miR‑192作为糖尿病肾病早期诊断特异性生物标志物及其应用的制作方法

本发明涉及miR-192作为特异性生物标志物在糖尿病肾病早期诊断中的应用。

技术背景

糖尿病肾脏疾病(diabetic kidney disease，DKD)即糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)，是糖尿病(diabetes mellitus，DM)患者常见的一种微血管并发症。其造成的肾脏损害不仅累及血管、肾小球、肾小管，也累及了肾间质部分及足细胞等几乎所有的肾脏结构。

目前DKD诊断的主要标准为测定24小时尿蛋白定量或者过夜时段尿微量白蛋白排泄率，然而临床上一旦检测到微量白蛋白尿时，肾脏实质性损害已存在，肾小球功能将呈进行性不可逆转的下降；并且临床上一部分尿白蛋白处于正常范围内的DM患者其实已经出现了肾小球滤过率的下降，肾脏病理也会发现DKD相关的特征性改变；临床上现有的治疗只能够减慢DKD向肾功能衰竭的进程，远远无法逆转其病程。因此，24小时尿微量白蛋白(24h urine microalbumin，24hUMA)对于DKD患者并非最优选择。目前迫切需要探寻到对于DKD早期诊断有特异性的生物标志物，这对DKD进行早期的风险评估以及对病情进展的检测、预后的判断有重大意义。

miRNAs是一类长度约为22个核苷酸的单链内源性非编码小分子RNA，主要在转录后水平对基因的表达起抑制作用。随着其在肿瘤学界研究的深入，研究者们也逐渐将领域扩展至多学科、多方向，越来越多的研究发现并证明了miRNAs参与了糖尿病及其并发症，尤其是微血管并发症DKD的病理生理过程中。当然目前主要的研究趋势集中于miRNAs在肾脏组织的表达，不仅在DKD，更有一些非糖尿病肾病的肾病患者体内也发现了其表达的变化。通过对基因表达的调控，miRNAs在自然免疫应答及大量的细胞生物活动中如细胞周期、生长、增殖分化、凋亡中有着关键性的作用。此外，其在肾脏的稳态中也同样至关重要。在肾脏中已发现了大量的在其他器官中不表达或微弱表达的特异性miRNAs。有研究发现miR-192、miR-204、miR-215及miR-216等在肾脏中明显高表达。这些miRNAs表达的失控使得它们在作为肾脏疾病的理解、诊断以及治疗辅助上成为可贵的辅助工具。

miRNA的表达检测技术近年来发展迅速，不仅仅有传统的表达文库克隆、Northern blot和实时荧光定量PCR(quantitativev real-time PCR，qRT-PCR)，还包括了新时代的克隆、基因芯片技术、测序法等等。研究者们最常用也是目前较为有效的便是RT-PCR，RT-PCR指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积聚从而实时监测整个PCR的进程，反应结束后通过标准曲线对位置模板进行定量分析的方法。这种方法便捷且相对准确，因此使得miRNA作为疾病的特异性生物标志物成为一种可能，且具有实际临床意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供血清中miR-192在糖尿病肾病的早期特异性临床诊断的应用。

本发明的第二个目的是提供一种尿液中miR-192在糖尿病肾病的早期特异性临床诊断的应用。

本发明的第三个目的是提供miRNA-192在诊断早期糖尿病肾病中的临界点。

本发明的第四个目的是提供联合血清和尿液中miRNA-192在早期糖尿病肾病特异性临床诊断的应用。

本发明的第五个目的是提供miR-192标志物的用途。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

一种血清中miR-192对于糖尿病肾病的早期特异性临床诊断的应用。

使用qRT-PCR来检测血清中miRNA-192以诊断糖尿病肾病。

一种尿液中miR-192对于糖尿病肾病的早期特异性临床诊断的应用。

使用qRT-PCR来检测尿液中miRNA-192以诊断糖尿病肾病。

提供miRNA-192诊断早期糖尿病肾病中的临界点。

一种联合血清和尿液中miRNA-192对于糖尿病肾病的早期特异性临床诊断的应用。

如上所述的miRNA标志物的用途，用于制备检测糖尿病肾病早期诊断试剂或试剂盒。

所述诊断试剂或试剂盒包括：对miR-192具有检测特异性的探针、基因芯片，或PCR引物。

本研究在临床上实验证明个体血清及尿miR-192的变化对于DKD的诊断均有较高的灵敏度及特异性。本研究同时找出miRNA-192在诊断早期DKD中的临界点。证明了血尿联合检测miR-192的综合准确率较高并显著降低了误诊率。本发明将为临床诊断糖尿病肾病提供一种新的诊断手段，在辅助DKD的治疗以及病程监测上有一定的潜在临床价值。

