检测BCR‑FGFR1融合基因的寡核苷酸、方法和试剂盒与流程

本发明提供检测样本中bcr-fgfr1融合基因的寡核苷酸、方法和试剂盒，采用探针taqman实时荧光定量pcr技术，用于检测人类8p11骨髓增殖综合征(ems)患者体内bcr-fgfr1融合基因表达水平，同时对高危人群进行较为准确的筛查。该试剂盒可有效的节约检测时间，提高检测精度。
背景技术：
：染色体易位，形成融合基因，进而导致酪氨酸激酶的组成型表达在血液恶性肿瘤，尤其是骨髓增生综合征的疾病的发生发展中起到非常重要的作用。纤维母细胞生长因子受体1(fgfr1)基因定位于染色体的8p11，其编码的fgfr1蛋白是受体酪氨酸激酶家族成员之一。fgfr1蛋白拥有胞外受体结合域、跨膜区和胞内酪氨酸激酶催化域，在非激活状态时以单体形式存在。其在染色体易位时也会受到同样的激活，进而导致疾病的发生。8p11骨髓增殖综合征(ems)是一种的伴fgfrl基因重排的非常罕见的侵袭性血液肿瘤，其主要生物学特征为：染色体涉及8p11异常，常伴嗜酸细胞增多，淋巴结肿大并伴有淋巴母细胞淋巴瘤，短期内迅速进展为急性血液病。目前已报道fgfr1的伙伴基因有14种，而bcr-fgfr1融合基因相对罕见，该融合基因将导致bcr基因第4号外显子和fgfr1基因的第9号外显子相连接。2004年，roumiantsev等以小鼠模型证实bcr-fgfr1蛋白很可能通过bcr的177位酪氨酸和grb蛋白结合，参与bcr-abl信号通路传导，导致小鼠产生cml样的白血病。在疾病发生的早期使用针对性的靶向药物对此类疾病的治疗来说十分重要，大多数cml新诊患者的可通过口服伊马替尼出现完全细胞遗传学缓解，但是由于对这类疾病缺乏足够认识，许多患者丧失最佳治疗时机。故融合基因bcr-fgfr1的检测的开展有利于疾病的早期诊断和治疗。技术实现要素：本发明设计了检测内参/目的基因用引物、探针序列，采用荧光定量pcr技术，利用双标准曲线的方法，分别构建内参基因abl和目的基因bcr-fgfr1的定量标准曲线，检测bcr-fgfr1的相对于内参基因的表达水平。试剂盒通过调整两个基因的引物探针比例，以及pcr反应条件，使扩增效率和速率均达到最佳。本发明中的“bcr-fgfr1cdna序列”指的是bcr-fgfr1融合基因经转录后产生的mrna经逆转录后产生的cdna序列，或者根据这种cdna序列通过化学合成手段直接合成出。不论是经过逆转录还是通过化学合成手段直接产生的cdna序列插入到合适的质粒后，可作为阳性对照品进行使用。本发明提供了用于检测样本中bcr-fgfr1融合基因的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括检测bcr-fgfr1融合基因的上游引物bcr-fgfr1-f、下游引物bcr-fgfr1-r和探针bcr-fgfr1-probe，其碱基序列为：bcr-fgfr1-f:gaagcctttgaaagccgc；bcr-fgfr1-r:gagtcccactggaggagagc；bcr-fgfr1-probe:fam-tgatggccgaaccagaagaaccc-tamra。进一步地，bcr-fgfr1-f：bcr-fgfr1-r：bcr-fgfr1-probe的摩尔比为2:2:1。进一步地，所述寡核苷酸还包括检测abl内参基因的上游引物abl-f、下游引物abl-r和探针abl-probe，其碱基序列为：abl-f:gatacgaagggagggtgtacca；abl-r:ctcggccagggtgttgaa；abl-probe:fam-gcttctgatggcaagctctacgtctcct–tamra。进一步地，abl-f：abl-r：abl-probe的摩尔比为2:2:1。本发明还提供一种检测样本中bcr-fgfr1融合基因的方法，其步骤如下所示：(1)提取样本中的rna；(2)将(1)提取出的rna逆转录为cdna；(3)加入(2)中所述的cdna到反应管中，利用检测bcr-fgfr1融合基因的上游引物bcr-fgfr1-f、下游引物bcr-fgfr1-r和探针bcr-fgfr1-probe检测样本中的bcr-fgfr1融合基因荧光信号；利用检测abl内参基因的上游引物abl-f、下游引物abl-r和探针abl-probe检测样本中的abl内参基因荧光信号，其中bcr-fgfr1-f:gaagcctttgaaagccgc；bcr-fgfr1-r:gagtcccactggaggagagc；bcr-fgfr1-probe:fam-tgatggccgaaccagaagaaccc-tamra；abl-f:gatacgaagggagggtgtacca；abl-r:ctcggccagggtgttgaa；abl-probe:fam-gcttctgatggcaagctctacgtctcct–tamra。