本发明涉及基因工程
技术领域：
，更具体的说是涉及一种异丁香酚单加氧酶操纵子基因及其重组载体和重组假单胞菌。
背景技术：
：香兰素学名3-甲氧基-4-羟基苯甲醛，也称之为香草醛。目前香兰素产品的主要用途有食品添加剂、医药中间体、饲料添加剂与其它(如电镀增亮剂等)四个方面，各种用途的使用比例分别为食品添加剂接近50％、医药中间体接约20％、饲料添加剂约20％与其它用途约10％。作为食品添加剂，香兰素可广泛运用在各种需要增加奶香气息的调香食品中，如蛋糕、冷饮、巧克力、糖果、饼干、方便面、面包及各种炒货产品中。除用作食品添加剂外，作为香料产品还广泛应用于日化香精与烟用香精的调配。香兰素按原料与生产方法可以分为天然香兰素与合成香兰素二种。香兰素天然存在于香荚兰豆、秘鲁香膏油、丁香花蕾油中，天然香兰素主要来自于香荚兰豆与利用天然原料通过生物技术合成二种途经，仅在少量有特殊需要的场合使用，实际使用的香兰素主要是合成香兰素。大多数化学合成的香兰素在纯度、香气、安全性等方面都亚于天然提取的香兰素，并且化学工业废弃物对环境存在很大的危害。随着社会的发展，人们对高品质绿色健康产品的追求，对安全性要求的提高，使得天然香兰素供不应求。因此，急切需要寻找一种生产天然安全的香精香料的方法。在生物技术不断发展的今天，研究者将目光集中到如何将生物技术运用于制备天然香精香料。在过去十几年里，研究者报道以各种前体通过生物转化的方式合成香兰素，但都存在着原料成本高、反应转化效率低、反应步骤长、工艺步骤复杂，因此在工业化生产方面受到很大的限制。异丁香酚单加氧酶能够将丁香酚、异丁香酚等底物转化为香兰素，是制备生物香兰素的高效途径。但目前现有已知的天然异丁香酚单加氧酶的野生型菌株，其菌株的产酶能力较弱，远远难以满足工业生产的需要，且由于野生型菌株其安全性不可预知，在生产食品及药品用香兰素时，难以获得市场准入许可，并且增加了食品药品的安全风险。另外，目前已知的表达异丁香酚单加氧酶的基因工程重组菌株，其表达载体的宿主为大肠杆菌或者酵母菌，其对异丁香酚、阿魏酸、香兰素等芳香酚、芳香醛等有机物的耐受性能较低，导致其表达效率及酶产量较低，进而影响到香兰素的产量。此外，异丁香酚单加氧酶基因的在大肠杆菌及酵母菌种的异源表达效率较低，并且需要添加对菌体有毒且价格昂贵的诱导剂，例如IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)。另外，部分异丁香酚单加氧酶基因在大肠杆菌中表达时必需要添加Fe3+，Fe2+等金属离子伴侣，否则不具备异丁香酚单加氧酶活力。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提供一种异丁香酚单加氧酶操纵子基因，使得所述基因应用于重组载体以及重组假单胞菌中后，能够提高菌株对异丁香酚、阿魏酸、香兰素等芳香酚、芳香醛等有机物的耐受性，进而提高香兰素产量，并且无需添加有毒的诱导剂即可生产；同时菌株生产的异丁香酚单加氧酶具有较高活性。为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：一种异丁香酚单加氧酶操纵子基因，具有SEQIDNO:1所示核苷酸序列或在SEQIDNO:1所示核苷酸序列基础上依照假单胞菌的密码子偏好性优化后的核苷酸序列。针对以酵母或大肠杆菌作为异丁香酚单加氧酶重组表达载体宿主时，其重组表达载体宿主对异丁香酚、香草醛、阿魏酸等底物或产物的耐受性能较低的问题，以及异丁香酚单加氧酶操纵子基因异源表达效率较低的问题，本发明提供了具有SEQIDNO:1所示核苷酸序列的异丁香酚单加氧酶操纵子基因，其包含了启动子、调控因子基因和异丁香酚单加氧酶编码基因，其中第1507个碱基至2943个碱基所在核酸序列为异丁香酚单加氧酶基因编码序列，第382个碱基至第1332个碱基所在核酸序列为调控因子编码基因序列。本发明还涉及根据假单胞菌的密码子偏好性优化的异丁香酚单加氧酶操纵子基因。所述的密码子偏好性是指菌体对简并性同义密码子的偏好使用情况。由于编码相同氨基酸的不同密码子，在不同物种、不同生物体中使用的频率并非完全地平均分布，也即绝大多数生物倾向于只利用这些密码子中的一部分，该现象也称密码子的偏好性。其中那些被最频繁利用的密码子称为最佳密码子(optimalcodons)，而那些不被经常利用的密码子称为稀有或利用率低的密码子(rareorlow-usagecodons)，采用使用频率较高的密码子可能可以提高菌体的表达效率。所述的优化方式为依据假单胞菌的密码子使用频率情况，将异丁香酚单加氧酶操纵子中的调控因子基因或者异丁香酚单加氧酶编码基因中的使用频率较低的同义密码子所对应的核苷酸三联体，替换成具有较高使用频率的同义密码子所对应的核苷酸三联体，同时保证全长基因片段CG含量基本不变(优化前后CG含量变动不超过5％，优选的不超过1％)，同时尽量减少编码基因对应mRNA中反向上重复的序列出现的次数(invertedrepetitiveseq-uence)以减少可能发卡结构(Hairpin)的数量。本发明中优选恶臭假单胞菌KT2440密码子偏好情况以及恶臭假单胞菌通用密码子偏好情况，分别见表1和表2所示。