基于Gluc荧光素酶的二硫键蛋白及制备方法与流程

本发明涉及蛋白制备技术领域，尤其是涉及一种基于Gluc荧光素酶的二硫键蛋白及制备方法。

背景技术：

医学影像技术是探究体内细微生命的重要方法，它可实现分子水平上高靶向地对活体内疾病的发生、生长进行治疗，是一种新的健康医疗模式。医学影像技术主要包括核磁共振MRI、CT、医学超声以及光学成像等。生物发光成像(Bioluminescence imaging)是光学成像中的一种重要的成像手段，它具有无需光源激发，无散射、穿透率高、极低的背景干扰和极高信噪比等优点。其在有氧的条件下，以荧光素酶作为体内报告源，通过与底物作用而发光。近年来已被广泛应用于生命科学、医学研究及药物研发等领域。

作为报告基因，荧光素酶需要具备某些特定的条件，如具有明显的光谱特征，高量子产率且底物在细胞内无累积等。Gaussia luciferase(Gluc)是从夏威夷的一种海洋桡足类动物中获取的荧光素酶，它具有2个独特的domain区域，且都有生物发光活性，由185个氨基酸组成，大小19.9KDa且以肠腔素作为底物。因其超高的荧光强度，良好的酶稳定性和分泌活性，被广泛用于开发生物发光成像检测系统对基因分子事件、蛋白质相互作用、细胞生命活动、动物生理病理等生物学过程实时监控。而且，Gluc中含有11个半胱氨酸，占氨基酸数量的5.95％，研究更显示，Gluc中的10个半胱氨酸通过共价键可以形成5对二硫键，其中一对二硫键处于2个domain区域之间，而其他二硫键都在domain区域内部中形成，因此，Gluc也被称之为二硫键蛋白(Disulfide bonded protein)。Gluc作为一种二硫键蛋白，其面临的最大困难是如何在大肠杆菌表达中形成可溶并完全正确折叠的二硫键蛋白，因为二硫键的正确折叠对于蛋白质的稳定性，活性等具有至关重要的影响。而大肠杆菌中蛋白的高效表达往往难以预期，特别是对于Gluc这样一种高度含有二硫键的蛋白质，更是不可控。因此，Gluc荧光素酶在应用中也存在一些局限性，主要包括信号猝灭，在体外吸收蓝光会迅速光衰减等，这使其应用遇到了极大的瓶颈。

因此，如何优化其光学稳定性，建立对个体的长时间、可重复性、可稳定控制的跟踪成像体系是亟待解决的问题。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种基于Gluc荧光素酶的二硫键蛋白的制备方法，该方法解决了荧光素酶光学稳定性差，荧光猝灭迅速的问题，还解决了由于Gluc荧光素酶含有多组二硫键导致其在大肠杆菌中表达时，难以实现可溶性和二硫键的正确折叠从而使其在实际生物发光成像应用中受到限制的问题。

本发明的另一个目的在于提供由上述制备方法制得的基于Gluc荧光素酶的二硫键蛋白，该二硫键蛋白具有高的光稳定性。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种基于Gluc荧光素酶的二硫键蛋白的制备方法，该方法包括在Gluc荧光素酶基因的C端引入SEP-tag，将连接有SEP标签的Gluc荧光素酶基因插入表达载体的多克隆位点，得到荧光素酶Gluc-SEP基因表达载体，将该表达载体转化到同时具有trxB^-/gor^-抗性基因和DsbC氧化还原基因的大肠杆菌菌株，得到含有该表达载体的表达菌株，培养该表达菌株，表达得到基于Gluc荧光素酶的二硫键蛋白。

优选地，所述方法还包括在连接有SEP标签的Gluc荧光素酶基因的N端引入纯化标签。

优选地，，所述表达载体为pET系列表达载体，所述pET系列表达载体包括pET28a、pET21a、pET25b、pET27b或pET30a。

优选地，所述纯化标签包括His6、GST、Strep或CBD。

优选地，所述多克隆位点为BamH I和Sal I酶切位点、BamH I和Hind III酶切位点、BamH I和Not I酶切位点、BamH I和Xho I酶切位点、Nde I和Sal I酶切位点、Nde I和Hind III酶切位点、Nde I和Not I酶切位点或Nde I和Xho I酶切位点。