附图说明

图1为miR-192在不同分组研究对象血清中表达变化。

图2为各组血清miR-192作为糖尿病肾病诊断标准的ROC曲线。

图3为24hUMA及miR-192分别及联合作为肾功能损伤诊断标志物的ROC曲线。

图4为尿液中miR-192的相对表达量变化。

图5为尿沉渣中miR-192表达变化与血清中其变化之间的散点图。

图6为尿液miR-192作为检验变量对DKD及早期DKD的诊断。

图7为尿miR-192与24hUMA诊断轻度肾功能损伤对比。

具体实施方案

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

我们通过随机选取230名2型糖尿病住院患者，分组为单纯DM组(n＝92，确诊的T2DM患者，不合并任一糖尿病并发症)，早期DKD组(n＝87，mogensen分期II期)，临床DKD组(n＝51，mogensen分期III期)，设健康对照组(n＝53)，留取血清及晨尿，利用qRT-PCR分别检测各标本miR-192的表达变化，分析其相对表达量与临床指标关系，验证miR192是否可以作为DKD早期诊断的特异性生物标志物。分析同一个体血清及尿液miRNA相关性以及其诊断的特异性和灵敏度，比较其与24hUMA在诊断肾功能损伤时的灵敏度以及特异性，比较单项检测以及血尿联合检测肾功能损伤的诊断性能。探测其作为检测和预后的参考价值。

我们的结果显示血清及尿中miR-192在DKD的进程中有着显著的变化趋势，血清及尿液miR-192均可以作为糖尿病肾病早期诊断的特异性生物标志物，且对于肾功能损伤的诊断优于24hUMA，尿液miR-192单项检测可降低漏诊率，血尿联合检测可降低误诊率。

实施例1不同分期糖尿病肾病患者血清中microRNA192的表达与临床意义

材料与方法

1试剂

1.1病例来源

所有试验组对象均来自于2015年7月至2016年3月在天津医科大学代谢病医院就诊的确诊T2DM住院患者，共计230例；健康对照组对象来自于天津医科大学总医院空港医院健康查体中心。单纯糖尿病92例，早期肾病87例，临床肾病51例，健康对照者53例。

1.2实验材料

Trizol LS Reagent，氯仿(CHCl3)，焦炭酸二乙酯(DEPC)，无水乙醇，异丙醇(分析纯)，Mir-X miRNA First-stand Synthesis Kit，Mir-X miRNA qRT-PCR SYBR kit，无RNA酶水(将DEPC原液用双蒸水按照1:1000的比例进行稀释，振摇混匀后于37℃下过夜，后高温高压密封备用)，75％乙醇(无水乙醇：无RNA酶水按照3:1的比例混合配制而成)。

引物设计

miRNA192序列为：5’-CUGACCUAUGAAUUGACAGCC-3’

2方法

2.1患者资料的收集

一般情况：年龄、性别、身高、体重、体重指数(body mass index，BMI)、腰围、臀围、腰臀比(waist-hip ratio,WHR)、糖尿病病程、收缩压(systolic blood pressure,SBP)、舒张压(diastolic blood pressure,DBP)；

身高：用固定在垂直墙面的测定仪测量身高，并精确到0.1cm；

体重：在经校准的磅秤上测量，受试者着室内单衣赤脚测量，并精确到0.5kg；

计算BMI：24-27.9kg/m2为超重，≥28为肥胖；

WHR：在呼气末用非弹性的尺子于水平位在最后一根肋骨和髂嵴之间量取腰围，并精确到0.1cm，皮尺水平放在前耻骨联合和背后臀大肌最凸处取臀围，并精确到0.1cm，男性腰围≥85cm，女性≥80cm定义为中心性肥胖；

血压：受试者于安静的环境休息5分钟，未吸烟饮酒或引用咖啡，使用统一校准的血压计，测坐位右侧血压，两次取平均值，对两次结果波动较大者测三次，取平均值。

2.2临床指标检测

OGTT胰岛素C肽释放实验：受试者于采集完空腹血后，5分钟内口服75g葡萄糖的250-300ml糖水，于服糖第一口开始计时，于30min，60min，2h，3h分别检测血糖、胰岛素、C肽值。

