一种丙酮酸羧化酶及其应用的制作方法

本发明涉及一种丙酮酸羧化酶及其应用，属于酶工程领域。

背景技术：

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为一种真核模式微生物，因具有：遗传信息丰富，代谢改造操作方便；营养需求简单，分离提取工艺成本低廉；在低pH条件下(甚至pH<3.0)生长良好；能够耐受高浓度的底物；被FDA认证为GRAS(General Regarded As Safe)微生物，发酵产品具有安全性等优点而成为发酵生产羧酸(乳酸、丙酮酸、苹果酸、延胡索酸、琥珀酸、α-酮戊二酸等)的潜在最适微生物。然而，酿酒酵母在高浓度糖及通风的条件分批发酵产生大量的乙醇，对于以羧酸为目标产物来说，乙醇的大量积累使得碳流大量的损失，且酿酒酵母本身不具备羧酸的合成途径。通过弱化乙醇途径中的关键酶的活性，可以减少通往乙醇的碳代谢流，从而减少碳流的损失；在此基础上，可通过阻止或弱化目标羧酸的进一步代谢，来构建目标羧酸的合成途径。

丙酮酸羧化酶的作用是将丙酮酸转化为草酰乙酸，进而可将碳流引入到目标羧酸的合成途径，因此，丙酮酸羧化酶的作用可形象地描述为“生物阀门”，如何强化丙酮酸羧化反应，将碳流更有效地引入到目标羧酸的合成途径，成为代谢工程改造酿酒酵母生产羧酸的一个关键问题。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种丙酮酸羧化酶，所述丙酮酸羧化酶是在氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的米根霉丙酮酸羧化酶的基础上，将第231位的脯氨酸P突变为亮氨酸L，并将第232位的精氨酸R突变为异亮氨酸I。

在本发明的一种实施方式中，编码所述亲本米根霉丙酮酸羧化酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第二个目的是提供一种表达所述突变体的基因工程菌，是以同时缺失了编码丙酮酸脱羧酶PDC1、乙醇脱氢酶ADH1、延胡索酸酶FUM1的基因的酿酒酵母为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述丙酮酸脱羧酶基因PDC1的核苷酸序列如Gene ID:850733所示，乙醇脱氢酶基因ADH1的核苷酸序列如Gene ID:854068所示，延胡索酸酶基因FUM1的核苷酸序列如Gene ID:855866所示。

本发明的第三个目的是提供一种利用表达所述突变体的基因工程菌发酵生产二元羧酸的方法。

在本发明的一种实施方式中，所述二元羧酸，包括延胡索酸、苹果酸、琥珀酸、α-酮戊二酸等。

在本发明的一种实施方式中，将过表达所述丙酮酸羧化酶的三基因缺失菌株Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C△PDC1△ADH1△FUM1的种子液，以5％的接种量转入发酵培养基于30℃、220rpm条件下培养96h。

本发明所提供的丙酮酸羧化酶可以应用于食品、饲料、化工、药物制备等领域。

本发明提供的丙酮酸羧化酶突变体的比酶活得到了21％的提高，在酿酒酵母中过量表达该丙酮酸羧化酶突变体可以有效提高二元羧酸的产量，具有很好的工业应用价值和前景。

具体实施方式

乙醇、残糖含量及延胡索酸的测定方法：采用高效液相色谱仪(HPLC)检测。发酵液经处理且上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后，利用RID(示差折光检测器)检测乙醇和残糖含量，利用VWD(紫外检测器)检测延胡索酸含量，液相色谱方法如下：高效液相色谱仪为美国Waters公司产品，型号为1515，色谱柱为Aminex HPX-87H column(Bio-Rad)。柱温：35℃；流动相：0.0275％(v/v)稀硫酸，经0.22μm滤膜过滤并除气；流速：0.6mL/min；检测时间：25min；进样量：20μL。

种子培养基：葡萄糖2％，酵母提取物1％，蛋白胨2％，去离子水容，pH自然，高压灭菌(115℃，20min)。

发酵培养基：无氨基酵母氮源3.4g/L，硫酸铵5g/L，葡萄糖40g/L，按要求分别添加亮氨酸100mg/L、色氨酸20mg/L、组氨酸20mg/L、尿嘧啶20mg/L，添加碳酸钙5g/L，装液量为40mL/250mL。

实施例1

用PCR方法进行定点突变，以pY15TEF1-RoPYC(Xu et al.Fumaric acid production in Saccharomyces cerevisiae by in silico aided metabolic engineering,2012)质粒为模板、用含有突变位点的引物、Takara公司高保真酶PrimeSTAR GXL进行PCR扩增出整个质粒。

选择测序正确的质粒，在三基因缺失菌株Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C△PDC1△ADH1△FUM1(构建方法可参考申请号201410340560.1的专利申请)中过表达丙酮酸羧化酶突变体，得到了基因工程菌。进行发酵实验，培养条件：将30℃、220rpm下培养24h的基因工程菌种子以5％的接种量转入发酵培养基于30℃、220rpm条件下培养96h。结果表明表达P231L/R232I的工程菌的富马酸产量达到了374.2mg/L，较表达野生型的丙酮酸羧化酶的菌株提高了18.7％。丙酮酸羧化酶突变体P231L/R232I相比亲本酶的比酶活，提高了21％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 曹书华

