一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的纯化方法与流程

本发明涉及生物制品纯化技术领域，具体涉及一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的纯化方法。

背景技术：

猪圆环病毒(PCV)是目前已知的最小的病毒之一，CAP蛋白是PCV2的主要抗原，能诱导中和抗体的产生。目前，流行病学调查显示，PCV2已经在世界范围内广泛分布，规模化养殖场几乎没有血清阴性的猪。自PMWS首次在加拿大爆发至今，全世界五大洲均诊断出PMWS的感染，对大多数养猪国造成了极大的威胁。

由于防治PCV2的重要性，有关PCV2疫苗的制备成为生物制品研发的热点之一。PCV2亚单位基因工程疫苗通过原核或真核表达系统表达PCV2的结构蛋白CAP，再以此来制备PCV2的病毒样颗粒(Virus like particles,VLP)。该VLP不含有病毒核酸，却具有与病毒相似的衣壳结构，能够作为抗原诱导机体免疫应答，进而产生抗体。目前，对于病毒样颗粒的纯化方案通常是沉淀法、离心法和透析法等，但是存在步骤复杂繁琐，成本较高，纯化效率低等问题。

技术实现要素：

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的纯化方法，以解决现有技术中针对病毒样颗粒的纯化方法效率较低的技术问题。

本发明要解决的另一技术问题是现有技术中针对病毒样颗粒的纯化方法在达到所需的纯度水平时步骤较为繁琐。

本发明要解决的再一技术问题是现有技术中针对病毒样颗粒的纯化方法对特定结构的病毒样颗粒艺针对性不强、纯化效果不佳、

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的纯化方法，包括以下步骤：

1)取PCV2病毒培养液，裂解细胞，得到细胞裂解液；

2)取步骤1)所得的细胞裂解液澄清处理，得到病毒澄清液；

3)取步骤2)所得的病毒澄清液浓缩8～12倍，得到病毒浓缩液；

4)取步骤3)所得的病毒浓缩液利用Sepharose 4FF分子筛层析纯化系统纯化，纯化过程中，先通过蠕动泵以1.56πr²ml/min的流速利用0.9～1.1mol/L PBS溶液进行柱平衡至紫外蛋白检测仪OD₂₈₀基线平稳，而后取步骤3)所得的病毒浓缩液上样，上样结束后利用0.9～1.1mol/L PBS溶液洗脱，收集紫外蛋白检测仪OD₂₈₀的第一洗脱峰；

其中r是层析柱半径，单位是厘米。

作为优选，步骤4)纯化之前先用无菌的0.5mol/L的NaOH溶液对Sepharose4FF分子筛层析纯化系统进行循环冲洗20～30min，再用无菌1mol/L PBS对其进行循环冲洗，至PH为6.8～7.2。

作为优选，步骤1)具体包括以下操作：取PCV2病毒培养液，反复冻融3次，固液分离取沉淀，利用PBS溶液洗涤3次，弃去上清，加入细胞裂解液裂解，固液分离取沉淀，加入细胞裂解液重悬浮，而后超声波处理。

作为优选，步骤1)所述的固液分离均是在4℃条件下以9500r/min的转速离心20min。

作为优选，步骤1)中所述加入细胞裂解液裂解是：加入4℃预冷的细胞裂解液，用枪头吹吸混匀后，冰浴20min。

作为优选，步骤1)所述超声处理是以振幅为25％的超声波每次处理10s，每两次处理之间的时间间隔30s，超声处理的总时间为30min。

作为优选，步骤2)所述澄清处理是利用孔径为0.5～0.8μm的滤板实现的。

作为优选，步骤2)中，先利用0.5mol/L NaOH溶液浸泡滤板5min，而后用1mol/L无菌PBS溶液洗涤至PH为7.0，再澄清处理步骤1)所得的细胞裂解液。

作为优选，步骤3)中对病毒澄清液的浓缩是利用孔径为100KD的中空纤维滤膜实现的。

作为优选，步骤3)中先利用0.5mol/L NaOH溶液浸泡中空纤维滤膜20～30min，而后用1mol/L无菌PBS溶液洗涤至PH为7.0，再浓缩处理步骤2)所得的病毒澄清液。