上述优化过程可以通过编写任一一款实现上述功能的软件实行，也可以采用公开的具有上述密码子优化功能的软件实现，(例如http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/；http://www.jcat.de/；)。在具体实施方式中，本发明通过在线密码子优化软件(http://www.jcat.de/)和OPTIMIZER针对异丁香酚单加氧酶编码基因进行随机优化，分别获得了13条和8条，但是经过构建重组假单胞菌验证异丁香酚单加氧酶酶活，只有其中4条优化后的基因(本发明SEQIDNO:2-5所示核苷酸序列的异丁香酚单加氧酶操纵子基因)构建的菌株产酶酶活得到显著提高，其他存在酶活下降或消失的现象，表明并非所有优化后的基因构建重组菌株后均可以实现提高酶活的目的。因此，作为优选，优化后的基因选自SEQIDNO:2-5任意一个所示的核苷酸序列。本发明所述操纵子基因通过构建重组载体，转化至菌株后能够具备较高酶活，并且对高浓度底物有较高耐受性，故本发明提出了所述操纵子基因在制备重组载体和/或重组假单胞菌中的应用。其中，所述的载体可为本领域常用的各种载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，优选为质粒，质粒更优选为pBBR1MCS系列质粒，如pBBR1MCS-5-start质粒，所述的pBBR1MCS-5-start质粒可由商品化产品质粒pBBR1MCS根据文献SonjaFedoraGordanaImprovementofpBBR1MCSplasmids,averyusefulseriesofbroad-host-rangecloningvectors所报道的方法步骤由本领域技术人员自行构建获得。所述假单胞菌可选自铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)或硝基还原假单胞菌(Pseudomonasnitroreducens)，在本发明具体实施过程中可选择恶臭假单胞菌KT2440或恶臭假单胞菌MTCC5279(均购置于广东省微生物菌种保藏中心，GIMCC)。针对上述操纵子基因的应用，本发明提供了一种重组质粒，包括基础质粒和位于基础质粒上的所述操纵子基因。所述基础质粒如前述可选自pBBR1MCS质粒，如pBBR1MCS-5-start质粒(质粒图谱见图1)。同时，由于本发明所述操纵子基因存在的原因，还提供了该重组质粒在制备重组假单胞菌中的应用，假单胞菌可具体选自前述所列各种假单胞菌。本发明所述重组质粒构建方式可参照本发明常规的载体构建方法：a.根据本发明所述异丁香酚单加氧酶操纵子基因设计PCR上下游引物，并分别在其上下游引物中各自引入不同种类的核酸限制性内切酶位点；b.以本发明所述异丁香酚单加氧酶操纵子基因为模板，利用所设计的PCR上下游引物进行扩增，获得两端连接有不同核酸限制性内切酶位点的异丁香酚单加氧酶操纵子基因的PCR扩增产物；c.将PCR扩增产物与包含相同两种限制性内切酶的质粒载体进行连接获得重组质粒。在具体实施方式过程中，本发明以基础质粒为pBBR1MCS-5-start为例进行进一步说明：a.根据本发明所述异丁香酚单加氧酶操纵子基因设计PCR上下游引物，分别为Iem-1和Iem-2，如下：Iem-1：5’-AGATCTCAGAGCCGGATAGATATACGACTTAATTAG-3'含BglII酶切位点；Iem-2：5’-CATATGTCTTGGCATGCACGCTTTACGAAGGG-3'含NdeI酶切位点；b.然后利用上述引物对本发明所述操纵子基因进行PCR扩增，扩增产物与质粒pBBR1MCS-5-start分别用限制性内切酶BglII和NdeI在37℃处理2-12小时，纯化回收；将酶切纯化后的质粒和目的基因序列按物质的量之比1:3混合，利用T4DNA连接酶进行连接反应，22℃温育4-5小时；将连接产物转入感受态大肠杆菌中，获得重组质粒pBBR1MCS-5-start-IemR-Iem。根据本发明前述提供的应用，进一步地，本发明还提供了一种重组假单胞菌，其转化有本发明所述重组质粒。所述假单胞菌同样可以选自前述任意一种所列举的假单胞菌。本发明所述的转化手段是指使用现有技术人员已知的转化、转染或转导手段将目的DNA(包含质粒载体)导入易感宿主细胞，包括使用化学法、氯化钙热激法、电击转化法、原生质体转化法及其它微生物转化方法，优选的为电击转化法。在具体实施方式中，本发明提供具体的电击转化方法：①挑取假单胞菌单菌落接种于培养基(优选的为LB培养基)中，30℃,220转/分钟过夜培养，至菌液浊度OD600接近0.6时；取1mL过夜培养的种子液接入装有50-100mLLB培养基的三角瓶中，30℃，220转/分钟培养3小时，至OD600＝0.5-0.6；②将装有菌液的三角瓶置于冰浴上冷却20-30分钟，4℃下5000rpm离心6分钟，弃上清；③加50mL预冷至0℃的3M蔗糖无菌溶液重悬菌体，菌体充分扩散后于4℃下5000rpm离心8分钟，弃上清；④重复步骤③两次后，加3mL预冷的3M蔗糖无菌溶液，置于冰浴中，分装至1.5mL离心管中，每管100μL，加入构建好的含有本发明所述异丁香酚单加氧酶操纵子基因的重组载体(如重组质粒pBBR1MCS-5-start-IemR-Iem)3μL，混均后加入到预冷的2mm电转杯内冰浴30分钟；⑤打开电转仪，2.5kv电压电激后，迅速加入1mL预冷的无菌LB培养基，混匀后转入试管中，30℃缓慢振荡培养2小时后，涂布到加有适当庆大霉素的固体LB平板上，30℃倒置培养24小时，获得含有重组载体的基因工程恶臭假单胞菌。