肾功能：谷氨酸脱氢酶法测定血尿素氮，酶法测定肌酐；

肝功能：紫外-苹果酸脱氢酶法测定谷草转氨酶，紫外-乳酸脱氢酶法测定谷丙转氨酶；

糖化血红蛋白：采用高效液相色谱层析法；

血脂：采用氧化酶法测定总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-c)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-c)；

尿白蛋白肌酐比值(urine albumin-cretinine ratio,ACR):免疫比浊法测尿微量白蛋白，肌酐酶法检测尿肌酐，并计算二者比值；

公式计算：HOMA-IS＝1/空腹血糖*空腹胰岛素；HOMA-IR＝空腹血糖*空腹胰岛素/22.5；HOMA-β＝20*空腹胰岛素/(空腹血糖-3.5)％。

2.3血清收集

微量白蛋白尿(早期DKD)组、大量白蛋白尿(临床DKD)、单纯糖尿病组、健康对照组空腹全血各3ml。

血清的制备：

a抽取每一位实验对象3ml外周静脉血入分离胶+促凝剂真空采血管，常温或于37℃水浴箱中静置30-60min；

b室温或者4℃下离心1500g，持续5-10min，离心完毕后分三层，上层淡黄色清亮血清层，中间分离胶层，最底层为暗红色血细胞层；移至超净台进一步操作，从而避免唾液、外界酶等污染标本。

c将取出的血清转移至无酶的Eppendoff管中，12000g离心5分钟，进一步弃去残留的细胞或细胞碎片，离心温度为4℃；移至新的无酶1.5ml冻存管中-80℃保存备用。

2.4血清中提取RNA

a取出-80℃冻存样本置冰上融化，吸取200ul加入到600ulTrizol中，于振荡器上充分混匀，所得到的匀浆于室温(15-30℃)静置10min，使核酸蛋白复合物充分分离；

b加入1/5体积的氯仿，即120ul氯仿，剧烈漩涡混匀15sec，并于室温下静置10min；

c将离心机调制4℃，12000g离心15min，可见样品分三层：上层为无色水相(RNA溶解于其中)，中间层为红色层(DNA溶解于其中)，下层则为有机层(为蛋白质等有机物质)(离心结束后取样时不可晃动或颠倒管子，防止离心后三层再次混合)；

d用200ul移液器吸取上层水相(注意避免吸取中间层)移入新的1.5ml无酶eppendoff管中，并加入等体积的异丙醇，充分混匀后，室温下静置25min。

e静置结束后于4℃，12000g离心10min，弃去上清。

f加入事先配好的75％乙醇600ul，4℃，7500g离心5min。弃去上清，室温晾干约5min，加入20ulRNAase-free ddH2O，轻轻吹打混匀，充分溶解RNA。

2.5RNA浓度和纯度检测

取提取的RNA 1ul，打开紫外分光光度计，获取在260nm和280nm波长下的吸光度，计算二者比值，若260/280OD值处于1.8-2.1范围，则RNA浓度大约在25-50ng/ul，则可以进行下一步实验。