优选地，所述同时具有trxB^-/gor^-抗性基因和DsbC氧化还原基因的大肠杆菌菌株包括SHuffle T7B E.coli菌株或SHuffle T7K12E.coli菌株。

优选地，所述方法中用IPTG诱导连接有SEP标签的Gluc荧光素酶基因的表达，其中，IPTG的浓度为1mmol/L，诱导温度为35-37℃，诱导时间为5-8h；或诱导温度为14-18℃，诱导时间为10-14h。

优选地，所述方法中还包括将得到的基于Gluc荧光素酶的二硫键蛋白进行纯化的步骤。

由所述制备方法制得的基于Gluc荧光素酶的二硫键蛋白的二级结构具有大于80％的α-螺旋结构。

优选地，所述二硫键蛋白具有下述一种或几种特性：

光谱最高发射峰为480nm，或

光衰减的半衰期为6min，或

在60℃孵育30min后活性保持在85％以上，或

从25℃到95℃过程中，二级结构组成没有变化。

本发明的有益效果如下：

本发明在Gluc的C端引入一个SEP-tag(GDDD–GDDD GDDD)促进了大部分的二硫键的正确折叠，将C端带有SEP-tag的Gluc基因转入到同时具有trxB^-/gor^-抗性基因和DsbC氧化还原基因的大肠杆菌菌株中，有效减少了因大肠杆菌在表达过程中逐渐形成的缺氧环境而使二硫键正确折叠的氧化环境缺失的问题，构建的表达菌株进行蛋白表达后，得到的蛋白荧光活性非常强，并且圆二色谱CD热力学研究显示其二级结构的热稳定非常好，从常温到95℃的高温，其二级结构没有发生任何改变。

附图说明

图1为实施例3和对比例1的荧光光谱发射峰的比较图；

图2实施例3和对比例1的荧光活性比较图；

图3为实施例3和对比例1的荧光活性衰减动力学的比较图；

图4为实施例3和对比例1的热稳定性比较图；

图5为实施例3和对比例1的圆二色谱峰比较图；

图6A为对比例1的圆二色谱热力学稳定性图；

图6B为实施例3的圆二色谱热力学稳定性图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明的发明人通过对Gluc荧光素酶结构的理性分析，得出大肠杆菌中表达的Gluc荧光素酶之所以稳定性差，光信号衰减快，主要有两方面的原因：

1.Gluc作为一种二硫键蛋白，难以在大肠杆菌表达中形成可溶并完全正确折叠的二硫键蛋白；

2.如何提供二硫键正确折叠所需要的氧化环境；

而传统的提高Gluc荧光素酶稳定性和荧光强度的策略主要是通过构建随机突变体文库，从中筛选优势性能的Gluc荧光素酶突变体，工作量大，比较繁琐并且盲目性较大。

所以，本发明的发明人基于对Gluc荧光素酶结构的理性分析，

通过在Gluc的C端引入一个SEP-tag(GDDD–GDDD–GDDD)；然后选择同时具有trxB^-/gor^-抗性基因和DsbC氧化还原基因的大肠杆菌菌株提供二硫键正确折叠所需要的氧化环境而解决了上述问题。

本发明的上述方法构思也适用于其他二硫键蛋白，如vtPA N-HIS、AppA、Cel9A、PhoA、Chitinase和CelZ等。

实施例1

荧光素酶Gluc-SEP基因表达载体的构建

1.引物

正向引物：

5’-CGCGGATCCATGAAGCCCACCGAGAACAACGAA-3’；(SEQ ID NO：1)

反向引物：

5’-ACGCCGTCGACGTCGTCGTCTCCGTCGTCGTCTCCGTCACCACCGGCCCCCTTGATCTT-3’(SEQ ID NO：2)