作为优选，以上技术方案中所述PCV2病毒培养液是通过中国专利文献CN105087606A所披露的方法制备的。

本发明提供了一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的纯化方法，该方法围绕PCV2病毒样颗粒的自身特性和其表达系统的特点通过实验手段开发了全新的纯化方法，该方法先综合利用冻融和超声处理手段实现细胞的裂解，而后利用滤板模块去除大量细胞碎片和大分子杂质，获得无菌澄清液，再利用100kD的中空纤维膜系统将澄清液浓缩，获得浓缩的病毒抗原溶液，最后利用Sepharose 4FF分子筛层析纯化系统以优化的操作条件层析纯化。本发明方法密切针对猪圆环病毒2型病毒样颗粒的特征设计，尤其适用于重组杆状病毒PCV2病毒样颗粒的纯化。本发明可以更高效的去除杂质，分离获得目的蛋白，实现目标抗原的有效回收。

附图说明

图1是本发明实施例中猪圆环病毒2型CAP蛋白天然表达基因与修饰后的基因核苷酸序列对照图；图中，Optimized字样代表修饰后的基因序列，Original字样代表猪圆环病毒2型CAP蛋白天然表达基因序列，二者序列存在差异的部分通过阴影表示。

图2是本发明实施例中重组杆状病毒pOET3-CAP的PCR结果；图中，M为DNA分子质量标准，1为PCV2全基因扩增产物，2为重组杆状病毒pOET3-CAP上清扩增产物，3为重组杆状病毒pOET3-CAP沉淀扩增产物，4为sf9细胞扩增产物，5为ddH₂O扩增产物。

图3是本发明实施例中表达产物的SDS-PAGE鉴定结果；图中M为蛋白质分子质量标准，1为重组杆状病毒上清，2为重组杆状病毒沉淀。

图4是本发明实施例中表达产物的Western-Blot鉴定结果；图中M为蛋白质分子质量标准，1为重组杆状病毒上清，2为重组杆状病毒沉淀。

图5本发明实施例中表达产物的间接免疫荧光鉴定图；图中，A为重组杆状病毒pOET3-CAP感染sf9细胞48h(200×)，B为正常sf9细胞培养120h(200×)。

图6为本发明实施例中表达产物的Capto Core 700层析色谱图：图中峰一为目的峰，峰二为杂质峰。

图7为本发明实施例中表达产物的各纯化样品SDS-PAGE鉴定结果：图中M为蛋白质分子质量标准，1为PCV2-CAP-P2杆毒(阳性对照)，2为PCV2-CAP-P3杆毒70KD过滤液，3为PCV2-CAP-P3杆毒70KD过滤滤膜冲洗液，4为PCV2-CAP-P3杆毒5KD浓缩液，5为PCV2-CAP-P3杆毒5KD过膜包的穿透液。

图8为本发明实施例中表达产物的各纯化样品Western-Blot鉴定结果：图中M为蛋白质分子质量标准，1为PCV2-CAP-P2杆毒(阳性对照)，2为PCV2-CAP-P3杆毒70KD过滤液，3为PCV2-CAP-P3杆毒70KD过滤滤膜冲洗液，4为PCV2-CAP-P3杆毒5KD浓缩液，5为PCV2-CAP-P3杆毒5KD过膜包的穿透液。

图9为本发明实施例中表达产物的Sepharose 4FF分子筛层析色谱图：图中峰一为目的峰，峰二为杂质峰。

具体实施方式

以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。

以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10％)的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。

除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。

以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1人工修饰PCV2CAP基因的重组杆状病毒的获得

在保持氨基酸不变的前提下，将密码子改造为杆状病毒偏嗜密码子，提高表达量。进行密码子优化时，优先选择昆虫细胞使用频率最高的密码子。以PCV2b分离株CAP基因序列(GenBank No.EU257511.1)为原始模板，根据密码子的偏爱性人工合成PCV2CAP基因的序列，修饰后的基因序列如SEQ ID NO2所示，修饰前后的基因序列对比情况如附图1所示。以上修饰前后基因所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO3所示。

人工修饰后的PCV2CAP基因片段克隆至pUC57载体，通过BamHI及XhoI双酶切，回收大量目的基因，再克隆至杆状病毒转移载体pOET3中，构建载体pOET3-PCV2-CAP。将该重组转移载体转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得大量pOET3-PCV2-CAP质粒。

按照flashBAC系统操作说明书，在sf9细胞中转染pOET3-PCV2-CAP质粒，获得重组杆状病毒pOET3-PCV2-CAP。

实施例2重组杆状病毒PCV2的鉴定

1PCR鉴定

提取P1代杆状病毒DNA(提取步骤按照天根病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒说明书进行)，用引物PCV2-CAP-S/A经PCR扩增CAP基因，以鉴定外源基因是否整合入重组杆状病毒基因组中。

