本发明涉及一种催化木糖的比酶活提高的葡萄糖脱氢酶突变体，属于基因工程技术领域。
背景技术：
葡萄糖脱氢酶能以NAD(P)+作为辅因子催化葡萄糖生成葡萄糖酸-1,5-内酯，它在工业上被广泛用于血糖测定的检测试剂盒和生物传感器。此外，在氧化还原酶催化的不对称还原反应中葡萄糖脱氢酶被广泛用于辅酶循环，如(R)-羰基还原酶与葡萄糖脱氢酶偶联后高效催化2-羟基苯乙酮制备(R)-苯基乙二醇。目前，葡萄糖制备的主要原料有玉米，甘薯。但是粮食作物生产成本高，为了节约粮食，也为了实现我国的可持续发展，利用可再生的木质纤维素资源进行生化药剂的生产逐渐引起社会的关注。
纤维素类物质主要包括纤维素，半纤维素和木质素三种成分。将半纤维素酸解或酶解后可获得90％的D-木糖，然而工业生产中的微生物不能有效地利用木糖。因此，高效利用木糖是利用植物纤维素类资源解决人类资源、环境之间的矛盾，实现可持续发展的关键之一。基于这些前提，筛选新的酶或者通过理性设计改造现有的氧化还原酶使其可以高效催化木糖就显得十分必要。
葡萄糖脱氢酶是短链脱氢酶家族的一员。目前短链脱氢酶家族包括47000多条基因和蛋白序列，其中有超过300个蛋白质结构已经被解析并储存在PDB数据库中。虽然大多数短链脱氢酶的序列相似性只有20％-30％，但是它们共享相似的三维立体结构。短链脱氢酶家族的结构包括一个与辅酶NAD(P)+结合的罗斯曼折叠和一个由Ser-Tyr-Lys组成的活性催化三角，这些结构信息都有助于对其进行理性改造以改变酶的催化功能。
发明人之前筛选到一种来自Bacillus sp.YX-1的具有良好有机溶剂耐受性的葡萄糖脱氢酶(BsGDH)，它在不对称反应中常以葡萄糖作为底物进行辅酶的循环再生。但是其催化木糖的比酶活还有待提高。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明基于同源序列比对和蛋白结构分析在BsGDH底物结合域附近设计定点突变，提高BsGDH对木糖的酶活力。本发明的突变酶A258F对木糖的酶活力相较于野生型提高了4倍，可利用木糖作为辅助底物进行不对称转化反应中的辅酶循环，从而实现了对木糖的有效利用。本发明方法解决了木糖资源不能有效利用的问题，有助于对丰富、廉价的植物纤维素类资源的合理利用，促进经济的可持续发展。
本发明的目的是提供一种葡萄糖脱氢酶突变体，所述突变体的氨基酸序列是：
(1)在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的基础上将第258位的氨基酸进行突变；或者，
(2)在严格条件下与(1)限定的氨基酸序列杂交且编码具有葡萄糖脱氢酶活性的氨基酸序列。
在本发明的一种实施方式中，所述编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列是SEQ ID NO:2所示的序列。
在本发明的一种实施方式中，所述将第258位的氨基酸进行突变，是突变成苯丙氨酸(A258F)、组氨酸(A258H)、色氨酸(A258W)或者酪氨酸(A258Y)。
本发明的第二个目的是提供编码所述突变体的核苷酸片段。
本发明的第三个目的是提供含有编码所述突变体的基因的载体。
在一种实施方式中，所述载体为pET载体或者PMD19-T载体。
本发明的第四个目的是提供一种能利用木糖的重组菌，所述重组菌表达本发明的葡萄糖脱氢酶突变体。
在一种实施方式中，所述重组菌可以是以大肠杆菌、芽孢杆菌、酵母为宿主构建得到的。
在一种实施方式中，所述重组菌是以大肠杆菌为宿主构建得到的。
在一种实施方式中，所述重组菌是以大肠杆菌为宿主、pET-28a为载体构建得到的。
本发明的第五个目的是提供所述突变体、编码所述突变体的核苷酸片段、含有编码所述突变体的基因的载体、表达所述突变体的基因工程菌(尤其是大肠杆菌、酵母或枯草芽孢杆菌)在食品、化工或纺织领域的应用。
在一种实施方式中，所述应用是用于催化木糖。
本发明的突变体命名方式：
采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示突变体。如A258F，表示位置258的氨基酸由亲本葡萄糖脱氢酶的丙氨酸Ala替换成苯丙氨酸Phe，位置的编号对应于亲本葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列的相应位点。
本发明的优点和效果：
本发明成功构建含有目的基因的重组菌株BL21(DE3)/pET-GDH(A258F)。重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-GDH(A258F)诱导表达出突变酶A258F，粗酶液经His-Trap亲和层析柱纯化后得到纯酶A258F。通过优化酶活测定条件，A258F在pH7.0的磷酸钾缓冲液中于55℃中有高达7.59U·mg-1的比酶活。这些工作为葡萄糖脱氢酶用于不对称转化反应的辅酶循环提供了新的底物，解决了木糖资源不能有效利用的问题，有助于降低生产成本，为工业中木糖利用提供了优良菌种，为基因工程法改造酶的底物特异性奠定了基础。
