本发明属于植物生物
技术领域：
，具体地说，涉及一种番茄抗冷害基因及应用。
背景技术：
：神经鞘脂质(Sphingolipids)是一类含有脂肪酸和长链鞘氨醇骨架的复杂脂类总称。它是在内质网上由丝氨酸软脂酰辅酶A转移酶(Serinepalmitoyltransferase,SPT)催化丝氨酸和棕榈酰辅酶A而从头合成的。该类脂质是植物细胞质膜，液泡膜和内膜系统的重要组成部分，约占膜上脂类的40％，主要存在于细胞膜的外叶。细胞膜的外叶会影响膜的完整性和离子的通透性，而细胞膜在低温条件下的生理状态是植物抗冷害能力的重要指标。此外，神经鞘脂质可以被还原生成一种含有不饱和烃基链的十八碳氨基醇，即鞘氨醇(Sphinganine)。它是一类长链基(Longchainbase,LCB)，可以被鞘磷脂脱氢酶(Sphingolipiddesaturase,SLD)催化生成不饱和的鞘磷脂。大量的研究表明，不饱和鞘磷脂在耐寒型植物中大量存在，因为该物质含量的多少影响着植物耐寒能力的高低。在拟南芥中，葡糖苷酰鞘氨醇(d18:1c24:0)含量的上升可以增强植株的抗冻能力。也有实验进一步表明，AtSLD基因突变的拟南芥植株在低温环境下会出现萎黄病，植株不能正常生长。另外，研究发现，葡萄苷酰鞘氨醇在细胞膜和液泡膜上有相当高的含量，而高度羟基化的葡萄苷酰鞘氨醇对维持细胞膜和液泡膜的完整性非常重要。△8-鞘磷脂脱氢酶是催化鞘脂长链基C8位脱氢生成△8-不饱和鞘磷脂的关键酶。冷害处理可以促使大豆叶片中含葡萄苷酰鞘氨醇的△8-不饱和鞘磷脂含量增加，因此，可以认为△8-不饱和鞘磷脂及△8-鞘磷脂脱氢酶与大豆的抗寒性密切相关。从前人的研究中可以发现，神经鞘脂质及其不饱和鞘磷脂脱氢酶可能影响着植物的抗冷害能力。然而，关于该脱氢酶与抗寒关系的研究仍较少，特别是在经济作物方面，二者的联系还有待进一步的阐明。番茄(LycopersiconesculentumMill)系茄科番茄属植物，是一种重要的经济作物，与国民的“菜篮子工程”息息相关。它是冷敏感型植物，低温冷害会给番茄的生产造成较大损失，是影响番茄周年生产量和市场供应的主要因素之一。多数番茄品种在温度低于10℃时生长发育容易受阻，当温度低于6℃时表现出明显的冷害症状，所以关于番茄对低温环境的适应性受到了学者们的广泛关注。为了改良番茄品种，提高番茄对低温的抵抗力，减少番茄受冷害的经济损失，目前研究者们已经在细胞膜结构、抗氧化性酶、细胞壁物质代谢等多方面对番茄抗冷害机制进行了探索。但是，还未有研究者探索过△8-鞘磷脂脱氢酶在番茄低温适应性中的作用。因此，本发明不仅从神经鞘脂质代谢这个全新的角度去挖掘番茄抗冷害的机制，同时也为培育耐低温番茄品种提供一定的理论依据，对提高番茄种植的适应性、扩大栽种面积、增加产量等方面具有重要的意义。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种番茄抗冷害基因SlSLD，该基因的沉默可以导致番茄耐低温能力降低。该基因可以应用于番茄抗冻育种，可以有效的提高番茄品种的抗冻性。本发明的另一个目的在于提供一种番茄抗冷害基因在番茄耐寒育种中的应用。通过提高植物体内SlSLD基因表达量来进行植物耐低温育种，以此来使植物的适宜种植范围扩大。一种番茄△8-鞘磷脂脱氢酶基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。编码上述番茄△8-鞘磷脂脱氢酶基因的番茄△8-鞘磷脂脱氢酶，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。通过调节本发明所描述的SlSLD基因的表达，可以改变植物对冷的敏感性。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明通过病毒诱导的基因沉默(Virusinducedgenesilencing,VIGS)技术发现了一种新的番茄抗冷害相关基因SlSLD，该基因的沉默可以导致番茄植株的耐低温能力明显降低。对该基因编码的氨基酸序列分析证明该基因所编码的蛋白是一种△8-鞘磷脂脱氢酶，与神经鞘脂质代谢相关，该酶在植物抵抗低温胁迫的反应中起重要的作用。本研究提供了这个基因的核酸序列，及其氨基酸序列，同时还涉及该基因在番茄耐寒育种中的用途。SlSLD基因可以应用于番茄的抗冻育种，提高番茄优良品种的适应性，扩大其种植范围，促进其稳产和高产。附图说明图1为低温胁迫处理番茄植株后的表型图。具体实施方式以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。