间

体系的稳定性和孵育时间对一种分析方法的推广应用具有重要意义。实验表明，当体系各成分混合后，△I_RLS在15min达到最大(最佳孵育时间)，并能在90分钟内保持稳定，稳定性良好。

5、工作曲线和检测限

在最佳实验条件下(碱性橙浓度为3.0×10^-4mol/L，CTMAB浓度为1.6×10^-5mol/L，pH为7.50，稳定时间15min)，绘制ctDNA的工作曲线，得到如下分析参数：线性范围：2.5×10^-8～5×10^-7g/mL(相关性系数＝0.989),5×10^-7～3×10^-5g/mL(相关性系数＝0.991)，检测限：8.5ng/mL(S/N＝3)。可见，该方法线性范围宽且有较高的灵敏度。

本方案的有益之处在于：本发明以碱性橙-溴化十六烷基三甲基铵(CTMAB)为探针，建立了测定DNA的灵敏的共振光散射方法。测试在普通的荧光分光光度计上选择合适的激发和发射狭缝宽度，采用相等的激发和发射波长同时扫描激发和发射单色器(Δλ＝0nm)即可得到。本发明以DNA加入前后碱性橙-CTMAB体系共振光散射强度出现的灵敏信号(共振光散射峰强度增加值，ΔI_RLS)为检测信号，建立其与DNA浓度之间的关系。本研究方法具有操作简单﹑测定灵敏度高等特点，检测限可达纳克级，为生化和临床分析提供了一条新的途径，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1：共振光散射光谱图。

图2：碱性橙浓度对ΔI_RLS的影响图。

图3：CTMAB浓度对ΔI_RLS的影响图。

图4：pH对ΔI_RLS的影响图。

具体实施方式

实施例

一种以碱性橙-CTMAB为探针检测DNA的方法，包括以下步骤：

A、于10mL容量瓶中依次加入适量的碱性橙、BR缓冲液和CTMAB，然后用水定容至刻度，混匀，静置15分钟后进行测试；在200-800nm的波长范围内，在Δλ＝0nm的条件下同步扫描激发和发射单色器，狭缝宽度为5.0nm，波长扫描速度为200nm/min，得到共振光散射光谱，然后在最大共振光散射峰处(λ＝560.0nm)测量溶液的共振光散射强度；

B、于10mL容量瓶中依次加入适量的碱性橙、BR缓冲液、CTMAB和DNA，然后用水定容至刻度，混匀，静置15分钟后进行测试；在200-800nm的波长范围内，在Δλ＝0nm的条件下同步扫描激发和发射单色器，狭缝宽度为5.0nm，波长扫描速度为200nm/min，得到共振光散射光谱，然后在最大共振光散射峰处(λ＝560.0nm)测量溶液的共振光散射强度；

C、通过检测得到的DNA加入前后碱性橙-CTMAB体系的共振光散射峰强度增加值来计算DNA浓度大小。

DNA对碱性橙-CTMAB体系共振光散射峰强度的增加程度用ΔI_RLS＝I_RLS–I⁰_RLS表示，其中，I⁰_RLS和I_RLS分别代表DNA加入前后体系的共振光散射强度。ΔI_RLS值反映DNA浓度大小，ΔI_RLS值越大说明DNA浓度越高。

利用标准加入法测定了合成样品中核酸的含量，实验结果见表1。从表中结果可见，该方法对合成样品中核酸含量的测定结果令人满意。

表1合成样品中核酸的测定

实验条件:BSA:1.0×10^-6g/mL；Mg²⁺:1.0×10^-6mol/L；K⁺:6.0×10^-6mol/L；Na⁺:1.0×10^-5mol/L；pH＝7.50

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。