2.Gluc荧光素酶基因的PCR扩增

PCR反应体系：

5μL 10×High Figelity PCR buffer，15mM MgCl₂,1mM dNTP Mix,0.3μM正向引物，0.3μM反向引物，10pg模板量，1.25U High Fidelity PCR Enzyme Mix,最后补充双蒸水至总体系为50μL；

PCR反应条件：

94℃预变性3min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s，反应循环25次，最后72℃终延伸10min。

3.荧光素酶Gluc-SEP基因表达载体的构建

将上述步骤2获得的含有Gluc荧光素酶基因的PCR扩增产物用限制性内切酶BamH I和Sal I进行双酶切，酶切产物与用同样酶切的载体pET28a用T4DNA连接酶进行连接，得到荧光素酶Gluc-SEP基因表达载体；

插入的荧光素酶Gluc基因的序列如下：

ATGAAGCCCACCGAGAACAACGAAGACTTCAACATCGTGGCCGTGGCCAGCAACTTCGCGACCACGGATCTCGATGCTGACCGCGGGAAGTTGCCCGGCAAGAAGCTGCCGCTGGAGGTGCTCAAAGAGATGGAAGCCAATGCCCGGAAAGCTGGCTGCACCAGGGGCTGTCTGATCTGCCTGTCCCACATCAAGTGCACGCCCAAGATGAAGAAGTTCATCCCAGGACGCTGCCACACCTACGAAGGCGACAAAGAGTCCGCACAGGGCGGCATAGGCGAGGCGATCGTCGACATTCCTGAGATTCCTGGGTTCAAGGACTTGGAGCCCATGGAGCAGTTCATCGCACAGGTCGATCTGTGTGTGGACTGCACAACTGGCTGCCTCAAAGGGCTTGCCAACGTGCAGTGTTCTGACCTGCTCAAGAAGTGGCTGCCGCAACGCTGTGCGACCTTTGCCAGCAAGATCCAGGGCCAGGTGGACAAGATCAAGGGGGCCGGTGGTGAC；(SEQ ID NO：3)

标签SEP-tag的基因序列如下：

GGAGACGACGACGGAGACGACGAC。(SEQ ID NO：4)

实施例2

Gluc-SEP-Shuffle表达菌株的制备

将实施例1的荧光素酶Gluc-SEP基因表达载体在42℃热处理转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α，经37℃培养复苏并涂布到LB平板(含有25μg/ml卡那霉素)筛选，挑取菌落进行菌落PCR和双酶切鉴定阳性克隆，筛选到的阳性菌株经培养后提取质粒，最后进行基因测序鉴定；之后将测序鉴定正确的质粒热处理转化到SHuffle T7B E.coli表达菌株，并进行甘油菌保种冻存以备用。

实施例3

Gluc-SEP-Shuffle蛋白的表达及纯化

首先将冻存的甘油菌Gluc-SEP-SHuffle接种到LB液体培养基(含有25μg/ml氨苄青霉素)中，37℃，225rpm培养过夜活化菌株，其次按1:100的比例将活化的菌液接种到新鲜的LB液体培养基(含有100μg/ml氨苄青霉素)中，培养至OD600达到0.4-0.6，即为菌种的生长对数期，然后加入诱导剂异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷IPTG(终浓度为1mM)在37℃诱导蛋白表达7h，4℃下11000rpm离心10min收集菌体，弃去上清LB培养基，加入一定量的结合缓冲液(20mM Na₃PO₄，0.5M NaCl，40mM咪唑溶液，pH 7.4)悬浮菌体，利用超声波破碎菌体，超声3sec，间隔4sec，超声直至溶液完全澄清透明后于4℃离心高速分离去除不溶性蛋白，获得上清可溶性蛋白；利用Ni柱中的填料硫酸镍与表达载体上的组氨酸标签融合蛋白能特异性结合的原理去除杂蛋白，再用咪唑洗脱液(20mM Na₃PO₄，0.5MNaCl，150mM咪唑溶液，pH 7.4)的竞争性结合到Ni柱填料，将组氨酸融合蛋白从柱子上洗脱下来，得到的蛋白经透析去除咪唑得到Gluc荧光素酶目的蛋白(Gluc-SEP-Shuffle蛋白)。