2SDS-PAGE检测Cap蛋白的表达

准备100～200mL的处于对数期的细胞活性良好的sf9细胞，细胞密度2×106cells/mL。无菌接种最多0.5mL的杆状病毒到细胞中，扩增一般需要4～5天。收获病毒，3000rmp4℃离心15min，无菌收获杆毒避光保存于4℃。将收获的重组杆状病毒离心，分离上清及沉淀，沉淀用适量体积的PBS重悬，分别上样。以正常细胞作为空白对照。根据目的蛋白的分子量(目的蛋白大小：27.8KD)，配制12％分离胶，进行SDS-PAGE电泳，电泳完成后考马斯亮蓝染色2h～3h，取出，浸入脱色液中脱色至条带清晰无杂带。扫图后分析。

3Western-blot检测Cap蛋白的表达

将收获的重组杆状病毒离心，分离上清及沉淀，沉淀用适量体积的PBS重悬，分别上样。以正常细胞作为空白对照，然后电泳并转印。将转印的硝酸纤维素膜完全浸没封闭液(5％的脱脂乳)中室温封闭2h～3h。一抗4℃孵育过夜，PBS洗膜3次。用山羊抗小鼠IgG(H+L)为二抗室温孵育≤1h。PBST洗膜3次。BSA加到膜上后反应显影，显色后观察结果。

4IFA鉴定

在感染当天，准备细胞密度为5×105cells/ml的细胞悬液，将1mL细胞悬液加入到6孔板中，室温孵育1h，显微镜观察细胞，sf9细胞应该覆盖约50％面积。弃去细胞培养上清，将合适稀释度的病毒液加入6孔板中，孵育1h(或孵育过夜)，培养基孵育作为阴性对照。弃去病毒液，每孔中加入2mL培养基，继续培养。感染后48h(检测蛋白表达的最佳时段)，进行间接免疫荧光。弃去细胞培养上清，每孔加入0.5mL冰甲醇(-20℃)固定10min。弃去固定液，自然干燥10min，PBS洗三遍，每遍5min。0.1％的Triton室温孵育10min，PBS洗三遍，每遍5min。5％BSA 37℃封闭30min。弃上清。加入1:1000稀释的一抗，37℃孵育45min(或4℃孵育过夜)，PBS洗三遍，每遍5min。加入1:1000稀释的二抗(FITC标记的羊抗鼠IgG)，37℃孵育≤1h。PBS洗三遍，每遍5min。每孔加入0.5mL PBS，荧光显微镜下观察结果，可以检测到阳性信号，空白细胞则为阴性。荧光显微镜下观察结果，感染细胞可观察到强烈的荧光，而正常sf9细胞没有荧光信号，表明重组杆状病毒能表达Cap蛋白且具有很好的免疫活性。

实施例3重组杆状病毒PCV2的纯化

一初纯

将重组杆状病毒PCV2毒液9500rpm 4℃离心30min，分离上清，用PBS重悬沉淀，将沉淀反复冻融3次后用均质机破碎细胞，9500rpm 4℃离心30min，收集上清。调整样品的PH至7.5，将上清过0.45μm的滤器，滤液用作过柱样品。

二精细纯化

1装柱：按照说明书推荐比例，在柱高10cm的柱子内装填10ml Capto Core700填料，约为柱体积一半。

2水洗：用一个柱子体积(1CV)的蒸馏水清洗柱子。流速约为1.6ml/min

3平衡：用至少5CV的缓冲液平衡柱子或等到UV基线、PH和导电性都稳定。

4上样：装填不到200ml的样品过柱。收集每一个流穿峰。

5洗脱：用5到20CV的缓冲液洗柱子。

6清洗：用含有1M NaOH的30％异丙醇或27％丙醇反向清洗柱子。

平衡：用5到20CV的缓冲液平衡柱子或等到UV基线、PH和导电性都达到需要值。

实施例4重组杆状病毒PCV2的纯化

一裂解

将重组杆状病毒PCV2毒液反复冻融3次，置于离心管中，9500rpm 4℃离心20min，PBS洗涤3次，弃去上清。在沉淀的细胞泥中加入适量4℃预冷的细胞裂解液，用枪头吹吸混匀后，冰上作用20min。4℃9500r/min离心20min，弃去上清。加入适量4℃预冷的细胞裂解液，重悬沉淀，然后超声(振幅25％)处理，每次10s间隔30s，超声30min。