同时，本发明提供了所述重组假单胞菌在制备催化异丁香酚转化为香兰素的催化剂和/或生产香兰素中的应用。所述催化剂为重组假单胞菌的菌体细胞、菌体细胞提取物、发酵液、发酵液提取物或重组假单胞菌产生的异丁香酚单加氧酶。本发明针对催化剂为异丁香酚单加氧酶时的情形，提供了其制备方法，将本发明所述重组假单胞菌接种至种子培养基中进行活化培养，然后接种到发酵培养基中进行发酵培养，至培养基的浊度OD600值不再变化时，将培养基离心，收集菌体细胞，重悬并破碎菌体细胞，离心收集上清获得异丁香酚单加氧酶。其中，所述种子培养基和发酵培养基均优选为LB培养基，如蛋白胨10-12g/L、酵母粉5-7g/L、氯化钠5-7g/L；进一步优选地，在发酵培养基中还包括诱导剂和/或伴侣因子，所述诱导剂为异丁香酚、茴香脑、丁香酚、阿魏酸、愈创木酚、4-乙基愈创木酚、松柏醛、松伯醇、甲苯、原儿茶醛中的一种或两种以上，浓度为10-1000μmol，优选10-20μmol；所述伴侣因子为Fe2+、Fe3+、Co2+、Mg2+、Mn2+、Mo2+、Ni2+、Zn2+、NADH、FAD、维生素C中的一种或两种以上，浓度为10-20μmol；在诱导剂和伴侣因子为多种时，各诱导剂或伴侣因子的浓度相同，优选地，诱导剂为异丁香酚和阿魏酸组合，伴侣因子为Fe3+和维生素C组合。上述方法中的活化培养优选为在30℃，220rpm条件下摇床培养12小时，发酵培养优选为在30℃，220rpm条件下摇床培养。在将生产香兰素的实施例中，采用本发明所述重组假单胞菌的菌体细胞为催化剂时，香草兰的收率达到38.5％以上；采用所述重组假单胞菌产生的异丁香酚单加氧酶为催化剂时，香草兰的收率达到38.5％以上。此外，在和表达异丁香酚单加氧酶的大肠杆菌转化生产香兰素的对比试验中，在异丁香酚浓度为0.1g/L时，大肠杆菌的香草兰收率仅为3.41％，而本发明重组假单胞菌的香草兰收率为70％，并且随着异丁香酚浓度的逐渐升高，本发明重组假单胞菌的香草兰收率并未出现明显下降，均在70％以上，在异丁香酚浓度为1.2g/L时，达到最高的85％收率。基于上述技术效果，本发明提供了一种香兰素的制备方法，向本发明所述的催化剂中加入异丁香酚进行催化反应，反应后收集香兰素；或将本发明所述重组假单胞菌活化后，加入异丁香酚并流加异丁香酚控制其浓度恒定，然后收集生成的香兰素。作为优选，所述制备方法为在pH9-10的甘氨酸或氢氧化钠溶液中加入本发明所述的催化剂，然后加入异丁香酚和异丙醇，在17-30℃下恒温振荡器中反应30-70h，然后收集生成的香兰素。其中，所述甘氨酸或氢氧化钠溶液浓度为0.05-0.1mol/L。催化剂为菌体细胞时，浓度为5g/L；催化剂为异丁香酚单加氧酶时，浓度为20-40g/L。作为优选，所述制备方法可将所述重组假单胞菌接种于LB培养基中，30℃培养至OD＝0.8时，加入异丁香酚至终浓度为0.1-5g/L，继续培养并流加异丁香酚控制其浓度恒定，然后收集生成的香兰素。由以上技术方案可知，本发明提供了一段异丁香酚单加氧酶操纵子基因以及依照假单胞菌密码偏好性优化后的操纵子基因，该操纵子基因通过基因工程技术应用于重组载体和重组工程菌构建中，所获得的重组假单胞菌对异丁香酚、香草醛、阿魏酸等底物或产物的耐受性较高，且应用于香兰素生产中无需添加有毒的诱导剂，香草兰收率达到70％以上，同时异丁香酚单加氧酶具备较高酶活。附图说明图1所示为pBBR1MCS-5-start质粒图谱。具体实施方式本发明公开了一种异丁香酚单加氧酶操纵子基因及其重组载体和重组假单胞菌，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述基因、载体、重组菌株和相关应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的各种产品和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。下面结合实施例，进一步阐述本发明。实施例1：含异丁香酚单加氧酶操纵子基因的重组质粒的构建含异丁香酚单加氧酶操纵子基因的重组质粒pBBR1MCS-5-start-IemR-Iem的构建。以SEQIDNO:1所示的异丁香酚单加氧酶操纵子基因为模板，利用引物Iem-1和Iem-2进行PCR，PCR扩增后获得在异丁香酚单加氧酶操纵子基因两端连有不同限制性酶切位点的核酸序列，其中涉及的PCR反应体系如下:其中涉及的引物为：Iem-1：5’-AGATCTCAGAGCCGGATAGATATACGACTTAATTAG-3'含BglII酶切位点；Iem-2：5’-CATATGTCTTGGCATGCACGCTTTACGAAGGG-3'含NdeI酶切位点；PCR程序为:首先94-95℃预变性5分钟，之后采用94-95℃30秒，50-60℃30秒，68℃2分钟三段温度循环程序，待完成25-30次循环后，保持68℃10分钟，最后程序降温至10℃保温。