本发明涉及动物疫苗，具体地说，涉及一种乙型脑炎活疫苗的抗原及含有其的疫苗。
背景技术：
：现有猪用乙型脑炎疫苗的抗原生产方式包括两种，一种是采用乙型脑炎强毒接种小鼠，收集感染小鼠脑组织，经组织匀浆制备而成的抗原，该方法存在生物安全风险高、杂蛋白多、不适于规模化生产等问题；另一种是采用原代地鼠肾细胞转瓶培养疫苗弱毒株，该方法存在原代细胞制备工艺复杂、外源病毒控制难、批间差异大等问题，尤其是培养病毒毒价低，仅能达到5.5-7.0LgPFU/mL，增加了疫苗的生产成本。技术实现要素：为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种乙型脑炎活疫苗的抗原及其制备方法与应用。为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：第一方面，本发明提供了一种乙型脑炎活疫苗的抗原，其制备方法包括如下步骤：1)在Vero细胞中接种已适应Vero细胞的乙型脑炎病毒减毒株0.02～0.2MOI(PFU/细胞数)，进行吸附；2)添加pH7.6～7.8的病毒培养维持液进行培养；所述病毒培养维持液为含有15～20mL/L的小牛血清、6～15g/L精氨酸盐酸盐、5～10g/LPEG2000和2.3～12g/L4-羟乙基哌嗪乙磺酸，纯水配置的DMEM溶液；3)待vero细胞出现60～80％病变，冻融收获病毒液，澄清过滤去掉细胞碎片，收集上清病毒液，即得。作为优选，所述病毒培养维持液的pH值为7.6，采用1M的NaOH调节，所述病毒培养维持液经滤膜过滤除菌后使用。作为优选，所述病毒培养维持液为含有20mL/L的小牛血清、10g/L精氨酸盐酸盐、5g/LPEG2000和5g/L4-羟乙基哌嗪乙磺酸，纯水配置的DMEM溶液。作为优选，步骤1)中，在37℃、12～20转/小时的条件下，吸附1h。步骤2)中，在35℃、12～20转/小时的条件下，培养3～4天。上述条件，能够更加有利于病毒吸附和稳定。进一步地，步骤1)中，用于接种减毒株的Vero细胞的制备方法为：采用含体积百分比8％小牛血清的DMEM细胞培养液转瓶培养Vero细胞，待Vero细胞形成单层，弃掉细胞培养液，以pH7.4的PBS清洗3次，弃掉洗液，即得。进一步地，步骤1)中，所述已适应Vero细胞的乙型脑炎病毒减毒株为经Vero细胞传代培养后，毒价大于7LgPFU/mL，且传代次数较少的减毒株。作为优选，进行Vero细胞传代培养的乙型脑炎病毒减毒株为SA14-14-2株，可购自中牧实业股份有限公司销售的猪乙型脑炎活疫苗(SA14-14-2株)，经Vero细胞传代培养即可获得。第二方面，本发明提供了前述抗原在制备乙型脑炎疫苗中的应用。需要说明的是，所述疫苗可采用本领域常规的疫苗制备方法进行，但只要使用了本发明所述的抗原进行疫苗的制备，均属于本发明的保护范围。第三方面，本发明提供了一种含有前述抗原的猪用乙型脑炎活疫苗。进一步地，其由所述抗原与冻干保护剂混合后经真空冷冻干燥制备。每头份病毒含量不低于105.0PFU。所述真空冷冻干燥的程序为：预冻阶段－40℃，疫苗达到最低温度后维持时间2小时；升华干燥阶段疫苗最终温度－20℃，达到疫苗最终温度时运行时间17小时，冻干箱真空控制压力为0.18mbar；解析干燥阶段疫苗的最终温度28℃，冻干箱真空压力为0.005mbar，运行时间8小时。