2.6cDNA的合成及实时荧光PCR

采用Mir-X miRNA First-Strand Synthesis and SYBR qRT-PCR kit进行血清的miRNART-qPCR检测：

a逆转录：逆转录体系10ul,所有操作均在冰上进行

取一0.2mlRNAase-free离心管，加入以下试剂

b逆转录程序

37℃ 60min

85℃ 5min

4℃ 60min

c将逆转录的cDNA放入-80℃存放或加入RNAase-free H2O稀释至100ul进行下一步；

d PCR反应体系25ul

样本反应

②内参反应

e将上述体系加入八联管中，按下一个程序进行PCR扩增，RT-PCR程序

变性：95℃ 10sec

qPCRx40循环：95℃ 5sec

54℃ 20sec

溶解曲线：95℃ 60sec

55℃ 30sec

95℃ 30sec

每个样本设定三个副孔，分别记录内参及样本反应的Cq值。

2.7数据统计学分析

根据实验对象的临床资料整理，所有的分类变量进行数量化赋值，并且当变量中频数过少时，可以适当据实际情况将选项进行合并(表1)；各组miRNA的相对表达量呈偏态分布，方差不齐，因此以△Ct来衡量，进行2-△△Ct转换，经K-S检验、levene检验，数据均呈正态分布且具有方差齐性。进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)用于比较miRNA在大量蛋白尿组，微量白蛋白尿组，单纯糖尿病组及正常对照组之间的表达差异。利用多元线性逐步回归的统计学方法找出影响实验指标的独立因素，miRNAs与临床指标或者是临床特征之间的联系在排除了相关因素干扰后选用Pearson相关分析计量资料，spearman相关分析计数资料，并绘制受试者工作曲线(Received Operating Characteristic Curve，ROC)，采用二元logistics回归构建联合模型。检测方法的分析采用配对Х2检验。所有的数据均采用SPSS21.0和GraphPad Prism5软件进行数据分析以及图像处理，所有统计检验均为双侧概率检验，P<0.05为具有统计学差异，P<0.01为差异具有显著统计学意义。计量资料以均数±标准差或中位数表示，计数资料以百分率表示。

表1分类变量量化赋值表

2.8结果

2.8.1各组一般临床资料的比较

四组研究对象间年龄、性别分布、BMI、SBP、UA、HDL-c、LDL-c等指标间差异均无统计学意义(P>0.05)；随着DKD的进展，病程、UMA、BUN、sCR、FIns、HOMA-IS、HOMA-IR呈梯度增高趋势(P<0.05)；而HOMA-β呈逐渐下降趋势；WHR、FBG、HbA1C、TG、ACR在研究组3组中相对于正常对照组均增高，但在临床DKD组以及早期DKD组之间差异并无统计学意义(P>0.05)；TC在DM组及早期DKD组中升高明显，而相较于临床DKD组患者，并无差异(见表2)。

表2各组间一般临床资料检查结果比较(x±s)

(注：^＊p<0.05，^＊＊p<0.01，VS健康对照组；^△p<0.05，^△△p<0.01，VS DM组；^#p<0.05，^##p<0.01，VS早期DKD组。)

2.8.2各组miR-192表达水平比较

与健康对照组相比较，血清miR-192的表达水平在临床DKD组、早期DKD组、DM组中均下降，且临床DKD组相较于早期DKD组及DM组下降尤为明显，以及早期DKD组较DM组表达的降低，均具统计学意义(均p<0.05)(结果见表3，图1)。

表3血清miR-192的检测结果(x±s)

(注：p^＊<0.05，vs健康对照组；p^△<0.05，vs DM组；p^#<0.05，vs早期DKD组。)

2.8.3miR-192与临床指标的相关性分析

利用Pearson及Spearman相关分析得到，miR-192的表达水平与DKD组患者年龄、性别、吸烟、BMI、TC、HDL-c、LDL-c、HOMA-IS无相关关系；与HOMA-IS呈正相关(r＝0.264,p<0.01)；与饮酒、病程、WHR、HbA1C、SBP、TG、Fins、HOMA-IR、HOMA-β呈负相关(r＝-0.045，-0.364，-0.118，-0.249，-0.390，-0.376，-0.155，-0.404，-0.233，-0.360，均p<0.01)。在肾功能评估相关指标中，miR-192与sCR、BUN、ACR及UMA均呈负相关(r＝-0.163，-0.159，-0.242，-0.233，均p<0.05)。(结果见表4)

表4 miR-192与一般资料及糖、脂代谢的偏相关分析

(注：#Spearman相关性分析，其他指标采用Pearson相关分析；ACR＝尿蛋白/尿肌酐(ug/mg)*P<0.05，**P<0.01。)

2.8.4多元线性逐步回归分析探讨影响DKD患者miR-192的相关因素

以miR-192作为因变量，并且将体内与其相关因素：病程、WHR、SBP、TG、FIns、HbA1C、HOMA-IR、sCR、BUN、ACR及UMA作为自变量作多元逐步回归分析，经分析SBP、FIns最后进入方程(r²＝0.152,0.282,P<0.01),是影响miR-192在体内表达量的独立危险因素。(见表5)

表5多元线性逐步回归分析miR-192的相关因素

(注：因变量：miR-192)