实施例1：番茄的VIGS处理以下使用的LB固体培养基的配方为：10g/L胰蛋白胨(Tryptone)，5g/L酵母提取物(Yeastextract)，10g/L氯化钠(NaCl)，15～20g/L琼脂粉，用10MNaOH调整pH值到7.4，余量为水；121℃，灭菌20min，温度降至55℃左右(不烫手)时，加入终浓度为30mg/L卡那霉素(Kanamycin,Kan)，或者加入终浓度为30mg/L卡那霉素(Kanamycin,Kan)，50mg/L利福平(Rifampicin,Rif)，50mg/L庆大霉素(Gentamicin,Gen)，倒平板，保存备用；LB液体培养基的配方为：10g/L胰蛋白胨(Tryptone)，5g/L酵母提取物(Yeastextract)，10g/L氯化钠(NaCl)，用10MNaOH调整pH值到7.4，余量为水；121℃，灭菌20min，温度降至55℃左右(不烫手)或冷却后，加入终浓度为30mg/L卡那霉素(Kanamycin,Kan)，或者加入终浓度为30mg/L卡那霉素(Kanamycin,Kan)，50mg/L利福平(Rifampicin,Rif)，50mg/L庆大霉素(Gentamicin,Gen)。以下对实施例的具体步骤进行说明：1)番茄RNA的提取及cDNA的获得番茄RNA提取方法参考华越洋生物公司超快型植物RNA提取试剂盒使用说明。具体步骤如下：取0.1g用液氮磨碎的番茄叶片置于1.5mL离心管中，加入1mL细胞裂解液，充分混匀；加入300μL去蛋白液和200μL氯仿，盖好管盖，剧烈振荡混匀30s；室温12,000×g，离心10min，将上清(不多于700μL)转移至1.5mLRNase-free离心管中；加入等体积漂洗液，充分颠倒混匀，将混合物(不多于700μL)转移至离心吸附柱中，室温12,000×g，离心1min，弃穿透液；加入500μL洗柱液，室温12,000×g，离心1min，弃穿透液，重复一次。室温12,000×g，离心1min，以便去除残留的液体；将离心吸附柱转移到RNase-free离心管中，加入50μLRNA洗脱液，室温放置5min；室温12,000×g，离心1min，将含有番茄RNA的穿透液存于-80℃冰箱。将番茄RNA逆转录成cDNA，采用Takara公司的PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser(PerfectRealTime)试剂盒。取出-80℃冻存番茄RNA，待融化后，根据说明书加入DNA酶后，42℃消化DNA2min，再加入反转录试剂，37℃15min，85℃5sec；得到逆转录的cDNA。2)△8-鞘磷脂脱氢酶基因(SlSLD)的克隆利用生物信息学分析方法，在番茄基因组数据库中搜索番茄△8-鞘磷脂脱氢酶基因(SlSLD)，得到1条候选序列。根据该序列信息，设计用于扩增SlSLD基因全长序列的引物序列，上游引物SlSLDF：5’-GGATCCCAGGGTAAGGTGTATGATGT-3’和下游引物SlSLDR：5’-TCTAGAGCAATTCCCAGTAAGGAC-3’。反应体系参照说明书，PCR扩增用Takara的PrimeSTARMaxPremix(2×)10μL，10μM上游引物SlSLDF和10μM下游引物SlSLDR各0.5μL，逆转录的cDNA模板0.1μL，加双蒸水补足20μL。PCR扩增程序为98℃30sec，1个循环；98℃15sec，60℃15sec，72℃30sec，35个循环；72℃10min，1个循环。由此扩增得到△8-鞘磷脂脱氢酶基因(SlSLD1)的全长序列，全长序列经限制性内切酶BamHI和XhoI酶切后(37℃酶切反应2h)，连接到表达载体pTRV2载体(37℃限制性内切酶BamHI和XhoI酶切2h)中，得到重组质粒pTRV2-SlSLD，送公司测序。△8-鞘磷脂脱氢酶基因(SlSLD)的核酸序列如SEQIDNO.1所示，其编码的△8-鞘磷脂脱氢酶基因的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。确认序列正确后，利用热激法(42℃热激90sec)将该重组质粒pTRV2-SlSLD转入大肠杆菌DH5α中，于37℃在含30mg/L卡那霉素(Kanamycin,Kan)LB固体培养基上培养1天，挑取阳性单克隆于1mL的含30mg/L卡那霉素(Kanamycin,Kan)LB液体培养基中，在37℃条件下，以200转/分钟培养1天，至OD600值为1.0左右，保存于15％的甘油，放于-80℃冰箱备用。3)农杆菌介导的△8-鞘磷脂脱氢酶基因(SlSLD)的VIGS挑取2)中所存的菌种，置于含5mLLB液体培养基(含30mg/L卡那霉素(Kanamycin,Kan))中，在37℃条件下，以200转/分钟培养1天，至OD600值为1.2左右，然后用小提质粒试剂盒提取重组的质粒pTRV2-SlSLD。