(4)根据(3)中的bcr-fgfr1融合基因荧光信号和abl内参基因荧光信号，确定样本中的bcr-fgfr1融合基因相对表达量。本发明还提供一种检测样本中bcr-fgfr1融合基因的试剂盒，所述试剂盒包括检测体系pcr反应液，其特征在于，所述检测体系pcr反应液包括检测bcr-fgfr1融合基因的上游引物bcr-fgfr1-f、下游引物bcr-fgfr1-r和探针bcr-fgfr1-probe以及检测abl内参基因的上游引物abl-f、下游引物abl-r和探针abl-probe，其中，bcr-fgfr1-f:tgcctatccctgtgcctg；bcr-fgfr1-r:gagtcccactggaggagagc；bcr-fgfr1-probe:fam-tgatggccgaaccagaagaaccc-tamra；abl-f:gatacgaagggagggtgtacca；abl-r:ctcggccagggtgttgaa；abl-probe:fam-gcttctgatggcaagctctacgtctcct-tamra。进一步地，bcr-fgfr1-f：bcr-fgfr1-r：bcr-fgfr1-probe的摩尔比为2:2:1。进一步地，abl-f：abl-r：abl-probe的摩尔比为2:2:1。进一步地，所述试剂盒还包括阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，所述阳性对照品为含有bcr-fgfr1cdna序列的质粒溶液，所述阴性对照品为不含有bcr-fgfr1cdna序列的质粒溶液，所述空白对照品为生理盐水或不加任何物质。进一步地，所述试剂盒还包括样本rna提取液和红细胞裂解液，所述红细胞裂解液包括16μmol/l氯化铵、1mmol/l碳酸氢钾和12.5μmol/ledta，所述样本rna提取液包括trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇和rnase-free水。本发明的有益效果：本发明将实时荧光pcr技术结合采用taqman探针，利用双标准曲线的方法，分别构建内参基因abl和目的基因bcr-fgfr1的定量标准曲线，检测受测者体内bcr-fgfr1的相对于内参基因的表达水平。相比于测序法，该试剂盒具有精度高，可定量等优点。加之该试剂盒将反应体系所需的引物、探针进行合理配比和优化，使实验条件达到最佳，从而省去了繁琐的条件摸索环节，大大提升了实验效率。该试剂盒经测试特异性好，灵敏度高，操作简便。有助于临床上8p11骨髓增殖综合征(ems)患者体内bcr-fgfr1融合基因的微量残留检测，对于及时干预治疗避免血液学复发、调整治疗方案、评价治疗效果、预测预后、预防临床复发都具有重要意义。附图说明图1为阳性样本(样本1)的荧光pcr检测结果。图2为阴性样本(样本2)的荧光pcr检测结果。具体实施方式下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。实施例1用于检测样本中bcr-fgfr1融合基因的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括检测bcr-fgfr1融合基因的上游引物bcr-fgfr1-f、下游引物bcr-fgfr1-r和探针bcr-fgfr1-probe，其碱基序列为：bcr-fgfr1-f:tgcctatccctgtgcctg；bcr-fgfr1-r:gagtcccactggaggagagc；bcr-fgfr1-probe:fam-tgatggccgaaccagaagaaccc-tamra。进一步地，所述寡核苷酸还包括检测abl内参基因的上游引物abl-f、下游引物abl-r和探针abl-probe，其碱基序列为：abl-f:gatacgaagggagggtgtacca；abl-r:ctcggccagggtgttgaa；abl-probe:fam-gcttctgatggcaagctctacgtctcct-tamra。