二澄清

将滤板模块CH ST110(P)(0.5-0.8μm)装入简易装置中，组装完毕后用无菌0.5mol/L NaOH溶液对系统进行浸泡处理5min。用无菌1mol/L PBS溶液对系统进行循环冲洗，洗去残余的溶液，直至PH为7.0左右。将重组杆状病毒PCV2CAP毒液通过上述滤板，去除大量细胞碎片和大分子杂质，获得无菌澄清液。

三浓缩

用无菌0.5mol/L NaOH溶液对100kD中空纤维膜系统进行浸泡处理至少20min。用无菌1mol/L PBS对系统进行循环冲洗，洗去残余的溶液，直至PH为7.0左右。取滤板过滤液通过100kD中空纤维膜进行纯化处理，将毒液浓缩10倍，分别留存浓缩液及透过液，准备检测。

四层析纯化

用无菌0.5mol/L NaOH溶液对Sepharose 4FF分子筛层析纯化系统进行循环冲洗20～30min。用无菌1mol/L PBS对系统进行循环冲洗，洗去残余的溶液，直至PH为7.0左右。

将层析柱进液管连接至蠕动泵，出液管连接至紫外蛋白检测仪(可连接电脑采集数据或记录仪进行记录)。开启蠕动泵设置流速v＝1.56πr2ml/min(r表示层析柱半径)，用1mol/L PBS进行柱平衡直至紫外检测OD280基线平稳，暂停蠕动泵。将蠕动泵进液管插入抗原浓缩液中启动蠕动泵开始上样。上样结束后暂停蠕动泵，将其进液管移入无菌1mol/L PBS中启动蠕动泵进行洗脱。紫外检测OD280值增加时开始收集第一洗脱峰，OD280值降至最低时停止收集。继续洗脱层析柱至抗原液全部流出柱体，进行下一次上样。

五纯化样品的测定

对各阶段纯化样品进行SDS-PAGE、Western-blot检测。实验结果可以看出，实施例4的纯化工艺经过裂解、澄清、浓缩和层析纯化的工艺流程，可以更高效的去除杂质，分离出目的蛋白，达到有效回收目的抗原地目的，提供了一种针对重组杆状病毒PCV2的纯化方法。

实施例5

一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的纯化方法，包括以下步骤：

1)取PCV2病毒培养液，裂解细胞，得到细胞裂解液；

2)取步骤1)所得的细胞裂解液澄清处理，得到病毒澄清液；

3)取步骤2)所得的病毒澄清液浓缩8倍，得到病毒浓缩液；

4)取步骤3)所得的病毒浓缩液利用Sepharose 4FF分子筛层析纯化系统纯化，纯化过程中，先通过蠕动泵以1.56πr²ml/min的流速利用0.9mol/L PBS溶液进行柱平衡至紫外蛋白检测仪OD₂₈₀基线平稳，而后取步骤3)所得的病毒浓缩液上样，上样结束后利用0.9mol/L PBS溶液洗脱，收集紫外蛋白检测仪OD₂₈₀的第一洗脱峰；

其中r是层析柱半径，单位是厘米。

在以上技术方案的基础上，满足以下条件：

步骤4)纯化之前先用无菌的0.5mol/L的NaOH溶液对Sepharose 4FF分子筛层析纯化系统进行循环冲洗20min，再用无菌1mol/L PBS对其进行循环冲洗，至PH为6.8。

步骤1)具体包括以下操作：取PCV2病毒培养液，反复冻融3次，固液分离取沉淀，利用PBS溶液洗涤3次，弃去上清，加入细胞裂解液裂解，固液分离取沉淀，加入细胞裂解液重悬浮，而后超声波处理。

步骤1)所述的固液分离均是在4℃条件下以9500r/min的转速离心20min。

步骤1)中所述加入细胞裂解液裂解是：加入4℃预冷的细胞裂解液，用枪头吹吸混匀后，冰浴20min。

步骤1)所述超声处理是以振幅为25％的超声波每次处理10s，每两次处理之间的时间间隔30s，超声处理的总时间为30min。

步骤2)所述澄清处理是利用孔径为0.5μm的滤板实现的。

步骤2)中，先利用0.5mol/L NaOH溶液浸泡滤板5min，而后用1mol/L无菌PBS溶液洗涤至PH为7.0，再澄清处理步骤1)所得的细胞裂解液。

步骤3)中对病毒澄清液的浓缩是利用孔径为100KD的中空纤维滤膜实现的。

步骤3)中先利用0.5mol/L NaOH溶液浸泡中空纤维滤膜20min，而后用1mol/L无菌PBS溶液洗涤至PH为7.0，再浓缩处理步骤2)所得的病毒澄清液。