对比例1

1.Gluc-SEP-BL21(DE3)表达菌株的制备

将实施例1的荧光素酶Gluc-SEP基因表达载体在42℃热处理转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α，经37℃培养复苏并涂布到LB平板(含有25μg/ml卡那霉素)筛选，挑取菌落进行菌落PCR和双酶切鉴定阳性克隆，筛选到的阳性菌株经培养后提取质粒，最后进行基因测序鉴定；之后将测序鉴定正确的质粒热处理转化到BL21(DE3)大肠杆菌，并进行甘油菌保种冻存以备用；

2.Gluc-SEP-BL21(DE3)蛋白的表达及纯化

首先将冻存的甘油菌Gluc-SEP-BL21(DE3)接种到LB液体培养基(含有25μg/ml氨苄青霉素)中，37℃，225rpm培养过夜活化菌株，其次按1:100的比例将活化的菌液接种到新鲜的LB液体培养基(含有100μg/ml氨苄青霉素)中，培养至OD600达到0.4-0.6，即为菌种的生长对数期，然后加入诱导剂异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷IPTG(终浓度为1mM)在25℃诱导蛋白表达4h，4℃下11000rpm离心10min收集菌体，弃去上清LB培养基，加入一定量的结合缓冲液(20mM Na₃PO₄，0.5M NaCl，40mM咪唑溶液，pH7.4)悬浮菌体，利用超声波破碎菌体，超声3sec，间隔4sec，超声直至溶液完全澄清透明后于4℃离心高速分离去除不溶性蛋白，获得上清可溶性蛋白；利用Ni柱中的填料硫酸镍与表达载体上的组氨酸标签融合蛋白能特异性结合的原理去除杂蛋白，再用咪唑洗脱液(20mM Na₃PO₄，0.5MNaCl，150mM咪唑溶液，pH 7.4)的竞争性结合到Ni柱填料，将组氨酸融合蛋白从柱子上洗脱下来，得到的蛋白经透析去除咪唑得到Gluc荧光素酶目的蛋白(Gluc-SEP-BL21(DE3)蛋白)。

取实施例3和对比例1的Gluc荧光素酶目的蛋白进行生物发光分析:

Gluc荧光素酶生物发光的反应是以肠腔素(coelenterazine)作为催化底物的，底物的贮存液采用乙醇配至浓度为0.5mg/ml，并贮存在-80℃冰箱备用。

光谱分析：2种Gluc荧光素酶目的蛋白的光谱分析都采用Tecan Infinite M1000 PRO多功能酶标仪检测，并使用Corning黑色透明底96孔板进行反应，其中反应总体系为200μL，加入荧光素酶的量为0.2μM，底物量为5.9μM，其余的用1×PBS缓冲液进行补充。检测的参数设定为扫描范围为200-400nm，间隔时间为800ms，峰宽为20nm。

生物发光活性分析：2种Gluc荧光素酶目的蛋白的生物发光活性分析都采用Perkin Elmer VICTOR X4多标记微孔板检测仪进行检测，并使用Greine白色96孔板进行反应，其中反应总体系为200μL，加入荧光素酶的量为1pmol，底物量为5.9μM，其余的用1×PBS缓冲液进行补充。检测的滤光片设定为480/40nm。同时分别取等量的酶液于60℃孵育30min后测定其生物发光热稳定性。

结论：

图1中是实施例3和对比例1的荧光光谱发射峰的比较，其中Gluc-SEP-SHuffle的发射峰在480nm，Gluc-SEP-BL21(DE3)的发射峰在477nm，通过比较得知Gluc-SEP-SHuffle具有较高的荧光强度。