具体实施方案
下面是对本发明进行具体描述。
实施例1：表达突变体A258F的重组菌的构建
一、质粒pET-GDH的获得
重组E.coli BL21(DE3)/pET-GDH的培养基组成为：蛋白胨1％，酵母膏0.5％，NaCl 1％。
将重组菌接种于培养基装液量为5mL试管中于37℃、200rpm振荡培养8h。培养结束后，将菌体于12,000rpm下离心1min并收集细胞，利用质粒提取试剂盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit(北京博大泰克生物基因技术有限公司)提取质粒pET-GDH；其中质粒pET-GDH中的葡萄糖脱氢酶GDH的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示(核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示)。
二、重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-GDH(A258F)的构建
(1)A258F全长基因的获得：
合成两端引物(序列分别如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示)：
A258F-f：5’-CGGCTAGCATGTATCCGGATTTAAAAGGAAAAGTCG-3’(Nhe I)，
A258F-r：5’-CCTCGAGTTAACCGCGGCCAAACTGGAATGACG-3’(Xho I)。
采用PCR的方法，将突变引入，具体方法如下：
PCR反应体系：ddH2O 22μL，Premix PrimeSTAR 25μL，上游引物(20μM)1μL，下游引物(20μM)1μL，质粒DNA 1μL。
PCR反应：98℃预变性30s；98℃10s，60℃15s，72℃60s，进行30个循环；72℃延伸10min。以pET-GDH为模板，以引物A258F-f和A258F-r进行PCR反应，获得突变的全长基因。利用3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit(上海申能博彩生物科技有限公司)纯化DNA片断。
纯化后的基因PCR产物与pMD19-T载体通过TA互补连接，连接产物转化大肠杆菌E.coli JM109感受态细胞，重组质粒T-GDH(A258F)用双酶切、PCR及上海生工测序进行验证。
(2)重组质粒pET-GDH(A258F)的获得：
基因GDH(A258F)及pET-28a的酶切：
利用质粒提取试剂盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit(北京博大泰克生物基因技术有限公司)提取质粒T-GDH(A258F)和pET-28a。
按照水、缓冲液、质粒DNA、酶的顺序加到Eppendorf管中，盖好管盖，振荡使液体充分混匀，置于离心机内离心2s使液体集中于管底，37℃金属浴1h，在管中加入1/10的Loading Buffer或将管置于65℃保温10min，终止酶切反应。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，切胶回收并浓缩。
反应体系组成：10×Buffer H 4μL，DNA 10μL，Nhe I 2μL，XhoI 2μL，ddH2O将体系补足40μL。
基因GDH(A258F)与质粒pET-28a的连接
反应体系组成如下：质粒pET-28a 0.8μL，基因4.2μL，Ligation Solution 5μL，将混合连接液置于16℃培养箱中连接12-16h。
重组质粒转化大肠杆菌E.coli JM109
在每管的100μL E.coli JM109感受态细胞悬液中加入10μL连接产物，轻轻混匀，冰浴中静置30min。转入42℃水浴中，热击90s。快速转移至冰浴中冷却3min。每管中加入700μL LB液体培养基，37℃100rpm摇床温育培养1h。培养后菌液3,000rpm离心2min，弃上清700μL，剩余菌液混匀后涂布到含有50μg·mL-1硫酸卡娜霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜。
阳性克隆的选择：