实施例6

一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的纯化方法，包括以下步骤：

1)取PCV2病毒培养液，裂解细胞，得到细胞裂解液；

2)取步骤1)所得的细胞裂解液澄清处理，得到病毒澄清液；

3)取步骤2)所得的病毒澄清液浓缩12倍，得到病毒浓缩液；

4)取步骤3)所得的病毒浓缩液利用Sepharose 4FF分子筛层析纯化系统纯化，纯化过程中，先通过蠕动泵以1.56πr²ml/min的流速利用1.1mol/L PBS溶液进行柱平衡至紫外蛋白检测仪OD₂₈₀基线平稳，而后取步骤3)所得的病毒浓缩液上样，上样结束后利用1.1mol/L PBS溶液洗脱，收集紫外蛋白检测仪OD₂₈₀的第一洗脱峰；

其中r是层析柱半径，单位是厘米。

在以上技术方案的基础上，满足以下条件：

步骤4)纯化之前先用无菌的0.5mol/L的NaOH溶液对Sepharose 4FF分子筛层析纯化系统进行循环冲洗30min，再用无菌1mol/L PBS对其进行循环冲洗，至PH为7.2。

步骤1)具体包括以下操作：取PCV2病毒培养液，反复冻融3次，固液分离取沉淀，利用PBS溶液洗涤3次，弃去上清，加入细胞裂解液裂解，固液分离取沉淀，加入细胞裂解液重悬浮，而后超声波处理。

步骤1)所述的固液分离均是在4℃条件下以9500r/min的转速离心20min。

步骤1)中所述加入细胞裂解液裂解是：加入4℃预冷的细胞裂解液，用枪头吹吸混匀后，冰浴20min。

步骤1)所述超声处理是以振幅为25％的超声波每次处理10s，每两次处理之间的时间间隔30s，超声处理的总时间为30min。

步骤2)所述澄清处理是利用孔径为0.8μm的滤板实现的。

步骤2)中，先利用0.5mol/L NaOH溶液浸泡滤板5min，而后用1mol/L无菌PBS溶液洗涤至PH为7.0，再澄清处理步骤1)所得的细胞裂解液。

步骤3)中对病毒澄清液的浓缩是利用孔径为100KD的中空纤维滤膜实现的。

步骤3)中先利用0.5mol/L NaOH溶液浸泡中空纤维滤膜30min，而后用1mol/L无菌PBS溶液洗涤至PH为7.0，再浓缩处理步骤2)所得的病毒澄清液。

实施例7

一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的纯化方法，包括以下步骤：

1)取PCV2病毒培养液，裂解细胞，得到细胞裂解液；

2)取步骤1)所得的细胞裂解液澄清处理，得到病毒澄清液；

3)取步骤2)所得的病毒澄清液浓缩10倍，得到病毒浓缩液；

4)取步骤3)所得的病毒浓缩液利用Sepharose 4FF分子筛层析纯化系统纯化，纯化过程中，先通过蠕动泵以1.56πr²ml/min的流速利用1mol/L PBS溶液进行柱平衡至紫外蛋白检测仪OD₂₈₀基线平稳，而后取步骤3)所得的病毒浓缩液上样，上样结束后利用1mol/L PBS溶液洗脱，收集紫外蛋白检测仪OD₂₈₀的第一洗脱峰；

其中r是层析柱半径，单位是厘米。

在以上技术方案的基础上，满足以下条件：

步骤4)纯化之前先用无菌的0.5mol/L的NaOH溶液对Sepharose 4FF分子筛层析纯化系统进行循环冲洗25min，再用无菌1mol/L PBS对其进行循环冲洗，至PH为7。

步骤1)具体包括以下操作：取PCV2病毒培养液，反复冻融3次，固液分离取沉淀，利用PBS溶液洗涤3次，弃去上清，加入细胞裂解液裂解，固液分离取沉淀，加入细胞裂解液重悬浮，而后超声波处理。