取1μLpTRV1质粒和pTRV2-SlSLD质粒，分别加入置已经在冰上解冻的30μLGV3101感受态细胞。将感受态细胞转移到2mm型的电机杯，通过电机方式进行转化，具体参数如：选择Pre-SetProtocols下的Bacterial下的A.tumefaciens，电压2400V，电容25μF，电阻200Ω，电击杯Cuvette为2mm。电击后，加入无抗性的LB液体培养基，颠倒混匀，转移到1.5mL离心管，于28℃条件下，以200转/分钟培养2h，再将该菌于30mg/L卡那霉素(Kanamycin,Kan)，50mg/L利福平(Rifampicin,Rif)，50mg/L庆大霉素(Gentamicin,Gen)的LB固体培养基上培养2-3天。挑取阳性单克隆于1mL的含30mg/L卡那霉素(Kanamycin,Kan)，50mg/L利福平(Rifampicin,Rif)，50mg/L庆大霉素(Gentamicin,Gen)LB液体培养基中，在28℃条件下，以200转/分钟培养1天，至OD600值为1.0左右。在4000×g下，离心15min，收集沉淀，加入含30mg/L卡那霉素(Kanamycin,Kan)，50mg/L利福平(Rifampicin,Rif)，50mg/L庆大霉素(Gentamicin,Gen)LB液体培养基，使得pTRV1/GV3101菌液的OD600值为0.4，pTRV2-SlSLD/GV3101菌液的OD600值为0.4。再将二者菌液以1：1的比例混合，并于室温静置3～6h。通过真空注射的方法侵染刚长出第一片真叶的番茄幼苗，以pTRV2/GV3101为对照，同时进行侵染。侵染后的幼苗置于21℃，16：8(白天：黑夜)条件下，培养30d。用荧光定量PCR分析的方法来鉴定基因被抑制的程度，具体结果如表1所示。表1VIGS后番茄植株中SlSLD基因的表达量植株SlSLD基因的表达量*植株10.0064植株20.0036植株30.0048植株40.0032植株50.0031注：*以对照组基因的表达量为1.实施例2：SlSLD基因沉默的植株(处理组)与对照组的低温胁迫试验将SlSLD基因沉默的(处理组)和对照组的植株于4℃条件下胁迫处理，并拍照记录植株在低温环境中的表型变化。从图1可以看出，SlSLD基因沉默的和对照组的植株在低温处理6h时，叶片边缘都出现了卷曲，其中处理组的变化更为明显；在24h时，对照组仍保持6h时的状态，叶片出现轻微的卷曲，而处理组的植株整体都出现萎蔫，已经不能正常生长。实施例3：低温胁迫试验后植株的生理指标测定测定经低温处理6h番茄叶片的生理指标，主要包括电导率、丙二醛含量可溶性多糖含量、超氧化物歧化酶活性、过氧化物酶活性和叶绿素含量。具体操作如下所示：制备上清液制备，称取0.1g番茄叶片，加入2.5mL预冷的50mM磷酸缓冲盐溶液(pH7.0)，于冰上研磨，匀浆液在4℃、4,000×g条件下离心10min，收集上清液，置于4℃冰箱，用于下面第2-5项指标的测定。1)电导率(Relativeelectrolyticleakage,REL)的测定取0.05g经低温处理后对照组和处理组番茄的叶片，用双蒸水清洗叶片表面的电解质。将叶片置于含10mL双蒸水的离心管中，在室温浸泡22h，然后用导电率计(JingkeDDS-307A)测定，所得值为R1。将含番茄叶片的离心管于沸水中处理30min，然后等其降到室温后，用导电率计重新测定，所得值为R2。计算公式：电导率(REL)＝R/R2×100％。2)丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量的测定采用硫代巴比妥法测定叶片中MDA的含量。取200μL的上清液置于1.5mL离心管，加入等体积的0.6％硫代巴比妥酸溶液，将混合物进行沸水浴30min。冷却后，于波长532nm、600nm和450nm下测吸光值。计算公式：MDA浓度(μmol/L)＝6.45×(OD532-OD600)-0.56×OD450。3)可溶性多糖含量的测定采用蒽酮比色法测定叶片中可溶性多糖的含量。取100μL的上清液置于1.5mL离心管，加入400μL含0.2％蒽酮的硫酸溶液。将混合物进行沸水浴5min。冷却后，于波长630nm下测吸光值，以葡萄糖绘制标准曲线。4)超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase,SOD)活性的测定采用碧云天WST-8试剂盒测定SOD的活性，具体操作步骤参照试剂盒所提供的说明书。5)过氧化物酶(POD)活性的测定采用愈创木酚比色法测定POD的活性。