一种检测样本中bcr-fgfr1融合基因的方法，其步骤如下所示：(1)提取样本中的rna；(2)将(1)提取出的rna逆转录为cdna；(3)加入(2)中所述的cdna到反应管中，利用检测bcr-fgfr1融合基因的上游引物bcr-fgfr1、下游引物bcr-fgfr1-r和探针bcr-fgfr1-probe检测样本中的bcr-fgfr1融合基因荧光信号；利用检测abl内参基因的上游引物abl-f、下游引物abl-r和探针abl-probe检测样本中的abl内参基因荧光信号，其中bcr-fgfr1-f:tgcctatccctgtgcctg；bcr-fgfr1-r:gagtcccactggaggagagc；bcr-fgfr1-probe:fam-tgatggccgaaccagaagaaccc-tamra；abl-f:gatacgaagggagggtgtacca；abl-r:ctcggccagggtgttgaa；abl-probe:fam-gcttctgatggcaagctctacgtctcct-tamra。(4)根据(3)中的bcr-fgfr1融合基因荧光信号和abl内参基因荧光信号，确定样本中的bcr-fgfr1融合基因相对表达量。一种检测样本中bcr-fgfr1融合基因的试剂盒，包括：红细胞裂解液：16μmol/l氯化铵、1mmol/l碳酸氢钾和12.5μmol/ledta；样本rna提取液：trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇、rnase-free水；检测体系pcr反应液：revertraaceqpcrrtkit(toyobo公司)；thnderbirdprobeqpcrmix(2×)、检测bcr-fgfr1融合基因的上游引物bcr-fgfr1-f、下游引物bcr-fgfr1-r各0.8μm、探针bcr-fgfr1-probe0.4μm，以及检测abl内参基因的上游引物abl-f、下游引物abl-r各0.8μm、探针abl-probe0.4μm；其中：bcr-fgfr1-f:tgcctatccctgtgcctg；bcr-fgfr1-r:gagtcccactggaggagagc；bcr-fgfr1-probe:fam-tgatggccgaaccagaagaaccc-tamra；abl-f:gatacgaagggagggtgtacca；abl-r:ctcggccagggtgttgaa；abl-probe:fam-gcttctgatggcaagctctacgtctcct-tamra。阳性对照品：含有bcr-fgfr1cdna序列的质粒溶液。阴性对照品：不含有bcr-fgfr1cdna序列的质粒溶液。空白对照品：生理盐水或不加任何物质。实施例2本方法的检测流程：(1)抽提血液中的组织rna：在洁净的1.5ml的离心管中加入1ml红细胞裂解液，取抗凝血0.5ml混匀。室温静置10min；5000rpm离心5min，弃上清，收集底部的细胞；再次加入0.5ml红细胞裂解液，5000rpm离心5min，弃上清，收集底部的细胞；向细胞中加入1mltrizol，反复吹打直至沉淀完全溶解，室温静止5min；加入0.2ml氯仿，震荡均匀；14000rpm4℃离心10min，吸取上清层转移至另一新的离心管中；加入等体积的异丙醇，上下充分混匀，室温静置10min；14000rpm4℃离心10min，弃上清，加入75％乙醇1ml，轻轻上下颠倒洗涤管壁；14000rpm4℃离心5min，弃乙醇；室温干燥10-15min，加入20μlrnase-free水溶解沉淀。(2)参考toyobo公司的revertraaceqpcrrtkit试剂盒说明书，将rna反转为cdna。(3)试剂配置：按检测人份数配置检测体系pcr反应液各xμl，每人份23μl分装：x＝23μl反应液×(8份内参(标准曲线)+8份目的基因(标准曲线)+n份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)；(4)加样：将(3)中的检测体系pcr反应液和步骤(2)中的cdna2μl加入到96孔板的孔或者反应管中；阳性对照和阴性对照直接加2μl阳性对照品和阴性对照品；空白对照加2μl生理盐水或不加任何物质。