本发明属于生物工程技术及生物医药领域，涉及一种羰基还原酶及其在手性醇制备中的应用,具体涉及一种羰基还原酶及其基因，及含有该羰基还原酶基因的重组表达载体和基因工程菌，以及其重组酶和该重组酶的制备方法，及利用该重组酶不对称催化制备光学活性手性醇，特别是催化合成普利类药物重要手性中间体(r)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的方法。
背景技术：
普利类药物是重要的抗高血压药物，其含有的血管紧张素转化酶抑制剂(acei)可作用于肾素-血管紧张素系统ras，并显著抑制其中的血管紧张素转化酶的产生，从而减少血管紧张素ⅱ(angⅱ)的生成并使血压下降，达到控制血压、保护靶器官的作用，可用于治疗高血压和充血性心力衰竭等心血管疾病。
(r)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯((ethyl(r)-2-hydroxy-4-phenyl-butyrate,(r)-hpbe)，cas号90315-82-5)是合成多种血管紧张肽转化酶抑制剂(aceⅰ)和充血性心力衰竭药物的重要手性中间体，其研究具有较大的实用意义和工业应用前景。(r)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯是一种手性仲醇，为无色透明油状液体，不溶于水，易溶于氯仿，乙酸乙酯等有机溶剂，沸点212℃，相对密度1.075，分子式c12h16o3，分子量208.25。
(r)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的合成方法包括化学法和生物法，生物法又分为生物拆分法和生物还原法，其中生物法合成(r)-hpbe具有对环境污染小，反应条件温和等优点，具有很好的工业应用效果。
技术实现要素：
本发明提供了一种制备羰基还原酶的方法，并发明了应用该酶催化合成(r)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯等光学活性手性醇的方法。
本发明提供一种具有较高催化活性、对映选择性和较好底物耐受性的羰基还原酶，及含有该羰基还原酶基因的重组表达载体和基因工程菌，以及其重组酶和该重组酶的制备方法，及利用该重组酶不对称催化制备光学活性手性醇，特别是催化合成普利类药物重要手性中间体(r)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的方法。
本发明提供一种羰基还原酶突变体，其是(1)由序列表中seqidno.2所示氨基酸序列组成的蛋白质；(2)或是由seqidno.2中所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或者几个氨基酸且具有羰基还原酶活性的由(1)衍生的蛋白质。
本发明的羰基还原酶突变体基因，其核苷酸序列如seqidno.1所示，其野生型基因序列来自光滑假丝酵母candidaglabratacbs138，经过易错pcr方法对其进行突变得到。本发明羰基还原酶突变体基因可以通过pcr扩增法、重组法或者化学合成方法获得。
本发明的另一目的在于提供一种包含本发明的羰基还原酶突变体基因的核苷酸序列的重组表达载体。其可通过本领域常规方法将本发明的羰基还原酶基因的核苷酸序列连接于各种载体上构建而成，如质粒puc18，puc19，pbv322，pbad，pet系列等，更优选地选自pet系列。本发明的一个实施例中所使用的质粒为pet-28a。
本发明的另一目的在于提供一种包含本发明的羰基还原酶基因或其重组表达载体的基因工程菌，本发明优选大肠埃希氏菌(escherichiacoli)bl21(de3)。将前述重组表达质粒转化至大肠埃希氏菌(escherichiacoli)bl21(de3)中，即可得到本发明优选的基因工程菌。
本发明的另一目的在于提供一种利用该基因工程菌制备羰基还原酶突变体的方法，包括构建该基因工程菌；发酵培养该基因工程菌；以及收集和制备羰基还原酶突变体，并将其用于相关原料药及医药中间体的催化合成。