<120> 一种丙酮酸羧化酶及其应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1179

<212> PRT

<213> 米根霉

<400> 1

Met Pro Ala Ala Pro Val Arg Glu His Ser Val Asp Thr Ile Arg Arg

1 5 10 15

Asn Ser Glu Val Met Gly Asn Leu Arg Lys Leu Met Val Val Asn Arg

20 25 30

Gly Glu Ile Ala Ile Arg Val Phe Arg Thr Ala His Glu Leu Ser Met

35 40 45

Lys Thr Val Ala Ile Phe Ser His Glu Asp Arg Leu Ser Met His Arg

50 55 60

Tyr Lys Ala Asp Glu Ser Tyr Gln Leu Gly Arg Ile Gly Gln Tyr Thr

65 70 75 80

Pro Val Gly Ala Tyr Leu Ala Gln Asp Glu Val Val Arg Ile Ala Lys

85 90 95

Glu Arg Gly Val Ser Met Ile His Pro Gly Tyr Gly Phe Leu Ser Glu

100 105 110

Asn Ala Glu Phe Ala Arg Lys Val Glu Ala Ala Gly Ile Thr Phe Ile

115 120 125

Gly Pro Ser Leu Asp Val Ile Glu Ser Leu Gly Asp Lys Thr Lys Ala

130 135 140

Arg Thr Ile Ala Met Lys Cys Glu Val Pro Val Val Pro Gly Thr Pro

145 150 155 160

Gly Pro Val Ser Glu Tyr Lys Glu Ala Leu Asn Phe Ile Lys Glu Tyr

165 170 175

Gly Phe Pro Ile Ile Ile Lys Ala Ala Met Gly Gly Gly Gly Arg Gly

180 185 190

Met Arg Val Val Arg Asp Glu Ala Ser Leu Glu Asp Ala Phe Thr Arg

195 200 205

Ala Lys Ser Glu Ala Leu Ala Ala Phe Gly Asp Gly Thr Val Phe Ile

210 215 220

Glu Arg Phe Leu Asp Lys Pro Arg His Ile Glu Val Gln Leu Leu Ala

225 230 235 240

Asp Arg Ala Gly Asn Val Val His Leu Phe Glu Arg Asp Cys Ser Val

245 250 255

Gln Arg Arg His Gln Lys Val Val Glu Ile Ala Pro Ala Lys Asn Leu

260 265 270

Asp Asn Lys Val Arg Glu Ala Ile Leu Asn Asp Ala Ile Lys Ile Ala

275 280 285

Lys Ala Val Lys Tyr Lys Asn Ala Gly Thr Ala Glu Phe Leu Val Asp

290 295 300

Asn Gln Asn Arg His Tyr Phe Ile Glu Ile Asn Pro Arg Ile Gln Val

305 310 315 320

Glu His Thr Ile Thr Glu Glu Ile Thr Gly Ile Asp Ile Val Ala Ala

325 330 335

Gln Ile Gln Ile Ala Asp Gly Ala Leu Leu Pro Gln Leu Gly Leu Thr

340 345 350

Gln Gln Arg Ile Arg Gln Arg Gly Phe Ala Ile Gln Cys Arg Val Thr

355 360 365

Thr Glu Asp Pro Glu Lys Asn Phe Gln Pro Asp Thr Gly Lys Ile Glu

370 375 380

Val Tyr Arg Ser Ser Gly Gly Asn Gly Val Arg Leu Asp Gly Gly Ala

385 390 395 400

Gly Tyr Ala Gly Ala Ile Ile Thr Pro His Tyr Asp Ser Leu Leu Val

405 410 415

Lys Val Ser Cys Ser Gly Ser Thr Tyr Glu Val Ala Arg Arg Lys Ile

420 425 430

Val Arg Ala Leu Val Glu Phe Arg Ile Arg Gly Val Lys Thr Asn Ile

435 440 445

Pro Phe Leu Gln Arg Leu Leu Thr His Asp Thr Phe Ile Asn Gly Asn

450 455 460

Cys Trp Thr Thr Phe Ile Asp Asp Thr Pro Asp Leu Phe Arg Leu Val

465 470 475 480

Gln Phe Gln Asn Arg Ala Gln Arg Leu Leu Gly Tyr Leu Gly Asp Val

485 490 495

Val Val Asn Gly Ser Gln Ile Lys Gly Gln Met Gly Asp Pro Ile Leu

500 505 510

Lys Gln Glu Ile Glu Ile Pro Val Leu Arg Glu Ser Gly Ser Asp Lys

515 520 525

Thr Val Asp Val Ser Ala Pro Ala Thr Glu Gly Trp Arg Lys Ile Ile

530 535 540

Val Glu Gln Gly Pro Glu Ala Phe Ala Lys Ala Val Arg Ala Tyr Pro

545 550 555 560

Gly Val Leu Ile Thr Asp Thr Thr Trp Arg Asp Ala His Gln Ser Leu

565 570 575

Leu Ala Thr Arg Val Arg Thr Val Asp Leu Leu Arg Ile Ala Pro Ala

580 585 590

Thr Ser His Ala Leu Ala Asn Ala Phe Ser Leu Glu Cys Trp Gly Gly

595 600 605