(5)检测：检测在实时荧光pcr仪上进行，可用仪器包括abi7300，7500(美国appliedbiosystems公司)等。反应条件：95℃预变性1min；95℃15s，58℃35sec40个循环，荧光信号于58℃35sec时采集。(6)结果判断：将阈值线调整至背景信号及阴性扩增线以上，系统根据标准曲线和ct值自动计算出拷贝数。1)内参阳性时，检测结果才认为有效；2)阳性判断标准：，ct<36，为阳性；35≤ct≤38，为疑似阳性，需要再次验证；ct＞38，为阴性。(7)经步骤(6)判断为样本阳性后，根据步骤(5)采集到的bcr-fgfr1融合基因和abl内参基因荧光信号，确定样本中的bcr-fgfr1融合基因相对表达量。实施例3：灵敏度检测结果将实施例1中的阳性对照品，即将含有bcr-fgfr1cdna序列的质粒，按10、102……..1010的稀释倍数进行梯度稀释，每个梯度稀释得到的稀释液分别作为cdna模板，按照实施例2中的步骤(3)～(7)方法进行荧光pcr扩增和检测，同时在96孔板不同的孔中重复检测10次，稀释1010和1011倍时的检测结果分别如表1和表2所示：表1稀释1010时(浓度为16.9copies/μl)的检测结果表2稀释1011时(浓度为1.69copies/μl)的检测结果96孔板的孔ct(bcr-fgfr1)a5undet.b5undet.c4undet.c5undet.d4undet.d5undet.e4undet.f4undet.g4undet.h4undet.表1和表2的左列是在重复检测10次时每次所对应的96孔的孔编号，右列是每次检测时系统测出的ct值。由表1可知，当稀释倍数为1010时，重复检测10次，每次都产生典型的s型扩增曲线。由表2可知，当稀释倍数为1011时，重复检测10次都没有检测出(undet.)。因此，可以确定本发明检测的检测下限(或者说检测灵敏度)为16.9copies/μl，即16.9×103copies/ml。实施例4阳性样本和阴性样本验证因bcr-fgfr1融合基因比较少见，故本实验中阳性样本使用的是含有bcr-fgfr1cdna序列的质粒溶液(记为样本1)，阴性样本则使用健康人的临检样本(记为样本2)，按实施例2中的方法进行检测。每份标本加入检测体系pcr反应液中2μl。检测时间仅为100分钟。样本1的检测结果图如图1所示，内参基因abl的扩增信号显示pcr系统稳定，检测结果有效，样本1的bcr-fgfr1型ct<36之前有扩增信号，所以样本1为bcr-fgfr1阳性。样本2的检测结果图如图2所示，内参基因abl的扩增信号显示被检样本基因组提取成功，检测结果有效，样本2的bcr-fgfr1型ct>38之后无扩增信号，所以样本2为bcr-fgfr1阴性。实施例5临床样本检测取待检的临床样本20份，按实施例2所述方法提取样本中的组织rna、配制试剂并检测。每份样本加入检测体系pcr反应液中2μl。用荧光pcr仪检测，时间为100分钟。20例临床样本中所有样本的abl均起线，而bcr-fgfr1均不能检测到，说明20例样本中无一例bcr-fgfr1阳性。实验结果如下表3所示：表320例临床样本bcr-fgfr1检测结果sequencelisting<110>杭州艾迪康医学检验中心有限公司<120>检测bcr-fgfr1融合基因的寡核苷酸、方法和试剂盒<130><160>6<170>patentinversion3.5<210>1<211>18<212>dna<213>人工序列<400>1gaagcctttgaaagccgc18<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2gagtcccactggaggagagc20<210>3<211>23<212>dna<213>人工序列<400>3tgatggccgaaccagaagaaccc23<210>4<211>22<212>dna<213>人工序列<400>4gatacgaagggagggtgtacca22<210>5<211>18<212>dna<213>人工序列<400>5ctcggccagggtgttgaa18<210>6<211>28<212>dna<213>人工序列<400>6gcttctgatggcaagctctacgtctcct28当前第1页12