图2中是实施例3和对比例1的荧光活性比较；其中Gluc-SEP-Shuffle具有比Gluc-SEP-BL21(DE3)高达2倍的活性。

图3中是实施例3和对比例1的荧光活性衰减动力学的比较；其中Gluc-SEP-Shuffle的半衰期高达6min，而Gluc-SEP-BL21(DE3)的半衰期不到1min。

图4中是实施例3和对比例1的热稳定性比较；其中Gluc-SEP-SHuffle在60℃孵育30min后活性能保留80％以上，而Gluc-SEP-BL21(DE3)的活性只能保留60％。

对实施例3和对比例1的Gluc荧光素酶目的蛋白的二级结构进行圆二色谱CD分析:

2种Gluc荧光素酶目的蛋白的二级结构都采用Jasco J-815圆二色谱进行分析，采用的比色皿的光学量程为1mm，所有的样品都经过提前预处理更换缓冲液为圆二色谱检测缓冲液20mM磷酸钠溶液(pH为7.2-7.4)，所检测的蛋白浓度稀释到0.2mg/ml。设定圆二色谱参数为：扫描范围250-190nm，灵敏度100mdeg，数据间距0.5nm，连续的扫描模式，扫描速度100nm/min，间隔时间1s，峰宽1nm，测定3次平均。圆二色谱热力学分析选用不同的温度分别为25℃、45℃、65℃、85℃和95℃。在测定样品前首先测定圆二色谱缓冲液的背景值，并设置扣除缓冲液背景，最后才进行样品分析。所有的数据经过一个圆二色谱分析网(http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk/html/home.shtml)进行处理，其中分析模式选择SELCONS和set 4，最后计算Gluc荧光素酶的二级结构组成。

结论：

图5中是实施例3和对比例1的圆二色谱峰比较；其中Gluc-SEP-SHuffle表现了极强的信号值。

图6A是对比例1的圆二色谱热力学稳定性图，图6B是实施例3的圆二色谱热力学稳定性图，温度设定为25℃到95℃；比较图6A和6B，从光谱图看变化不大。

实施例3和对比例1的二级结构组成比较，如表1所示，

表1

表1中Gluc-SEP-SHuffle从常温25℃到高温95℃，二级结构没有任何改变，是由大部分α-螺旋(包括58.2％α-螺旋，22.2％的扭曲α-螺旋)、无序状(14.4％)和少数转角(5.2％)结构组成的；而Gluc-SEP-BL21(DE3)二级结构发生了极大的变化，特别是没有完全正确折叠的部分β-折叠在加热中可以逐渐形成α-螺旋结构直至稳定。其中α_R为α-螺旋，α_D为扭曲α-螺旋结构，β_R为β-折叠结构，β_D为扭曲β-折叠结构，T为转角结构，U为无序结构。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

<110> 中国科学院深圳先进技术研究院

<120> 基于Gluc荧光素酶的二硫键蛋白及制备方法

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cgcggatcca tgaagcccac cgagaacaac gaa 33

<210> 2

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

acgccgtcga cgtcgtcgtc tccgtcgtcg tctccgtcac caccggcccc cttgatctt 59

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<211> 507

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgaagccca ccgagaacaa cgaagacttc aacatcgtgg ccgtggccag caacttcgcg 60

accacggatc tcgatgctga ccgcgggaag ttgcccggca agaagctgcc gctggaggtg 120

ctcaaagaga tggaagccaa tgcccggaaa gctggctgca ccaggggctg tctgatctgc 180

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tacgaaggcg acaaagagtc cgcacagggc ggcataggcg aggcgatcgt cgacattcct 300

gagattcctg ggttcaagga cttggagccc atggagcagt tcatcgcaca ggtcgatctg 360

tgtgtggact gcacaactgg ctgcctcaaa gggcttgcca acgtgcagtg ttctgacctg 420

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gacaagatca agggggccgg tggtgac 507

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ggagacgacg acggagacga cgac 24