Ala Thr Phe Asp Val Ala Met Arg Phe Leu His Glu Asp Pro Trp Asp

610 615 620

Arg Leu Ala Ala Leu Arg Lys Leu Val Pro Asn Val Pro Phe Gln Met

625 630 635 640

Leu Leu Arg Gly Ala Asn Ala Val Gly Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Asn

645 650 655

Val Ile Tyr Glu Phe Cys Asp Lys Ala Val Lys Cys Gly Met Asp Val

660 665 670

Phe Arg Ile Phe Asp Ser Leu Asn Tyr Val Glu Asn Met Arg Leu Gly

675 680 685

Ile Asp Ala Val Lys Lys Ala Gly Gly Val Val Glu Ala Thr Ile Cys

690 695 700

Tyr Thr Gly Asp Val Ser Asn Pro Asn Arg Lys Lys Tyr Asp Leu Lys

705 710 715 720

Tyr Tyr Leu Asp Leu Thr Gln Ser Leu Val Asn Glu Gly Ile His Ile

725 730 735

Leu Gly Ile Lys Asp Met Ala Gly Leu Leu Lys Pro Glu Ala Ala Lys

740 745 750

Leu Leu Val Phe Ser Ile Arg Ala Lys Phe Pro Asp Leu Pro Ile His

755 760 765

Val His Thr His Asp Thr Ala Gly Thr Gly Val Ala Ser Met Met Ala

770 775 780

Ala Ala Ala Ala Gly Ala Asp Ile Val Asp Val Ala Val Asp Ala Met

785 790 795 800

Ser Gly Met Thr Ser Gln Pro Ala Met Gly Ala Ile Val Ala Gly Leu

805 810 815

Glu Gln Thr Asn Leu Gly Thr Gly Ile Arg Met Glu Asp Ile His Ala

820 825 830

Ile Asn Ser Tyr Trp Glu Gln Cys Arg Leu Leu Tyr Ser Cys Phe Glu

835 840 845

Ala Asn Val Arg Ser Ala Asp Ser Gly Val Tyr Glu His Glu Met Pro

850 855 860

Gly Gly Gln Tyr Thr Asn Leu Met Phe Gln Ala Gln Gln Leu Gly Leu

865 870 875 880

Gly Thr Gln Trp Lys Gln Ile Lys Lys Ala Tyr Lys Glu Ala Asn Glu

885 890 895

Leu Cys Gly Asp Leu Val Lys Val Thr Pro Ser Ser Lys Val Val Gly

900 905 910

Asp Leu Ala Gln Phe Met Ala Ser Asn Gln Leu Ser Ala Lys Glu Phe

915 920 925

Glu Glu Arg Ala Ser Ser Leu Ser Leu Pro Thr Ser Val Ile Glu Phe

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Phe Gln Gly Tyr Leu Gly Gln Pro Tyr Gly Gly Phe Pro Glu Pro Leu

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Arg Ser Asn Ile Leu Arg Asp Leu Pro Arg Leu Asp Gly Arg Pro Gly

965 970 975

Ala Ser Leu Pro Pro Leu Asp Met Ala Lys Leu Lys Glu Glu Leu Val

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Glu Lys Tyr Gly Ser Ser Ile Arg Asp Tyr Asp Val Ile Ser Ala Ala

995 1000 1005

Leu Tyr Pro Lys Val Phe Ala Asp Tyr Arg Asp Thr Val Ser Gln

1010 1015 1020

Tyr Gly Asp Leu Ser Val Leu Pro Thr Arg Tyr Phe Leu Ser Lys

1025 1030 1035

Pro Glu Ile Asn Glu Glu Phe His Val Gly Ile Glu Glu Gly Lys

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Thr Leu Ile Ile Lys Leu Leu Ala Val Gly Pro Leu Asn Asn Asp

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Gly Lys Arg Asp Val Tyr Phe Glu Leu Asn Gly Glu Ala Arg Val

1070 1075 1080

Val Gly Ile Val Asp Arg Asn Ser Ala Ile Glu Ile Val Thr Arg

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Glu Lys Ala Asn Pro Ser Asn Pro Gly Asp Ile Gly Ala Pro Met

1100 1105 1110

Ser Gly Val Val Val Glu Ile Arg Ala Lys Glu Gly Ser His Val

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Thr Val Val Thr Ala Pro Val Ala Gly Arg Val Glu Arg Val Ala

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<210> 2

<211> 3540

<212> DNA

<213> 米根霉

<400> 2

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