挑取4个克隆，转接入装有5mL的含有50μg·mL-1氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养8h，利用质粒提取试剂盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit(北京博大泰克生物基因技术有限公司)提取质粒。用以下反应体系进行酶切验证：10×Buffer H 2μL，DNA 5μL，Nhe I 0.5μL，XhoI 0.5μL，ddH2O将体系补足20μL。获得阳性质粒pET-GDH(A258F)。
(3)重组质粒转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)：
在每管100μL E.coli RIL感受态细胞悬液中加入10μL连接产物，轻轻混匀，冰浴中静置30min。转入42℃水浴中，热击90s。快速转移至冰浴中，冷却3min。每管中加入700μL LB液体培养基，37℃100rpm摇床温育培养1h。培养后菌液3,000rpm离心2min，弃上清700μL，剩余菌液混匀后涂布到含有50μg·mL-1硫酸卡娜霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜。
阳性克隆的选择：
挑取4个克隆，转接入装有5mL的含有50μg·mL-1硫酸卡娜霉素的LB培养基中，37℃培养8h，利用质粒提取试剂盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit(北京博大泰克生物基因技术有限公司)提取质粒。用以下反应体系进行酶切验证：10×Buffer H 2μL，质粒DNA 5μL，Nhe I 0.5μL，Xho I 0.5μL，ddH2O将体系补足20μL。获得阳性克隆E.coli BL21(DE3)/pET-GDH(A258F)。验证正确的E.coli BL21(DE3)/pET-GDH(A258F)，表达的葡萄糖脱氢酶GDH的氨基酸序列，相对于SEQ ID NO:1所示的序列，第258位的丙氨酸A突变成了苯丙氨酸F。
实施例2：重组菌的诱导表达培养
LB培养基：蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，NaCl 1％，pH7.0。需要时使用前加入硫酸卡那霉素(50μg·mL-1)，固体培养基添加1.5％琼脂粉。
挑取阳性克隆单菌落接种于10mL含50μg·mL-1硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养过夜。取10mL培养液转接于1L含50μg·mL-1硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养至OD600约为1.0。向培养物中加入终浓度为0.1mM的异丙基-Β-D-硫代半乳糖苷，在37℃下进行诱导培养12h。
实施例3：重组菌的诱导表达培养
诱导表达：LB培养基组成同实施例2，挑取阳性克隆单菌落接种于10mL含50μg·mL-1硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养过夜。保藏甘油菌两支(每支含有1mL菌液，15％的甘油)，同时取1mL培养液转接于50mL含50μg·mL-1硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养至OD600约为1.0。向培养物中加入终浓度为0.1mM的异丙基-Β-D-硫代半乳糖苷，在37℃下进行诱导培养12h。收集菌体，溶解于20mM磷酸缓冲液(pH 7.0)中，超声破碎20min，工作时间1s，间歇时间3s。将破碎后的菌体12,000rpm，40min。分别取上清和沉淀，SDS-PAGE检测蛋白表达。
实施例4：重组蛋白A258F的纯化
利用His-Trap HP affinity column纯化重组蛋白A258F：
LB培养基：蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，NaCl 1％，pH7.0。需要时使用前加入硫酸卡那霉素(50μg·mL-1)，固体培养基添加1.5％琼脂粉。
挑取阳性克隆单菌落接种于10mL含50μg·mL-1硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养过夜。取10mL培养液转接于1L含50μg·mL-1硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养至OD600约为1.0。向培养物中加入诱导物异丙基-Β-D-硫代半乳糖苷0.1mM，在培养温度37℃下进行诱导培养12h。培养后的重组大肠杆菌细胞6,000rpm离心10min并用生理盐水洗涤三次后收集。