本发明构建羰基还原酶突变体基因工程菌的方法包括以下步骤：(1)化学合成羰基还原酶突变体基因；(3)将目的基因经酶切后插入特定载体中，构建表达载体；(4)将表达载体转入大肠杆菌，获得重组基因工程菌。
本发明所述的羰基还原酶突变体在催化制备手性醇中的应用。
本发明中羰基还原酶的底物结构为
其中，r1为烷基cnh2n+1(n＝1-8)、苯基或取代苯基
r2为cnh2n+1(n＝1-2)。
特别的，将本发明的羰基还原酶用于催化还原2-氧代-4-苯基丁酸乙酯以制备普利类药物重要手性中间体(r)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯，反应式如下：
具体实施方式
实施例1基因工程菌的建立
根据genebank公布的光滑假丝酵母羰基还原酶基因(genbank:xm_444888.1)，化学合成该基因片段，以该基因片段为模板，通过pcr扩增扩展该片段(片段两侧加bamhⅰ和hindⅲ内切酶片段)其核苷酸序列如seqidno.3所示。并利用bamhⅰ和hindⅲ内切酶位点将基因插入pet-28a质粒中，将连接后的载体转入大肠杆菌bl21(de3)中建立羰基还原酶基因工程菌。其中pcr扩增羰基还原酶基因的引物为：正向引物f：ggcgcggatccactctactgccactttgaagc(seqidno.4)，反向引物r：cgcagaagcttaatgtagggaaaggtgacca(seqidno.5)。
实施例2羰基还原酶突变体基因的获得
本研究利用易错pcr方法对羰基还原酶进行了蛋白质工程改造。
50μlpcr反应体系为：10×扩增缓冲液5μl，4种dntp混合物(2.5mmol/l)各4μl，引物各50pmol，模板dna1.5μg，taqdna聚合酶0.5μl，mg2+2mmol/l，加双蒸水至50μl。
pcr扩增程序为：95℃预变性4min，94℃变性45s，55℃变性30s，72℃变性60s，进行30个循环；于72℃下继续延伸6min，冷却至4℃。
实验流程
按照实施例1的方法pcr扩增羰基还原酶基因并利用bamhⅰ和hindⅲ内切酶位点将基因插入至pet-28a质粒中，作为基因突变模板；易错pcr扩增转氨酶的基因，扩增后基因片段链接至pet-28a载体，将连接后的载体转入大肠杆菌bl21(de3)中建立转氨酶基因突变体库；利用大肠杆菌bl21(de3)为宿主，pet-28a质粒为载体，表达扩展转氨酶，高通量筛选高活性突变株；突变后对高活性转氨酶基因进行鉴定。筛选出的高活性转氨酶突变体基因的核酸序列如seqidno.1所示。
羰基还原酶基因引物为：正向引物f：ggcgcggatccactctactgccactttgaagc，反向引物r：cgcagaagcttaatgtagggaaaggtgacca。
按实施例1所述方法构建表达该羰基还原酶突变体的基因工程菌。
在获得突变体序列后，也可以通过化学合成方式合成该基因序列后利用bamhⅰ和hindⅲ内切酶位点将基因插入至pet-28a质粒中，再转化大肠杆菌构建基因工程菌。
实例3重组大肠杆菌的摇瓶培养
将实施例1和2所得的重组大肠杆菌分别接种至装有50ml含卡那霉素(35μg/ml)的lb培养基(蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，nacl10g/l，ph7.0)中，于37℃，200rpm的摇床中振荡培养5-10小时。转接1-3％菌体培养液至装有lb培养基(含卡那霉素35μg/ml)的250ml摇瓶中，置于同样条件下振荡培养。当菌液的od600值达到0.5-0.8时，加入终浓度为0.1-0.4mmol/l的诱导剂iptg，将培养液20℃诱导表达4-8小时。表达后通过离心(1000rpm，10min，4℃)收集菌体，并用磷酸缓冲液(ph6.0-7.0，20mmol/l)清洗两次，分散于同样的预冷的缓冲液中，于冰水浴中进行超声破碎。离心(10000rpm，20min，4℃)，弃菌体碎片，得到羰基还原酶或羰基还原酶突变体的粗酶液。
实施例4羰基还原酶活力的测定