2.8.5血清miR-192对于早期糖尿病肾病患者的诊断价值

在临床工作中，患者的实际情况远远比理论上复杂，即便是24hUMA正常的患者仍然无法排除DKD的可能，并且糖尿病前期患者也有发生DKD的概率，而从众多DKD或非DKD中挑选出DKD早期的患者更加困难。因此，亟待一种更有效更灵敏的检测手段。本研究该部分则将四组研究对象重新分组为A组：T2DM组+健康对照组，B组：DKD+非DKD组，C组：临床DKD组+非临床DKD组，D组：早期DKD组+无DKD组，E组：临床DKD组+早期DKD组。通过这五种组合模拟实际工作中的临床环境，建立Logistics回归模型后进行ROC曲线的拟合。

纵坐标为敏感性，而横坐标为假阳性率(1-特异性)，分别绘制miR-192的ROC曲线，通过ROC曲线下面积(ROC-AUC)大小判断血清miR-192的诊断效果，其面积一般在0.5-1.0之间。AUC≤0.7时表明诊断价值较低；0.7<AUC≤0.9时则诊断价值中等，当AUC>0.9时则诊断价值较高。并根据约登指数找出miR-192达到灵敏度及特异性最高的截断点。根据建立的logistics回归模型计算血清miR-192诊断DKD时的AUC，在A组从所有研究人群中为诊断出T2DM的AUC-ROC为0.939(95％CI：0.886-0.993)；B组从研究对象中诊断出DKD的AUC-ROC为0.765(95％CI：0.695-0.836)；C组，从人群中发现临床DKD患者的AUC-ROC为：0.784(95％CI：0.701-0.867)；当去除临床DKD患者，在人群中筛选早期DKD的D组AUC-ROC结果显示：0.716(95％CI：0.627-0.804)，并且在临床DKD及早期DKD鉴别出两者的E组ROC曲线结果显示为0.661(95％CI：0.539-0.783)。(见图2，表6)

表6血清miR-192对不同组别中糖尿病肾病的诊断效能(％)

(注：YI：约登指数(Youden index)＝灵敏度+特异度-1。)

2.8.6miR-192在肾功能受损不同程度的表达变化

将研究对象按eGFR分组，即肾不显损伤组(eGFR>90ml/min/1.73m²)-A组、肾功能轻度受损组(60ml/min/1.73m²<eGFR≤90ml/min/1.73m²)-B组、肾功能中度受损组(eGFR<60ml/min/1.73m²)-C组。发现血清miR-192的检测量随着eGFR的下降而显著降低，呈显著正相关关系(r＝0.423,p<0.01)，而24hUMA与GFR的相关性结果分析显示其呈负相关关系(r＝-0.406,p<0.01)。(见表7)

表7 24小时尿蛋白及血清miR-192在肾功能损伤不同组别中的比较

(注：aP<0.01，vs A组；bP<0.01，vs B组。)

以eGFR<90ml/min/1.73m²作为肾功能损伤的诊断标准，纵坐标为敏感性，而横坐标为1-特异性,分别建立二者对于肾功能损伤诊断的ROC曲线，结果表明miR-192和24hUMA的ROC曲线下面积(AUC)分别为0.780(95％CI：0.712-0.847)和0.730(95％CI：0.651-0.809)，miR-192的诊断价值高于24hUMA，并且当分别作为肾功能轻度受损检验指标时，miR-192的敏感性为55.8％、特异性为88.7％，而24hUMA的敏感性与特异性分别为64.5％及77.9％，miR-192的准确性要高于24hUMA，证明其在对于肾功能损伤的诊断中价值高于24hUMA。为增加指标的诊断准确性，我们采用二元logistic回归模型来评估两者联合诊断肾功能受损的能力，结果显示AUC得到面积为0.804(95％CI：0.739-0.870)。诊断效能高于二者单独作为诊断指标。(见图3)

实施例2不同时期糖尿病肾病患者尿液中miRNA-192表达情况及其在同一个体与血液中表达相关性

1试剂

1.1病例来源

所有试验组对象均来自于2015年7月至2016年3月在天津医科大学代谢病医院就诊的确诊T2DM住院患者共计230例；健康对照组对象来自于天津医科大学总医院空港医院健康查体中心。

观察组、对照组的分组同第一部分。

1.2实验材料

miRcute miRNA isolution kit，miRcute miRNA first-stand cDKDA synthesis kit，miRcute miRNA qPCR detection kit(SYBR Green)