称取2g湿菌体，加入适量0.1mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液悬浮细胞，于冰浴中进行超声破碎(工作1s，间隔3s，工作时间5min)。4℃条件下12,000rpm离心30min收集上清液作为粗酶液。利用GE公司生产的His-Trap亲和层析对粗酶液进行纯化，纯酶液超滤脱盐后用于酶活测定。
实施例5：突变前后比酶活测定
A258F酶活力的测定：
根据β-D-葡萄糖+NADP+→D-葡萄糖-δ-内酯+NADPH，NADPH的生成会引起340nm处吸光值的升高，因此可以通过测定反应过程中340nm处的吸光值的变化来衡量葡萄糖脱氢酶的活力。
酶活测定的标准条件：总反应体积100μL，分别加入0.1M醋酸缓冲液(pH4.5～6.5)或0.1M磷酸钾缓冲液(pH 7.0～7.5)或0.1M Tris-HCl缓冲液(pH 8.0～9.0)，2.0mM NADP+，0.1M D-木糖，30℃保温2min，加入适量纯酶液后开始扫描340nm处吸光值的变化。蛋白质含量测定采用Bradford法，以牛血清白蛋白BSA为标准品。酶活力定义为：在上述条件下，每分钟催化生成1μmol的NADPH的酶量定义为一个单位U。
酶活的计算公式为：酶活(U)＝EW×V×103/(6220×0.3)
比活的计算公式：比活(U·mg-1)＝酶活(U)/蛋白量(mg)
其中，EW：1min内340nm处吸光度的变化；V：反应液的体积(mL)；6220：摩尔消光系数(L mol-1cm-1)；0.3：光程距离(cm)。
结果显示，不同pH的缓冲液下计算得到的A258F的比酶活如表1所示。
表1突变前后的葡萄糖脱氢酶在不同pH的缓冲液下的比酶活
注：本发明的野生酶BsGDH即为氨基酸序列如SEQ ID NO:1的葡萄糖脱氢酶。
实施例6：突变前后动力学参数测定
根据β-D-葡萄糖+NADP+→D-葡萄糖-δ-内酯+NADPH，NADPH的生成会引起340nm处吸光值的升高，因此可以通过测定反应过程中340nm处的吸光值的变化来衡量葡萄糖脱氢酶的活力。为了研究酶对底物木糖的亲和力，在2.0mM NADP+条件下，分别测定不同木糖浓度(0.5mM-10mM)下的最初反应速率。
根据米氏方程v＝Vmax×[S]/Km+[S]，计算出酶对不同辅酶的Km值。
其中，v：反应速率(U/mg·60s)；Vmax：最大反应速率(U/mg·60s)；[S]：底物浓度(mmol/L)；Km：反应速度v达到一半1/2Vmax时的底物浓度(mmol/L)。
当底物浓度饱和时，Vmax＝Kcat/[E]，计算出Kcat值。
其中，Vmax：最大反应速率(U/mg·60s)；[E]：饱和底物浓度(mmol/L)。
动力学参数测定：总反应体积100μL，加入0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)，2.0mM NADP+，温度55℃保温2min，加入适量纯酶液测定不同木糖浓度(0.5mM-10mM)下的最初反应速率。计算出A258F的kcat为17.3s-1；Km为14.7mM；kcat/Km为1.17s-1·mM-1；而野生型的kcat为6.6s-1；Km为44.0mM；kcat/Km为0.15s-1·mM-1。
此外，发明人还构建了突变体A258H、A258W、A258Y、K207A、E220K、Q252K等，采用酶标仪检测340nm处的吸光值变化的方法测定了比酶活，并测定了动力学参数，结果如表2、表3所示。表2是在最佳条件磷酸钾pH7.0，55℃条件下测定得到的比酶活结果。
表2不同突变体的比酶活比较
表3野生型及突变酶的动力学参数
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种催化木糖的比酶活提高的葡萄糖脱氢酶突变体
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Tyr Pro Asp Leu Lys Gly Lys Val Val Ala Ile Thr Gly Ala Ser
1 5 10 15
Ser Gly Leu Gly Arg Ala Met Ala Ile Arg Phe Gly Gln Glu Gln Ala
20 25 30
Lys Val Val Ile Asn Tyr Tyr Ser Asn Glu Lys Glu Ala Gln Thr Val
35 40 45
Lys Glu Glu Val Gln Lys Ala Gly Gly Glu Ala Val Ile Ile Gln Gly
50 55 60
Asp Val Thr Lys Glu Glu Asp Val Lys Asn Ile Val Gln Thr Ala Val
65 70 75 80
Lys Glu Phe Gly Thr Leu Asp Ile Met Ile Asn Asn Ala Gly Met Glu