PCR扩增回收的片段即为在异丁香酚单加氧酶操纵子基因(SEQIDNO:1)两端分别连有BglII和NdeI限制性酶切位点的基因片段，其基因序列通过送至上海某生物科技公司进行测序得到验证。将通过PCR扩增获得的两端分别获得的连有BglII和NdeI限制性酶切位点的异丁香酚单加氧酶操纵子基因(SEQIDNO:1)和质粒pBBR1MCS-5-start分别用限制性内切酶BglII和NdeI处理(37℃,4小时)，利用PCR产物纯化试剂盒(上海捷瑞生物工程技术服务有限公司)分别回收目的片段，将酶切后的质粒和PCR产物序列按1:3的比例进行连接反应(22℃，4小时)；连接产物通过电击转化转入大肠杆菌DH5α中，经筛选获得重组质粒pBBR1MCS-5-start-IemR-Iem。实施例2：表达异丁香酚单加氧酶恶臭假单胞菌KT2440重组基因工程菌的制备①恶臭假单胞菌KT2440感受态细胞的制备:挑取恶臭假单胞菌KT2440接种于LB培养基中，30℃,220rpm培养12小时，取1mL培养的菌液接入装有50mLLB培养基的250mL三角瓶中，30℃,220rpm培养3h，至OD600约0.6；将装有菌液的三角瓶置于冰浴上冷却30分钟，4℃下5000rpm离心5分钟，弃上清；加50mL预冷至0℃的3M蔗糖无菌溶液重悬菌体，使菌体充分扩散后于4℃下5000rpm离心8分钟，弃上清；加3M蔗糖无菌溶液摇匀，置于冰浴中，获得恶臭假单胞菌KT2440感受态细胞。②质粒pBBR1MCS-5-start-IemR-Iem的电转化按照实施例1所述方法，构建异丁香酚单加氧酶操纵子基因重组质粒pBBR1MCS-5-start-IemR-Iem。取100uL恶臭假单胞菌KT2440感受态细胞于1.5mL离心管中，加入10μL构建好的重组质粒pBBR1MCS-5-start-IemR-Iem，混合均匀后加入到预冷的电脉冲杯内冰浴30分钟；打开电转仪，按设定的转化程序进行电激(2.5kV)；电激后向电脉冲杯内迅速加入1mL预冷的无菌LB培养基，混匀后，转入试管中，30℃缓慢振荡培养2小时后，涂布到加有适当浓度庆大霉素的选择平板上，30℃倒置培养36小时，获得含有重组质粒pBBR1MCS-5-start-IemR-Iem的恶臭假单胞菌KT2440基因工程菌。实施例3：表达异丁香酚单加氧酶恶臭假单胞菌MTCC5279重组基因工程菌的制备依照实施例2所述步骤进行重组基因工程菌的制备，不同的是所使用的重组质粒的宿主为恶臭假单胞菌MTCC5279。实施例4：异丁香酚单加氧酶操纵子基因的密码子偏好序列的在线优化利用在线基因序列优化软件优化异丁香酚单加氧酶基因提高表达量和酶活，主要包括以下步骤：1、打开在线密码子优化软件(http://www.jcat.de/)；2、在序列框中输入异丁香酚加氧酶的编码基因序列；3、选取宿主菌类型；4、提交序列，进行部分随机序列优化，一共随机生成13条优化后的异丁香酚加氧酶的编码基因序列，将优化后的异丁香酚单加氧酶的编码基因序列替换原异丁香酚加氧酶操纵子基因序列中的异丁香酚加氧酶的编码基因序列，从而获得13条密码子偏好性优化后的的异丁香酚单加氧酶操纵子基因序列；5、按照13条优化后的异丁香酚单加氧酶操纵子基因序列分别合成13条异丁香酚单加氧酶操纵子基因片段(委托上海某生物技术公司合成)；6、将所获得的13条操纵子基因片段按照实施例1所示步骤分别制备重组质粒，之后按照实施例恶臭假单胞菌KT2440基因工程菌，制备过程中与实施例2唯一不同的是所用的异丁香酚加氧酶操纵子基因分别采用13条密码子偏好性优化后的操纵子基因片段中任一条，从而获得13株含有不同的重组质粒的恶臭假单胞菌KT2440基因工程菌；7、将所获得的13株含有不同的重组质粒的恶臭假单胞菌KT2440基因工程菌分别接种于LB培养基中，在30℃，220rpm条件下摇床培养24小时，之后分别测定发酵液的异丁香酚单加氧酶活力，13株含有有不同的重组质粒的恶臭假单胞菌KT2440基因工程菌中，其中异丁香酚单加氧酶活力低于由序列3制备的恶臭假单胞菌KT2440基因工程菌的为8株，2株未能检测到异丁香酚单加氧酶活力，另有3株的异丁香酚单加氧酶活力较由序列3制备的恶臭假单胞菌KT2440基因工程菌有30-50％的提高。8、3株的异丁香酚单加氧酶活力明显提高的恶臭假单胞菌KT2440基因工程菌，其重组载体中含有的异丁香酚单加氧酶操纵子序列分别为SEQIDNO:2-4所示的基因序列。实施例5：异丁香酚单加氧酶操纵子基因的密码子偏好序列的优化1.利用在线优化软件OPTIMIZER(http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)将异丁香酚单加氧酶操纵子基因中的异丁香酚单加氧酶编码基因对应的正义链序列输入OPTIMIZER；2.