其余试剂及仪器设备、引物设计均同实施例1。

2方法

2.1患者资料的收集

一般情况：性别、年龄、身高、体重、BMI、腰围、臀围、WHR、糖尿病病程、SBP、DBP；临床指标的检测同实施例1。

2.2患者尿液及血液收集

取临床DKD组、早期DKD组、DM组、健康对照组空腹晨起第一次尿液中段尿30ml(空腹为至少8小时以上未任何有热量我的食物或饮料)。

尿沉渣的获取：

a取实验对象30ml晨起第一次中段尿于50ml离心管中；

b室温或者4℃下3000g，离心5-10min，弃去上清；

c 4℃12000离心5min，弃上清，获得尿沉渣。

血清的制备：

a抽取每一位实验对象3ml外周静脉血入分离胶+促凝剂真空采血管，常温或于37℃水浴箱中静置30-60min；

b室温或者4℃下离心1500g，持续5-10min，离心完毕后分三层，上层淡黄色清亮血清层，中间分离胶层，最底层为暗红色血细胞层；移至超净台进一步操作，从而避免唾液、外界酶等污染标本。

c将取出的血清转移至无酶的Eppendoff管中，12000g离心5分钟，进一步弃去残留的细胞或细胞碎片，离心温度为4℃；移至新的无酶1.5ml冻存管中-80℃保存备用。

2.3尿沉渣中提取总RNA

a尿沉渣中加入1ml裂解液MZ，振荡器震荡或移液器吹打几次混匀；

b将匀浆样品室温下放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离；

c 4℃，12000rpm(约13400g)离心5min，样品分三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要存在于水相中，体积约为所用裂解液MZ试剂的50％；

d取上层水相(注意避免吸取中间层)移入另一干净的1.5ml无酶EP管中，缓慢加入转移液体积1.5倍的无水乙醇，充分混匀(此时可能出现沉淀)，将得到的溶液以及沉淀一起转入吸附柱miRspin中，室温12000rpm(13400g)离心30sec，弃去废液；

e向吸附柱miRspin中加入500ul去蛋白液MRD(使用前确保已加入试剂说明量的无水乙醇)，室温放置2min，室温12000rpm(13400g)离心30sec，弃废液；

f向吸附柱miRspin中加入500ul漂洗液(使用前确保已加入试剂说明量的无水乙醇)，室温静置2min，室温12000rpm(13400g)离心30sec，弃废液；

g重复操作f；

h将吸附柱miRspin放入2ml收集管中，室温12000rpm(13400g)离心1min去除残余液体；

i将吸附柱miRspin转入一个新的RNase-free 1.5ml的EP管中，加入30-100ul RNase-free ddH₂O，室温放置2min，室温12000rpm(13400g)离心2min。

2.4RNA浓度和纯度检测

同实施例1。

2.5cDNA的合成及实时荧光PCR

a miRNA3’末端进行加poly(A)处理

a)在冰上预冷RNase Free的反应管内加入以下试剂至总体积20ul(最后加入E.coli Poly(A)Polymerase)；

b)移液器轻轻混匀上述配制的反应，短暂离心后在37℃反应60min。所得到反应液可以直接进行下游实验，也可以放置-20℃短暂保存；

b Poly(A)修饰的miRNA进行逆转录反应

a)按照下表组分进行反应液的配制：

b)移液器轻轻混匀上述配制的反应液，短暂离心后在37℃反应60min，合成的cDNA反应液可放置-20℃保存，也可以直接进行下游荧光定量检测；

c室温融化2X miRcute miRNA Premix和Reverse Primer；

d将2X miRcute miRNA Premix上下颠倒轻轻混匀，避免起泡，并轻轻微离心后使用；

e将试剂置于冰上，按照下表配制反应体系：

f将上述体系加入八联管中，按下一个程序进行PCR扩增，RT-PCR程序

变性：94℃ 2min

qPCRx40循环：94℃ 20sec

54℃ 34sec

溶解曲线：95℃ 60sec

55℃ 30sec

95℃ 30sec

每个反应重复三次，使用固定的阈值记录反应的Cq值。

2.6数据统计学分析

One-Way ANOVA用于比较miRNA在NC组、DM组、早期DKD组及临床DKD组之间的表达差异。Pearson相关分析计量资料，spearman相关分析计数资料，利用多元线性逐步回归统计学方法找出影响实验指标的独立因素，绘制ROC曲线比较各指标的诊断准确性，配对Χ²检验分析技术资料。所有的数据均采用SPSS21.0和GraphPad Prism5软件进行数据分析以及图像处理，所有统计检验均为双侧概率检验，P<0.05为具有统计学差异，P<0.01为差异具有显著统计学意义。计量资料以均数±标准差或中位数表示，计数资料以百分率表示。