步骤2)所述澄清处理是利用孔径为0.6μm的滤板实现的。

步骤3)中对病毒澄清液的浓缩是利用孔径为100KD的中空纤维滤膜实现的。

实施例8

一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的纯化方法，包括以下步骤：

1)取PCV2病毒培养液，裂解细胞，得到细胞裂解液；

2)取步骤1)所得的细胞裂解液澄清处理，得到病毒澄清液；

3)取步骤2)所得的病毒澄清液浓缩10倍，得到病毒浓缩液；

4)取步骤3)所得的病毒浓缩液利用Sepharose 4FF分子筛层析纯化系统纯化，纯化过程中，先通过蠕动泵以1.56πr²ml/min的流速利用1mol/L PBS溶液进行柱平衡至紫外蛋白检测仪OD₂₈₀基线平稳，而后取步骤3)所得的病毒浓缩液上样，上样结束后利用1mol/L PBS溶液洗脱，收集紫外蛋白检测仪OD₂₈₀的第一洗脱峰；

其中r是层析柱半径，单位是厘米。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津瑞普生物技术股份有限公司

<120> 一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的纯化方法

<160> 2

<210> 1

<211> 708

<212> DNA

<213> 天然序列（猪圆环病毒2型CAP蛋白天然表达基因）

<400> 1

ATGACGTATC CAAGGAGGCG TTACCGGAGA AGAAGACACC 40

GCCCCCGCAG CCATCTTGGC CAGATCCTCC GCCGCCGCCC 80

CTGGCTCGTC CACCCCCGCC ACCGTTACCG CTGGAGAAGG 120

AAAAATGGCA TCTTCAACAC CCGCCTCTCC CGCACCTTCG 160

GATATACTAT CAAGCGAACC ACAGTCAAAA CGCCCTCCTG 200

GGCGGTGGAC ATGATGAGAT TCAATATTAA TGACTTTCTT 240

CCCCCAGGAG GGGGCTCAAA CCCCCGCTCT GTGCCCTTTG 280

AATACTACAG AATAAGAAAG GTTAAGGTTG AATTCTGGCC 320

CTGCTCCCCG ATCACCCAGG GTGACAGGGG AGTGGGCTCC 360

AGTGCTGTTA TTCTAGATGA TAACTTTGTA ACAAAGGCCA 400

CAGCCCTCAC CTATGACCCC TATGTAAACT ACTCCTCCCG 440

CCATACCATA ACCCAGCCCT TCTCCTACCA CTCCCGCTAC 480

TTTACCCCCA AACCTGTCCT AGATTCCACT ATTGATTACT 520

TCCAACCAAA CAACAAAAGA AATCAGCTGT GGCTGAGACT 560

ACAAACTGCT GGAAATGTGG ACCACGTAGG CCTCGGCATT 600

GCGTTCGAAA ACAGTATATA CGACCAGGAA TACAATATCC 640

GTGTAACAAT GTATGTACAA TTCAGAGAAT TTAATTTAAA 680

GACCCCCCAC TTAACCCTTA ATGAATAA 708

<210> 2

<211> 708

<212> DNA

<213> 人工序列（修饰后的猪圆环病毒2型CAP蛋白表达基因）

<400> 2

ATGACATACC CAAGAAGAAG ATACAGACGC AGAAGACACA 40

GACCCCGTTC GCACCTCGGA CAAATCCTGA GAAGAAGACC 80

GTGGCTCGTG CACCCAAGGC ATAGATACCG CTGGCGCCGT 120

AAGAACGGCA TCTTCAACAC GAGATTGTCT CGCACGTTCG 160

GATACACCAT TAAGCGTACC ACTGTGAAAA CCCCGTCATG 200

GGCTGTCGAC ATGATGAGGT TCAACATCAA CGATTTCCTG 240

CCTCCCGGTG GCGGTTCCAA CCCAAGAAGC GTCCCGTTCG 280

AGTACTACCG TATCAGGAAG GTGAAAGTCG AATTCTGGCC 320

TTGCTCCCCC ATTACTCAGG GTGACCGTGG TGTCGGCTCC 360

AGCGCCGTTA TCCTGGACGA TAACTTCGTT ACCAAGGCTA 400

CTGCCCTCAC ATACGACCCT TACGTGAACT ACTCTTCAAG 440

ACACACAATT ACGCAGCCCT TCAGTTACCA TTCGCGCTAC 480

TTCACTCCAA AGCCGGTCCT CGACAGTACA ATCGATTACT 520

TCCAACCTAA CAACAAACGT AACCAGCTGT GGCTCAGGTT 560

GCAAACTGCA GGCAACGTTG ACCACGTGGG ACTGGGTATC 600

GCGTTCGAGA ACAGCATTTA CGATCAAGAA TACAACATCC 640

GCGTTACAAT GTACGTCCAG TTCAGAGAGT TCAACCTCAA 680

AACCCCCCAC CTCACCCTCA ACGAGTAA 708