利用表1所列的恶臭假单胞菌KT2440(PseudomonasputidaKT2440)密码子偏好统计数据和表2通用恶臭假单胞菌密码子偏好统计数据，输入OPTIMIZER计算数据库；3.选择Guidedrandom模式进行优化；4.重复步骤3以获得不同的优化后异丁香酚单加氧酶编码基因的序列，共获得8条优化后的异丁香酚单加氧酶操纵子序列5.将所获得的异丁香酚单加氧酶编码基因序列替换回原来的异丁香酚单加氧酶操纵子基因中；6.按照优化后的异丁香酚单加氧酶操纵子序列分别合成异丁香酚单加氧酶操纵子基因片段(委托上海某生物技术公司合成)，将优化后的异丁香酚单加氧酶操纵子基因片段按照实施例2所示方式，制备表达异丁香酚单加氧酶恶臭假单胞菌KT2440重组基因工程菌，与实施例2不同的是所采用的异丁香酚单加氧酶操纵子基因分别为优化后的8条优化后的异丁香酚单加氧酶操纵子基因；7.将所获得的8株含有不同的重组质粒的恶臭假单胞菌KT2440基因工程菌分别接种于LB培养基中，在30℃，220rpm条件下摇床培养24小时，之后分别测定发酵液的异丁香酚单加氧酶活力，酶活相较于含有序列3所示的恶臭假单胞菌KT2440重组基因工程菌，酶活力下降或者消失的恶臭假单胞菌KT2440基因工程菌为7株，获得1株异丁香酚单加氧酶活力提高48％的恶臭假单胞菌KT2440基因工程菌；所获得的酶活力显著提高的恶臭假单胞菌KT2440基因工程菌其所采用的异丁香酚单加氧酶操纵子基因的基因序列为SEQIDNO:5所示。表1恶臭假单胞菌KT2440(PseudomonasputidaKT2440)密码子偏好统计数据(每1000个密码子中出现的次数)表2通用恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)密码子使用偏好情况(每1000个密码子中出现的次数)实施例6：利用表达异丁香酚单加氧酶的基因工程假单胞菌菌发酵生产异丁香酚单加氧酶1、利用表达异丁香酚单加氧酶的恶臭假单胞菌KT2440基因工程菌发酵生产异丁香酚单加氧酶(1)依照实施例2所述方法获得表达异丁香酚单加氧酶的恶臭假单胞菌KT2440基因工程菌；(2)将所述的表达异丁香酚单加氧酶的恶臭假单胞菌KT2440基因工程菌接种于种子培养基中，在30℃，220rpm条件下摇床培养12小时；就本次实验而言，种子培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，氯化钠6g/L，其余为水。(3)异丁香酚单加氧酶发酵制备按10％(V/V)的接种量，将种子液接种至含有发酵培养基的三角瓶中，在30℃条件下进行发酵培养，待OD600值不在变化时，离心富集菌体细胞。将所得细胞重悬于100mLpH7.5的磷酸盐甘油缓冲液中，高压均质破碎细胞，离心收集上清，即为重组异丁香酚单加氧酶粗酶液。就本次实验而言，发酵培养基组成:蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，氯化钠6g/L，Fe3+10μmol、异丁香酚1mM，其余为水。2、利用表达异丁香酚单加氧酶假单胞菌MTCC5279重组基因工程菌发酵生产异丁香酚单加氧酶(1)依照实施例3所述方法获得表达异丁香酚单加氧酶的恶臭假单胞菌MTCC5279基因工程重组菌；(2)按照上述步骤(2)、(3)发酵制备异丁香酚单加氧酶，与之不同的是所采用的基因工程重组菌为恶臭假单胞菌MTCC5279基因工程重组菌。3、酶活的测定步骤发酵结束后，取30ml发酵液离心(6000rpm离心10min)获得的湿菌体加入反应液(10ml)：DMSO1ml，湿菌体0.3g，异丁香酚0.2g，甘氨酸-氢氧化钠缓冲液pH＝10.59mL，30℃，220rpm，摇床振荡，反应1小时。4、酶活单位U的定义：单位酶活定义为每分钟生产1μmol香兰素的湿菌体。5、结果见表3。表3酶活测定结果重组菌株异丁香酚单加氧酶酶活U/mL恶臭假单胞菌KT2440基因工程菌0.14恶臭假单胞菌MTCC5279基因工程菌0.11实施例7：利用诱导剂提高异丁香酚单加氧酶酶活浓度按照实施6中1所述方式制备异丁香酚单加氧酶，在实施过程中，在发酵培养基中还单独添加了下表内所述的诱导剂或诱导剂组合来替换原有1mM异丁香酚，其测定的酶活如下：表4诱导物种类浓度发酵液酶活U/mL不添加-0.01异丁香酚20μmol0.14茴香脑20μmol0.1丁香酚20μmol0.07阿魏酸20μmol0.033愈创木酚20μmol0.044-乙基愈创木酚20μmol0.037松柏醛20μmol0.053松伯醇20μmol0.056甲苯20μmol0.066原儿茶醛20μmol0.037异丁香酚+阿魏酸10μmol+10μmol0.16实施例8：利用伴侣因子提高异丁香酚单加氧酶酶活浓度按照实施6所述方式制备异丁香酚单加氧酶，在实施过程中，在发酵培养基中添加的Fe3+替换为下表内所述的伴侣因子或伴侣因子组合：表5伴侣因子种类浓度发酵液酶活U/mL不添加-0.08Fe3+10μmol0.14Mn2+10μmol0.09Mo2+10μmol0.1Mg2+10μmol0.109Fe3++维生素C10μmol+10μmol0.19Mn2++Mo2+10μmol+10μmol0.101Mg2+维生素C10μmol+10μmol0.09实施例9：催化异丁香酚生成香兰素的方法方案a：在50mL甘氨酸/氢氧化钠溶液中(0.1mol/L，pH9)中加入实施例6获得的湿菌体至最终菌体浓度为5g/L，加入异丁香酚300mmol，加入异丙醇4mL，17℃下恒温振荡器中反应30h，HPLC检测异丁香酚转化率48.4％，香兰素收率38.5％。