取10μL上清液，加入190μL含0.12％H2O2和0.56％愈创木酚的混合液，于波长470nm下测吸光值，每隔1min读数一次，直至反应终止，以每分钟吸光值变化1为1个酶活性单位(U)。POD活性的单位是U/mg蛋白。6)叶绿素含量的测定称取0.02g番茄叶片，用2mL80％的丙酮于黑暗处过夜浸泡，在8,000×g条件下离心10min，收集上清液。于波长647nm和665nm下测吸光值。计算公式：叶绿素浓度(mg/g)＝(17.90×OD647+8.08×OD665)×浸泡液体积(ml)/1000/鲜重(g)。从表2可以看出，相比于对照组的植株，SlSLD基因沉默的植株抗冷能力明显减弱。处理组的电导率高于对照组，说明该基因表达量的抑制会导致番茄植株在低温条件下受胁迫的程度加重。丙二醛的含量也是处理组高于对照组，而超氧化物歧化酶和过氧化物酶的活性确是对照组更高。另外，番茄叶片的叶绿素含量是SlSLD基因沉默的植株低于对照组。因此，通过冷胁迫实验表明，SlSLD基因的沉默会减弱番茄的抗冷害能力。表2低温胁迫后番茄叶片的生理指标生理指标对照组处理组电导率(％)45.64±5.55*71.47±4.09丙二醛浓度(μmol/g鲜重)6.23±0.31*7.41±0.33可溶性多糖含量(mg/0.1g鲜重)3.24±0.28*2.28±0.26超氧化物歧化酶活性(U/mg蛋白)0.30±0.06*0.20±0.06过氧化物酶活性(U/mg蛋白)2.51±0.41*1.12±0.28叶绿素(mg/g鲜重)3.18±0.20*2.24±0.31注：*表示对照组与处理组有显著性的差异，p≤0.05。SEQUENCELISTING<110>中国科学院华南植物园<120>一种番茄抗冷害基因及应用<130><160>2<170>PatentInversion3.5<210>1<211>1344<212>DNA<213>番茄（Solanumlycopersicumcv.Micro-Tom）<400>1atggcagattcaagaaagtacatttctagtgaggaactgaagaatcacaacaaaccaggg60gatctgtggatatccattcagggtaaggtgtatgatgtatcagattgggtgaaggaacat120cctggtggtgatttcccactgttaaatcttgctggacaggatgttactgatgcatttgtt180gcatttcatcctgctactgcttggaagtatcttgacaagttctttaaggggttttacctc240aaggattattctgtttctgaggtatctacggattatagaaggcttgtgtctgagttcact300aaaatggggttgtttgaaaagaaaggccatgtttgtttattcaccatgttcttaatgaca360atgttgttttccttaagtgtttatggaatcttgtattgtcatggtgtgttggcacatttg420ataagtggtgccttgatggggtgtctttggattcagagtgggtggattggtcatgattca480gggcattatcaggtgatgagcactcgcggattcaacagatttgctcaagtccttactggg540aattgccttgctggaatcagcattgcttggtggaagtggaaccacaatgctcaccacatt600gcctgcaacagtcttgaatatgaccctgatcttcaacacatgccattctttgtggtatct660tccaagtttttcgactcactcacttcttatttttacgataggaagatgaattttgattct720tttactagattcttggttagtcatcaacattggacattttatcctgttatgtgttttgct780agaatcaatttgtttgctcagtcattcatattgttgttatccaacaaaaatgtgccccat840cgagttcaggagcttttgggggtggtttctttctggatttggtatccgttgcttgtttct900ttcttgccaaactggggcgaaagaattatatttgttcttgctagtttcacagtgactgga960attcagcatgttcaattctgtttaaaccatttctcatctgaaatttatgttgcaccacct1020aaaggaaatgattggtttgagaagcaaactaatggctctctcgacatatcatgccctagt1