本发明的有益效果在于：本发明提供了一种乙型脑炎活疫苗的抗原及其制备方法与应用，采用Vero细胞进行乙型脑炎病毒减毒株(SA14-14-2株)的转瓶培养，使用了含有4-羟乙基哌嗪乙磺酸、精氨酸盐酸盐、PEG2000等成分的病毒培养维持液，所生产得到的抗原，具有批间差异小、免疫原性好、毒价高等优势，以该抗原制备的猪乙型脑炎活疫苗能有效预防猪的乙型脑炎病毒感染。具体实施方式下面结合具体实施例子来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例子仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例1适应Vero细胞乙型脑炎病毒减毒株的制备及免疫原性研究(1)病毒的适应性传代用含8％小牛血清的DMEM细胞培养液制备Vero细胞悬液，按照分种率1：3接种培养瓶，37℃，5％CO2培养，待细胞形成致密单层(约培养48小时)，用于接毒。接毒前将培养瓶中的细胞培养液倒净，用pH7.4的PBS清洗3次，最后一次洗涤后将残液控净，然后按照培养液体积的5％接种乙型脑炎病毒减毒株(SA14-14-2)。接毒后于37℃吸附90分钟。吸附完毕，加入含2％小牛血清DMEM维持液，于35℃培养。逐日观察细胞病变情况，当细胞病变达到75％时终止培养，冻融后收获病毒记作F1待，按此方法将乙脑病毒减毒株连续传代10代，测定各代次毒价。(2)病毒毒价的测定采用含2％小牛血清DMEM对各代次病毒液进行10倍系列稀释，接种24孔细胞板培养的BHK-21细胞单层，0.1mL/孔，37℃，5％CO2培养箱中吸附60min，每隔30分钟轻摇板1次。吸附结束后将培养板倒置，控干孔内残余毒液，然后每孔加入含1.5％甲基纤维素、2％小牛血清的DMEM维持培养基2mL，覆盖细胞单层，置入37℃，5％CO2培养箱继续培养5～6天进行固定染色，每孔加入含1％结晶紫，20％甲醇的固定染色剂0.5mL，室温放置20分钟，然后弃去染色剂，用清水漂洗1次，控干水分，置培养板于干燥通风处阴干。固定染色细胞板上的正常细胞着色呈蓝紫色，病变区域细胞不着色或为淡蓝色。在低倍显微镜镜下计数各孔的蚀斑数，计算出某个稀释度的平均蚀斑数(PFU)，根据公式计算检测样品的蚀斑含量。样品蚀斑含量(LgPFU/mL)＝Lg某稀释度平均蚀斑数×稀释倍数×10。结果，乙型脑炎病毒减毒株SA14-14-2在Vero细胞上连续传代后，逐步适应，毒价呈现逐代增高的趋势，在F8-F10待达到稳定，将此代次范围内的病毒液作为乙脑病毒减毒株抗原制备的毒种。表1：乙型脑炎病毒减毒株在Vero细胞上的适应性传代毒价变化(3)毒种的纯净性及免疫原性试验纯净性检验：参照《中华人民共和国兽药典》方法进行无菌检验、支原体检验和外源病毒检验。免疫原性实验：选择Vero细胞培养的F8、F9、F10代乙脑病毒液以及原代地鼠肾细胞培养的乙脑病毒液(记作PHK-SA14-14-2)，用2％血清DMEM进行10倍系列稀释，每代毒种取10－2、10－3和10－4三个稀释度，每稀释度皮下接种10～12g小白鼠10只，0.1mL/只，免疫一次，全部小白鼠于免疫后14日用乙型脑炎强毒P3株腹腔攻击，每只小白鼠腹腔注射0.3mL(不低于500*LD50)，腹腔攻击同时每只脑内空刺，破坏血脑屏障，另设同批次对照小白鼠10只，不进行免疫，但与免疫组一起进行攻毒。