方案b：在50mL甘氨酸/氢氧化钠溶液(0.1mol/L、pH9.5)中加入粗酶液至最终蛋白浓度为20g/L，加入异丁香酚200mmol，加入2mL异丙醇，30℃下恒温振荡器中反应70h，HPLC检测，异丁香酚转化率80.5％，香兰素收率70.2％。方案c：在50mL甘氨酸/氢氧化钠溶液中(0.05mol/L，pH10)中加入粗酶液至最终蛋白浓度为40g/L,加入异丁香酚150mmol，加入5mL异丙醇，25℃下恒温振荡器中反应40h，HPLC检测异丁香酚转化率85.3％，香兰素收率77.4％。实施例10：本发明恶臭假单胞菌KT2440基因工程菌与表达异丁香酚单加氧酶的大肠杆菌基因工程菌发酵同步转化生产香兰素的对比试验1、对照方法将表达异丁香酚单加氧酶的大肠杆菌基因工程菌(参照公开专利CN2014102045280构建)接种于种子培养基中，37℃培养至OD＝0.8时，加入IPTG至终浓度1mM，异丁香酚至终浓度0.1g/L，25℃继续培养。结果，24小时后发酵液逐渐变清，OD值下降，异丁香酚转化率5.4％，香兰素收率3.41％；2、本发明方法依照实施例2所述方法获得表达异丁香酚单加氧酶的恶臭假单胞菌KT2440基因工程菌，然后在不同异丁香酚浓度下进行发酵试验；(1)将所述的表达异丁香酚单加氧酶的恶臭假单胞菌KT2440基因工程菌接种于种子培养基中，30℃培养至OD＝0.8时，加入异丁香酚至终浓度0.1g/L，继续培养并流加异丁香酚控制其浓度在0.1g/L左右。24小时后，异丁香酚转化率82％，香兰素收率70％。(2)将所述的表达异丁香酚单加氧酶的恶臭假单胞菌KT2440基因工程菌接种于种子培养基中，30℃培养至OD＝0.8时，加入异丁香酚至终浓度0.4g/L，继续培养并流加异丁香酚控制其浓度在0.4g/L左右。24小时后，异丁香酚转化率85％，香兰素收率74％。(3)将所述的表达异丁香酚单加氧酶的恶臭假单胞菌KT2440基因工程菌接种于种子培养基中，30℃培养至OD＝0.8时，加入异丁香酚至终浓度0.8g/L，继续培养并流加异丁香酚控制其浓度在0.8g/L左右。24小时后，异丁香酚转化率86.5％，香兰素收率77％。(4)将所述的表达异丁香酚单加氧酶的恶臭假单胞菌KT2440基因工程菌接种于种子培养基中，30℃培养至OD＝0.8时，加入异丁香酚至终浓度1.2g/L，继续培养并流加异丁香酚控制其浓度在1.2g/L左右。24小时后，异丁香酚转化率91％，香兰素收率85％。(5)将所述的表达异丁香酚单加氧酶的恶臭假单胞菌KT2440基因工程菌接种于种子培养基中，30℃培养至OD＝0.8时，加入异丁香酚至终浓度2g/L，继续培养并流加异丁香酚控制其浓度在2g/L左右。24小时后，异丁香酚转化率89％，香兰素收率81％。(6)将所述的表达异丁香酚单加氧酶的恶臭假单胞菌KT2440基因工程菌接种于种子培养基中，30℃培养至OD＝0.8时，加入异丁香酚至终浓度5g/L，继续培养并流加异丁香酚控制其浓度在5g/L左右。24小时后，异丁香酚转化率87％，香兰素收率79％。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。SEQUENCELISTING<110>波顿（上海）生物技术有限公司<120>一种异丁香酚单加氧酶操纵子基因及其重组载体和重组假单胞菌<130>MP1622948<160>5<170>PatentInversion3.3<210>1<211>3112<212>DNA<213>人工序列<400>1agatctcagagccggatagatatacgacttaattagtcaggcatgaaggctgagcggagg60agagaggtggcgtcatgcgaaggcatcactggcgggatccgcgccatgagcctcatcttg120gtcaccctgcgatctacgacaccgggcaactttatcgccatcgtgatcgccacgatcagg180attctgtcacccgcagcgctcatcagcaccgaatccaactggccctggcaagtaggccca240ctcaattgccgaggtactagggacagagcgcggtcaggcgaatagagggacgctcgagtc300gacacctaatgtggcagtcctagccttgatgatcacgcaggtccgcatttgcaacgacga360ctgcaataacgctatgggaaatcaagcctgcctcaccaaggagacaggcgaaacaccgta420tctttccttaaatttcttgctgaaatggcttgaatccgaaaaacctgaggacatggccac480tttcagcacagcacccgagccactcgtcgcacagagcattcgataagctttgcccaggcg540tatttccaacagctcgcgaccaaaggtcgtaccgcacgcagcaaagacataatgcaaata600gcgcttcgaaattcctaattgacttgaaacactttccggctcgagattagcgtctgcgaa660actctgctcgagtactctcttcacttccctcattttccgtagagccacacccccatcttc720agaactaaccgcagaacttgctagtgaaattaacatagcaacatgctctgcaatgctatt780tacattgctacccaaatcgtcgatgcgcaatggatctagattagaaaccgatgcgcttag840cgccctaccccaccctatctcagcatcaactcgtcgggcgataagatcctccggattgga900cacccacgctcccagccaactcaccggaaagcgtattacaacaccttgggtcgaagaatt960cgaggaaagtgtgaagtcttggcgactatcaactatggagcaatcaccatttgccaagat1020cacctttcttccgccggatgcaacgcccaaagccccacttcgtatctgaatcaaatagct1080gtgctcagcctcattagcatttcgctggtcgttgaagtggcgaagtacctggcttggtgc1140aatggcactgtacagctcacccgcgccaaatctagatcgggcaaggtaggcacctctacc1200ccgctcaagacgctggacttcgaaatgagtacgcattgatccattaagggtatgcgccca1260atgcagcggcgaatccgcgagagtgatccgctcagagtgaatggacatacgccgccaccg1320aatagttgtcattcttgaaatcctcaacaataggccagcctcggcccattttcaataccg1380ccaccattgcactcacagacatcctcacttcaccggcacacatgaaatccggtcagtcct1440aaacataaactccaacccggcaagccgcgcatttaggccattcagaacaacaaaggagac1500cgtgccatggcgagactcaaccgcaacgacccgcaattagtaggaacacttctccccacc1560cgtatcgaggcagacttgttcgatctagaggttgacggcgaaatcccaaaatcaataaat1620ggaacgttctaccgtaatacgccagaacctcaagttaccccgcaaaaattccacaccttc1680atagatggagatggaatggcctctgccttccacttcgaagatggtcatgtcgacttcatc1740agtcgctgggttaaaaccgctcgattcacggccgaacgactagcgcgaaaatcgctattt1800ggcatgtacagaaacccctataccgacgacaccagtgtaaaaggactagaccgcaccgtt1860gccaatacaagcatcattagccatcacggcaaggtgctggcggtgaaggaagacggccta1920ccgtacgaactggatcctcgtacacttgaaactcgcggacgcttcgactacgacggccaa1980gttaccagccaaacccacaccgcccatccaaaatatgacccggaaacgggtgacttgttg2040ttcttcggttcggcagctaagggcgaagcaactccagacatggcctattacattgtcgac2100aagcacggcaaggtgacacatgaaacttggtttgagcagccctatggcgcattcatgcac2160gactttgccattacccgaaattggtccattttcccaattatgccggccaccaacagcctg2220tcccgcctcaaggcgaaacagccaatttatatgtgggagccggaactgggcagctacatt2280ggcgtactgccgcgccgcggccagggcagtcagattcgctggctcaaggcaccggcgctc2340tgggtatttcatgttgtgaatgcttgggaagtcggaaccaagatttatatcgaccttatg2400gaaagtgaaatcctgccgttccccttccccaactcacaaaaccaacccttcgcccctgag2460aaagccgtaccacgcctgactcgttgggaaattgacctcgatagcagcagcgacgagatc2520aagcgaacccggctacacgatttctttgcggaaatgccaatcatggattttcgcttcgcc2580ctgcaatgcaaccgctatggctttatgggggtggacgatccacgcaaaccacttgcgcat2640cagcaggccgagaagatatttgcgtacaactcactcggcatctgggacaaccaccgaggt2700gactacgacctctggtactccggagaagcctcggcggcccaggagccggccttcgtccct2760agaagtccgaccgccgccgaaggtgatgggtacttgctgaccgtggttggtcgtctcgat2820gaaaatcgcagtgatctggtaattctcgacactcaagacatccagtctggtcccgtggca2880accatcaagctgccattccggttaagggccgctctccatggctgctgggtacccagacct2940taacgaaactccaaccttccagcccttcagggccgccggtacggcggcccctgtcctcgc3000acgaatttccaatccctatcacgacggtgagagcctgcacgcaagcccattgattacgcc3060ccggggcgtctgtccctggccccttcgtaaagcgtgcatgccaagacatatg3112<210>2<211>3112<212>DNA<213>人工序列<400>2agatctcagagccggatagatatacgacttaattagtcaggcatgaaggctgagcggagg60agagaggtggcgtcatgcgaaggcatcactggcgggatccgcgccatgagcctcatcttg120gtcaccctgcgatctacgacaccgggcaactttatcgccatcgtgatcgccacgatcagg180attctgtcacccgcagcgctcatcagcaccgaatccaactggccctggcaagtaggccca240ctcaattgccgaggtactagggacagagcgcggtcaggcgaatagagggacgctcgagtc300gacacctaatgtggcagtcctagccttgatgatcacgcaggtccgcatttgcaacgacga360ctgcaataacgctatgggaaattaggcctggcgcaccagcgacaccggcgacacgccgta420gcgttccttgaacttcttcgagaagtgcgacgagtccgagaagcccgacgacatggccac480cttcagcacggcgcccgagcccgaggtggcgcacagcatgcggtaggccttgcccaggcg540gatttccagcagttcgcggccgaaggtggtgccgcaggcggcgaacacgtagtgcaggta600gcgcttcgagatgcccagctgcgacgacaccgattccggttccaggttggcgtcggcgaa660cgactgttccagcacgcgcttcacttcgcgcatcttgcgcagggccacgccgccgtcttc720cgacgacacggccgacgaggccagcgagatcagcatggccacgtgttcggcgatcgagtt780cacgttcgagcccaggtcgtcgatgcgcagcgggtccaggttcgacaccgaggccgacag840ggcgcggccccagccgatttcggcgtccacgcggcgggcgatcaggtcttccgggttcga900cacccaggcgcccagccacgacaccgggaagcggatcaccacgccctgggtcgacgagtt960cgacgacagggtgaagtcctggcgcgagtccacgatcgagcagtcgccgttggccaggat1020caccttgcggccgcccgaggccacgcccagggcgcccgagcggatctggatcaggtacga1080gtgttcggcttcgttggcgttgcgctggtcgttgaagtggcgcagcacctgcgacggggc1140gatggccgagtacagttcgccggcgccgaagcgcgagcgggccaggtaggcgccgcggcc1200gcgttccaggcgctgcacttcgaagtgggtgcgcatcgagccgttcagggtgtgggccca1260gtgcagcggcgagtcggccagggtgatgcgttccgagtggatcgacatgcggcgccagcg1320gatggtggtcattcttgaaatcctcaacaataggccagcctcggcccattttcaataccg138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