080tggatggattggtttcatggtggattgcagtttcagattgagcatcatttgtttcctaga1140ttaccaagatgccaactgaggaaagtctctccctttgtgaaagacctctgtaaaaagcat1200ggtttgccttacagttgtgtctccttctggaagtctaatgttttgaccatcagcaccctc1260agagctgcagctttgcaggctcgggatttaactaagcctgttccaaaaaatctagtttgg1320gaagccgtcaacactcacggttga1344<210>2<211>447<212>PRT<213>番茄（Solanumlycopersicumcv.Micro-Tom）<400>2MetAlaAspSerArgLysTyrIleSerSerGluGluLeuLysAsnHis151015AsnLysProGlyAspLeuTrpIleSerIleGlnGlyLysValTyrAsp202530ValSerAspTrpValLysGluHisProGlyGlyAspPheProLeuLeu354045AsnLeuAlaGlyGlnAspValThrAspAlaPheValAlaPheHisPro505560AlaThrAlaTrpLysTyrLeuAspLysPhePheLysGlyPheTyrLeu65707580LysAspTyrSerValSerGluValSerThrAspTyrArgArgLeuVal859095SerGluPheThrLysMetGlyLeuPheGluLysLysGlyHisValCys100105110LeuPheThrMetPheLeuMetThrMetLeuPheSerLeuSerValTyr115120125GlyIleLeuTyrCysHisGlyValLeuAlaHisLeuIleSerGlyAla130135140LeuMetGlyCysLeuTrpIleGlnSerGlyTrpIleGlyHisAspSer145150155160GlyHisTyrGlnValMetSerThrArgGlyPheAsnArgPheAlaGln165170175ValLeuThrGlyAsnCysLeuAlaGlyIleSerIleAlaTrpTrpLys180185190TrpAsnHisAsnAlaHisHisIleAlaCysAsnSerLeuGluTyrAsp195200205ProAspLeuGlnHisMetProPhePheValValSerSerLysPhePhe210215220AspSerLeuThrSerTyrPheTyrAspArgLysMetAsnPheAspSer225230235240PheThrArgPheLeuValSerHisGlnHisTrpThrPheTyrProVal245250255MetCysPheAlaArgIleAsnLeuPheAlaGlnSerPheIleLeuLeu260265270LeuSerAsnLysAsnValProHisArgValGlnGluLeuLeuGlyVal275280285ValSerPheTrpIleTrpTyrProLeuLeuValSerPheLeuProAsn290295300TrpGlyGluArgIleIlePheValLeuAlaSerPheThrValThrGly305310315320IleGlnHisValGlnPheCysLeuAsnHisPheSerSerGluIleTyr325330335ValAlaProProLysGlyAsnAspTrpPheGluLysGlnThrAsnGly340345350SerLeuAspIleSerCysProSerTrpMetAspTrpPheHisGlyGly355360365LeuGlnPheGlnIleGluHisHisLeuPheProArgLeuProArgCys370375380GlnLeuArgLysValSerProPheValLysAspLeuCysLysLysHis385390395400GlyLeuProTyrSerCysValSerPheTrpLysSerAsnValLeuThr405410415IleSerThrLeuArgAlaAlaAlaLeuGlnAlaArgAspLeuThrLys420425430ProValProLysAsnLeuValTrpGluAlaValAsnThrHisGly435440445当前第1页1 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