85 90 95
Asn Pro Val Glu Ser His Lys Met Pro Leu Lys Asp Trp Asn Lys Val
100 105 110
Ile Asn Thr Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Cys Arg Glu Ala Ile
115 120 125
Lys Tyr Tyr Val Glu Asn Asp Ile Gln Gly Asn Val Ile Asn Met Ser
130 135 140
Ser Val His Glu Met Ile Pro Trp Pro Leu Phe Val His Tyr Ala Ala
145 150 155 160
Ser Lys Gly Gly Ile Lys Leu Met Thr Glu Thr Leu Ala Leu Glu Tyr
165 170 175
Ala Pro Lys Arg Ile Arg Val Asn Asn Ile Gly Pro Gly Ala Ile Asn
180 185 190
Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Ala Asp Pro Val Gln Lys Lys Asp
195 200 205
Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Tyr Ile Gly Glu Pro Glu Glu Ile
210 215 220
Ala Ala Val Ala Val Trp Leu Ala Ser Lys Glu Ser Ser Tyr Val Thr
225 230 235 240
Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Gln Tyr Pro Ser Phe
245 250 255
Gln Ala Gly Arg Gly
260
<210> 2
<211> 786
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgtatccgg atttaaaagg aaaagtcgtc gccattacag gagcatcatc aggattagga 60
agagcgatgg cgatccgctt cgggcaggag caggcgaaag tcgtgattaa ctactacagt 120
aatgaaaaag aggctcaaac cgtaaaagaa gaagttcaaa aagcgggcgg cgaagcggtc 180
attattcaag gtgacgttac aaaagaagag gatgtcaaaa acattgtgca gaccgcggtc 240
aaggaattcg gcacattaga tatcatgatc aacaacgccg gcatggaaaa tccggtcgag 300
tcgcataaaa tgccgctaaa agactggaac aaagtcatca acaccaacct gaccggcgct 360
tttctgggat gccgcgaagc cattaaatat tacgtagaga atgatattca aggaaacgtc 420
attaacatgt cgagcgtaca tgaaatgatt ccgtggccgc tgtttgtcca ctatgcggca 480
agtaaaggcg gcattaaatt aatgacggaa acattggcgc ttgagtacgc gccgaagcgc 540
atccgtgtta acaatatcgg gccgggcgcc atcaatacgc cgatcaatgc ggaaaagttt 600
gcggatcccg ttcagaaaaa agatgtggaa agcatgattc cgatggggta tatcggtgag 660
ccggaagaaa tcgcggctgt cgccgtctgg cttgcttcaa aggaatcaag ctacgtgacc 720
ggcattacgc tgtttgctga cggcggaatg acacaatatc cgtcattcca ggcaggccgc 780
ggttaa 786
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cggctagcat gtatccggat ttaaaaggaa aagtcg 36
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cctcgagtta accgcggcca aactggaatg acg 33