2.7结果

2.7.1糖尿病肾病进展中尿miR-192的表达变化分析

随着DKD的进展，miR-192的表达变化在糖尿病及临床DKD组(均值＝15.13±1.17)明显高于正常对照组(均值＝1.21±0.15)，而随着尿蛋白的逐渐增多，miR-192的检测表达呈明显上升趋势，且具有显著统计学意义。(见表8，图4)

表8尿液miR-192的表达变化

(注：^*p<0.05，vs健康对照组；^△p<0.05，vsDM组；^#p<0.05，vs早期DKD组)

2.7.2尿沉渣中miR-192表达变化量的相关性分析

以性别、年龄作为协变量，对其进行偏相关分析得到，尿miR-192的含量变化与病程、糖代谢指标如HbA1C、胰岛素作用指标如HOMA-IR呈显著正相关(r＝0.552,0.287,0.326,均p<0.05)，并且其与血液中miR-192的表达变化呈负相关(r＝-0.-0.512,p<0.01)。(见图5，表9)

表9尿miR-192与一般临床指标相关性

2.7.3尿miR-192作为糖尿病肾病早期诊断指标

以尿液中miR-192的含量作为检测指标时，将入选研究对象分为A组：正常对照及T2DM组；B组：DKD及非DKD组；C组：临床DKD组及非临床DKD组；D组：早期肾病及非DKD组，E组：临床DKD及早期DKD组。在诊断正常对照及糖尿病患者得到AUC-ROC为0.982(95％CI：0.962-1.000)，而在区分出现蛋白尿的糖尿病患者及无蛋白尿人群时AUC-ROC为：0.884(95％CI：0.812-0.956)，其灵敏度与特异性分别为90.6％及77.3％，截点取其变化倍数5.5147；在大量蛋白尿组糖尿病患者时其AUC为0.812(95％CI：0.729-0.894)，取9.3778作为诊断截点时，其灵敏度及特异度分别为96.2％和59.8％，在糖尿病患者及正常人群中筛选出微量白蛋白尿患者的AUC-ROC为0.862(95％CI：0.779-0.944)，当取临界值4.1065时，约登指数最大为65.6％，灵敏度与特异性分别为97.4％及68.2％。(见图6，表10)

表10尿液miR-192对不同组别中糖尿病肾病的诊断效能(％)

2.7.4尿miR-192与24hUMA分别作为肾功能损伤诊断指标的效能对比

将研究对象按eGFR分组，即肾不显损伤组(eGFR>90ml/min/1.73m²)、肾功能轻度受损组(60ml/min/1.73m²<eGFR≤90ml/min/1.73m²)、肾功能中度受损组(eGFR<60ml/min/1.73m²)。发现尿液miR-192的检测量随着eGFR的下降而显著升高，呈显著负相关关系(r＝-0.637,p<0.01)，24hUMA与GFR的相关性结果分析显示其呈负相关关系(r＝-0.537,p<0.01)(见表11)。

表11 24hUMA及尿miR-192在肾功能损伤不同组别中的比较

以eGFR<90ml/min/1.73m²作为肾功能损伤的诊断标准，纵坐标为敏感性，而横坐标为1-特异性,分别建立二者对于肾功能损伤诊断的ROC曲线，结果表明miR-192和24hUMA的ROC曲线下面积(AUC)分别为0.841(95％CI：0.768-0.914)和0.800(95％CI：0.713-0.887)，尿miR-192的诊断效能高于24hUMA。(见图7)

2.7.5smiR-192、umiR-192单项检测及联合检测肾功能损伤的诊断性能比较

单项检测肾功能损伤时，umiR-192敏感性较高，smiR-192特异性较高，综合两者诊断性能比较，umiR-192敏感性为97.4％，特异性为49.3％，阳性预测值为52.1％，阴性预测值为97.1％，是最佳的肾功能损伤单项诊断指标。而同时联合检测该两项指标时，可以大大提高特异性81.2％，从而减小假阳性率，提高其阳性预测值66.7％以及阴性预测值81.2％，但敏感度有所下降66.7％。各项指标趋于平衡。(见表12)

表12 smiR-192及umiR-192单项及联合检测对肾功能损伤的诊断性能评估(％)

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。