攻毒后3日内死亡不计，其余观察14天，对照组小白鼠应出现脑炎综合症，80％以上死亡，14天后计算各免疫组半数有效剂量(ED50)。根据各免疫组的半数有效剂量计算出半数保护剂量，半数保护剂量＝毒种毒价×半数有效剂量。结果，F8、F9、F10代Vero细胞培养乙脑病毒液无细菌、霉菌、支原体和外源病毒污染。免疫原性与原代地鼠肾细胞培养的病毒半数保护剂量相当，均符合对小白鼠的半数保护剂量≤1000PFU的要求。表2：乙型脑炎病毒减毒株的纯净性及免疫原性试验结果序号病毒种类无菌检验支原体检验外源病毒检验半数有效剂量1F8阴性阴性阴性192F9阴性阴性阴性213F10阴性阴性阴性194PHK-SA14-14-2阴性阴性阴性21实施例2采用3L转瓶制备乙型脑炎活疫苗病毒液(抗原)(1)抗原的制备技术方案1：采用3L转瓶培养Vero，培养基为含8％小牛血清的DMEM细胞培养液，待Vero细胞形成单层，弃掉细胞培养液，以pH7.4的PBS清洗3次，弃掉PBS洗液；接种适应Vero细胞的F8代乙型脑炎病毒减毒株(SA14-14-2株)0.2MOI(PFU/细胞数)，转瓶机转数为12转/小时，37℃吸附1h；添加0.22ul滤膜过滤除菌pH7.6的DMEM溶液(含有20mL/L的小牛血清、10g/L精氨酸盐酸盐、5g/LPEG2000和5g/L4-羟乙基哌嗪乙磺酸)，35℃条件下恒温培养，转瓶机转数为12转/小时；约3～4d，细胞出现75％病变，冻融一次收获病毒液，澄清过滤去掉细胞碎片，收集上清病毒液。按此方法制备疫苗抗原3批。技术方案2：病毒维持液选用0.22ul滤膜过滤除菌后pH7.6含有2％小牛血清的DMEM溶液，其他同技术方案1，按此方法制备疫苗抗原3批。技术方案3：按照猪乙型脑炎活疫苗(SA14-14-2株)生产与检验规程，采用原代地鼠肾细胞生产乙型脑炎活疫苗抗原3批。(2)毒价的测定参考实施例1的毒价测定方法进行。结果，以技术方案1制备的3批抗原毒价分别达到7.90、8.04、7.85LgPFU/mL，各批次毒价差异较小；技术方案2，采用了常规病毒培养液，制备的3批抗原毒价也可以达到7.2LgPFU/mL以上；技术方案3，采用原代地鼠肾细胞培养的抗原毒价较低，且批间差异较大，由此可见技术方案1效果最好。(3)纯净性检验参照《中华人民共和国兽药典》方法进行无菌检验、支原体检验和外源病毒检验。结果，采用技术方案1、技术方案2、技术方案3制备的9批抗原，均无细菌、霉菌、支原体、外源病毒污染。表3：3L转瓶培养乙型脑炎活疫苗抗原毒价和纯净性检测结果实施例3采用15L转瓶制备猪用乙型脑炎活疫苗(1)抗原的制备采用15L转瓶培养Vero细胞，培养基为含8％小牛血清的DMEM细胞培养液，待Vero细胞形成单层，弃掉细胞培养液，以pH7.4的PBS清洗3次，弃掉PBS洗液；接种Vero细胞的F8代乙型脑炎病毒减毒株(SA14-14-2株)0.02MOI(PFU/细胞数)，转瓶机转数为20转/小时，37℃吸附1h；添加pH7.8的病毒培养维持液DMEM(含20mL/L的小牛血清、10g/L精氨酸盐酸盐、5g/LPEG2000和5g/L4-羟乙基哌嗪乙磺酸)，35℃条件下恒温培养，转瓶机转数为20转/小时；待细胞出现75％病变，冻融一次收获病毒液，澄清过滤去掉细胞碎片，收集上清病毒液。按此方法制备制备乙脑疫苗抗原3批。