一种异丁香酚单加氧酶操纵子基因及其重组载体和重组假单胞菌的制作方法

文档序号:12411581阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种异丁香酚单加氧酶操纵子基因,其特征在于,具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列或在SEQ ID NO:1所示核苷酸序列基础上依照假单胞菌的密码子偏好性优化后的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述操纵子基因,其特征在于,所述在SEQ ID NO:1所示核苷酸序列基础上依照假单胞菌的密码子偏好性优化后的核苷酸序列选自SEQ ID NO:2-5任意一个所示的核苷酸序列。

3.权利要求1或2所述操纵子基因在制备重组载体和/或重组假单胞菌中的应用。

4.根据权利要求3所述应用,其特征在于,所述载体为质粒、粘粒、噬菌体或病毒。

5.根据权利要求4所述应用,其特征在于,所述质粒为pBBR1 MCS质粒。

6.根据权利要求5所述应用,其特征在于,所述pBBR1 MCS质粒为pBBR1MCS-5-start质粒。

7.根据权利要求3所述应用,其特征在于,所述假单胞菌为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)或硝基还原假单胞菌(Pseudomonas nitroreducens)。

8.根据权利要求7所述应用,其特征在于,所述恶臭假单胞菌为恶臭假单胞菌KT2440或恶臭假单胞菌MTCC5279。

9.一种重组质粒,其特征在于,包括基础质粒和位于基础质粒上的权利要求1或2所述操纵子基因。

10.根据权利要求9所述重组质粒,其特征在于,所述基础质粒为pBBR1 MCS质粒。

11.根据权利要求10所述重组质粒,其特征在于,所述pBBR1 MCS质粒为pBBR1MCS-5-start质粒。

12.权利要求9-11任意一项所述重组质粒在制备重组假单胞菌中的应用。

13.根据权利要求12所述应用,其特征在于,所述假单胞菌为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)或硝基还原假单胞菌(Pseudomonas nitroreducens)。

14.根据权利要求13所述应用,其特征在于,所述恶臭假单胞菌为恶臭假单胞菌KT2440或恶臭假单胞菌MTCC5279。

15.一种重组假单胞菌,其特征在于,转化有权利要求9-11任意一项所述重组质粒。

16.根据权利要求15所述重组假单胞菌,其特征在于,所述重组假单胞菌为重组铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、重组恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)或重组硝基还原假单胞菌(Pseudomonas nitroreducens)。

17.根据权利要求16所述重组假单胞菌,其特征在于,所述重组恶臭假单胞菌为重组恶臭假单胞菌KT2440或重组恶臭假单胞菌MTCC5279。

18.权利要求15-17任意一项所述重组假单胞菌在制备催化异丁香酚转化为香兰素的催化剂和/或生产香兰素中的应用。

19.根据权利要求18所述应用,其特征在于,所述催化剂为重组假单胞菌的菌体细胞、菌体细胞提取物、发酵液、发酵液提取物或重组假单胞菌产生的异丁香酚单加氧酶。

20.一种生产催化异丁香酚转化为香兰素的催化剂,其特征在于,该催化剂为权利要求15-17任意一项所述重组假单胞菌的菌体细胞、菌体细胞提取物、发酵液、发酵液提取物或所述重组假单胞菌产生的异丁香酚单加氧酶。

21.一种制备异丁香酚单加氧酶的方法,其特征在于,将权利要求15-17任意一项所述重组假单胞菌接种至种子培养基中进行活化培养,然后接种到发酵培养基中进行发酵培养,至培养基的浊度OD600值不再变化时,将培养基离心,收集菌体细胞,重悬并破碎菌体细胞,离心收集上清获得异丁香酚单加氧酶。

22.根据权利要求21所述方法,其特征在于,所述种子培养基和发酵培养基均为LB培养基。

23.根据权利要求21或22所述方法,其特征在于,所述发酵培养基还包括诱导剂和/或伴侣因子,所述诱导剂为异丁香酚、茴香脑、丁香酚、阿魏酸、愈创木酚、4-乙基愈创木酚、松柏醛、松伯醇、甲苯、原儿茶醛中的一种或两种以上,所述伴侣因子为Fe2+、Fe3+、Co2+、Mg2+、Mn2+、Mo2+、Ni2+、Zn2+、NADH、FAD、维生素C中的一种或两种以上。

24.根据权利要求23所述方法,其特征在于,所述诱导剂为异丁香酚和阿魏酸组合。

25.根据权利要求23所述方法,其特征在于,所述伴侣因子为Fe3+和维生素C组合。

26.根据权利要求21所述方法,其特征在于,所述活化培养为在30℃,220rpm条件下摇床培养12小时。

27.根据权利要求21所述方法,其特征在于,所述发酵培养为在30℃,220rpm条件下摇床培养。

28.一种香兰素的制备方法,其特征在于,向权利要求20所述的催化剂中加入异丁香酚进行催化反应,反应后收集香兰素;或

将权利要求15-17任意一项所述重组假单胞菌活化后,加入异丁香酚并流加异丁香酚控制其浓度恒定,然后收集生成的香兰素。

29.根据权利要求28所述制备方法,其特征在于,在pH 9-10的甘氨酸或氢氧化钠溶液中加入权利要求20所述的催化剂,然后加入异丁香酚和异丙醇,在17-30℃下恒温振荡器中反应30-70h,然后收集生成的香兰素。

30.根据权利要求29所述制备方法,其特征在于,权利要求20所述的催化剂为菌体细胞或重组假单胞菌产生的异丁香酚单加氧酶。

31.根据权利要求28所述制备方法,其特征在于,将权利要求15-17任意一项所述重组假单胞菌接种于LB培养基中,30℃培养至OD=0.8时,加入异丁香酚至终浓度为0.1-5g/L,继续培养并流加异丁香酚控制其浓度恒定,然后收集生成的香兰素。

当前第2页1 2 3 
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1