以2-氧代-4-苯基丁酸乙酯为底物，hplc检测实施例3制备的重组转氨酶活性，从而筛选出能够表达具有最高转氨酶酶活的基因工程菌。使用岛津lc-20ad高效液相色谱仪，waterssymmetryc18色谱柱(150×3.9mm,5um)，流动相0.1％磷酸水溶液：乙腈＝60:40；检测波长210nm，流速1.0ml/min，柱温25℃。
酶活测定条件：反应体系总体积2ml，含有100mmol/lk2hpo4-kh2po4缓冲液(ph7.0)，2mmol/l2-氧代-4-苯基丁酸乙酯，0.2mmol/l葡萄糖，0.2mmol/lnadph，加入适量酶液，30℃水浴保温10min，反应结束后将酶灭活，测定底物2-氧代-4-苯基丁酸乙酯消耗量或产物(r)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的生成量。
酶活力单位(u)定义：在上述反应条件下，毎分钟催化还原1μmol/l2-氧代-4-苯基丁酸乙酯或催化合成1μmol/l(r)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯所需的酶量。
经检测，羰基还原酶突变体的酶活力为173.2u，比原始酶活提高了90％。
实施例5羰基还原酶的发酵制备
培养基成分为：甘油4.5g/l，蛋白胨18g/l，酵母提取物12g/l，nh4cl4.1g/l，na2hpo45.2g/l，nah2po44.2g/l，kcl0.6g/l，mgso40.2g/l，cacl20.0005g/l，mnso40.0005g/l，edta0.001g/l。发酵液通过加入氨水维持ph6.0-7.0，罐温30-37℃，搅拌转速400-1200rpm，发酵过程中控制do30％以上，空气流量1:1.5vvm。接入种子液的od600为0.4-1.2，接入量为发酵液体积的5％-15％，发酵液od600达20-50时加入终浓度为0.1-0.4mmol/l的以诱导羰基还原酶的表达，此后继续发酵10小时，罐温20-25℃。发酵过程中通过加入含甘油12g/l，蛋白胨20g/l，酵母提取物16g/l，nh4cl6g/l，kcl0.8g/l，mgso40.3g/l，cacl20.001g/l，mnso40.001g/l，的溶液维持培养物的生长。发酵结束后将培养物冷却至4℃保存。
将保存的发酵液经离心、细胞破碎、冷冻干燥等常规处理，制备得到羰基还原酶多肽冻干粉并于-80℃保存。
实施例7羰基还原酶催化合成(r)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯
在5l反应釜中，加入36g羰基还原酶粗酶液、12g葡萄糖脱氢酶冻干粉(自制)，1100g葡萄糖，2l磷酸缓冲液中(ph6.0-6.5)升温至25-28℃，搅拌15分钟后，分批加入550g2-氧代-4-苯基丁酸乙酯。搅拌反应11小时左右，至底物含量降至1％以下时终止反应。反应终止后经脱色、离心、萃取等操作，得到产物。((r)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯1hnmr(cdcl3,500mhz):δ1.27(t,3h,j＝7.1hz,och2ch3),1.95-2.05(m,1h,arch2chh),2.12–2.15(m,1h,arch2chh),2.75–2.80(m,2h,arch2),2.93(s,1h,oh),4.17–4.26(m,3h,och2ch3,choh),7.19-7.28(m,5h,ar-h)；13cnmr(cdcl3,125mhz):δ15,32,36,63,71,125,127,128,140,176.经hplc分析确定底物转化率98.1％，产物的ee99.5％。
产物ee值的具体分析条件为：waterssymmetryc18色谱柱(150×3.9mm,5um)，流动相0.1％磷酸水溶液：乙腈＝60:40；检测波长210nm，流速1.0ml/min，柱温25℃。
<110>江苏阿尔法药业有限公司
<120>一种羰基还原酶突变体及其在手性醇制备中的应用
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