(2)抗原毒价的测定抗原毒价测定方法同实施例1的毒价测定方法。结果，制备的3批抗原毒价分别达到8.00、7.95、7.76LgPFU/mL。(3)抗原的安全性检验方法1：皮下感染致病力将病毒抗原皮下接种10～12g小白鼠10只，每只注射0.1mL，同时进行脑内空刺，3日内死亡数不得超过2只，其余小白鼠继续观察14日，应全部健活。方法2：将病毒抗原以107.0PFU的剂量耳后肌肉注射40～45日龄乙脑中和抗体阴性仔猪4头，观察14日，仔猪应无不良反应。结果各批次抗原接种小鼠全部健活，接种仔猪无不良反应。表4：15L转瓶培养乙型脑炎活疫苗抗原毒价及安全性检验结果(4)疫苗的制备及毒价测定将15L转瓶Vero细胞制备的1506001批疫苗抗原与冻干保护剂(保护剂组分为明胶12g/L，蔗糖100g/L，海藻糖50g/L，PVP(K90)2.5g/L，甘露醇5g/L，谷氨酸钠10g/L，完全溶解后加入纯水至1L，并用1N的盐酸调pH值至7.5，经116℃，30分钟高压蒸汽灭菌)按照1:1混合，分装至7mL青瓶中，每瓶2mL。进行真空冷冻干燥，冻干程序为：预冻阶段－40℃，疫苗达到最低温度后维持时间2小时；升华干燥阶段疫苗最终温度－20℃，达到疫苗最终温度时运行时间17小时，冻干箱真空控制压力为0.18mbar；解析干燥阶段疫苗的最终温度28℃，冻干箱真空压力为0.005mbar，运行时间8小时。轧盖密封。疫苗命名为猪乙型脑炎传代细胞活疫苗，批号为CP-150601。采用无菌纯水将冻干疫苗溶解后进行毒价测定，方法同实施例1。结果，经换算后冻干疫苗毒价为7.80LgPFU/mL，冻干过程疫苗抗原毒价损失较小，仅为0.2LgPFU/mL。(5)疫苗对猪的安全性实验40-45日龄乙脑抗体阴性仔猪8头分为2组每组4头，一组为免疫组，颈部肌肉接种猪乙型脑炎传代细胞活疫苗(批号：CP-150601)，接种剂量为107.0PFU/头；另一组为对照组，颈部肌肉注射pH7.4PBS1mL。接种后观察14天，每天上午饲喂之前测量体温1次；接种0、1、2、3天采集血浆，采用《GB22333-2008-T日本乙型脑炎病毒反转录聚合酶链反应试验方法》测定乙脑病毒血症。结果，接种猪乙型脑炎传代细胞活疫苗的4头猪，观察期内无异常临床症状，注射部位无炎症病变，体温正常，未出现病毒血症，说明疫苗安全。(6)疫苗对猪的免疫原性试验40-45日龄乙脑抗体阴性仔猪10头分为A、B两组，每组5头，A组为免疫组，颈部肌肉接种稀释的猪乙型脑炎传代细胞活疫苗(批号：CP-150601)5.0LgPFU/mL，每头注射1mL；B组为对照组，肌肉接种pH7.4PBS1mL。接种后28天，两组动物，每头皮下注射5×106LD50乙脑病毒强毒P3株，于攻毒后第1、2、3天采集所有仔猪血浆样本，采用《GB22333-2008-T日本乙型脑炎病毒反转录聚合酶链反应试验方法》测定乙脑病毒血症，其中任一天检测出病毒血症即判为乙脑病毒感染。结果，接种5.0LgPFU猪乙型脑炎传代细胞活疫苗即可保护猪抵抗乙脑强毒的攻击，说明该疫苗对猪有较好的免疫攻毒保护作用。表5：仔猪免疫攻毒试验病毒血症检出情况虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。当前第1页1 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