一株高产蛋白的小球藻及其培养方法和应用与流程

本发明涉及一株高产蛋白的小球藻及其培养方法和应用，属于藻类生物技术领域。

背景技术：

微藻是一种能进行光合自养的微生物，在生态系统中处于初级生产者，在整个物质循环中作用巨大，生产效率高，发展前景诱人。微藻在生长过程中会吸收利用大量氮磷元素，因此可利用污水处理厂的后处理单元培养微藻进行脱氮除磷深度净化污水，早在1957年Oswald等就建议将微型藻类用来作为一种取代污水处理中的活性污泥的生物系统。此后建立在人工模式水体藻菌共生自净原理基础上的氧化塘技术得到广泛的应用和发展。另外，微藻还具有生长快、收获期短、富含油脂、光合利用效率高等特点，可以作为食品和生物能源的主要来源之一，也越来越受到人们的关注。

目前，有关利用微藻治理废水以及作为食品和生物能源的研究还相对较少，大多处在藻种筛选的实验室小试阶段，而且从已有报道来看，所利用的藻株普遍存在培养条件要求高、蛋白产量低、藻细胞壁相对较厚导致蛋白难以被有机体利用等问题，而难以实现广泛应用。因此，筛选优良的藻种对于解决上述问题具有重要的意义。

技术实现要素：

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一株高产蛋白的小球藻及其培养方法和应用。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

本发明的第一方面，提供一株小球藻，命名为小球藻(Chlorella sorokiniana)BL-ch1，已于2016年11月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：武汉市武昌珞珈山，其保藏编号为：CCTCC NO:M 2016626。

该藻株分离自山东泰安宁阳猪场的粪便池和粪污排放沟渠，藻株为单细胞，球形，细胞壁薄，细胞直径3-6μm。细胞绿色，色素体杯状，占细胞大部分,具有一个蛋白核。

本发明的第二方面，提供一株高产蛋白的小球藻的培养方法，步骤为：将藻株接种至培养基上，接种量为5-15％(优选为10％)，装液量为400-800mL/L(优选为600mL/L)，初始pH为6.0-8.0(优选为7.0)，培养温度28℃-33℃。

上述培养方法中，所述培养基的组成为：在朱氏10号培养基中添加1‰葡萄糖、0.1‰磷酸氢二钾、0.1‰尿素和0.1‰甘氨酸。

本发明的第三方面，提供上述小球藻在污水处理中的应用。

经试验验证，采用本发明的小球藻对污水中总氮的降解率最高可达94.31％，对总磷的降解率最高可达90.07％，对氨氮的降解率最高可达99.21％。对污水处理的效果极佳。

本发明的第四方面，提供上述小球藻在蛋白生产中的应用。具体应用方法为：将小球藻按上述培养方法进行培养，得到藻液；将藻液离心，浓缩，干燥，即得含有蛋白的藻粉。

上述小球藻在制备水产动物开口饵料和/或鱼粉替代品中的应用也是本发明的保护范围。

本发明的有益效果：

(1)本发明筛选得到的小球藻，其蛋白含量可以高达71％以上，而且，在高产蛋白的同时，本发明的小球藻对污水中总氮、总磷、氨氮的降解率高，可以用于蛋白生产、饲料制备、污水处理等多个领域。

(2)小球藻蛋白质含量相对较高，可作为单细胞蛋白的一个重要来源，但是，大多数微型绿藻都具有一层较厚纤维素的坚韧的细胞壁，从而影响了有机体对其蛋白质的利用，消化吸收率也随之降低。而本发明筛选得到的小球藻，其细胞壁薄，蛋白质的含量高，非常有利于有机体对小球藻蛋白质的吸收和利用。

附图说明

图1：本发明藻株的细胞形态显微照片；

图2：基于18S rDNA片段序列构建的最大简约(Maximum Parsimony)树；(框内标记的是待测样品序列)；

图3：小球藻在降解粪污水中的应用的试验装置图。

具体实施方式

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法、检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法、检测方法等。

实施例1：藻株的分离、筛选和鉴定

1样品采集

小球藻分离样品采集地点：山东泰安宁阳猪场的粪便池和粪污排放沟渠。

2藻株的分离、筛选

2.1试验材料：本实施例采用培养基为朱氏10号培养基，其固体培养基中添加1％(质量百分数)的琼脂，其液体培养基中不添加琼脂。培养基组成成分见表1。

表1朱氏10号培养基组成成分

2.2试验方法

2.2.1将采集的样品置于30℃光照培养箱中培养5-7天，待出现转绿后，用朱氏10号液体培养基进行10、50、100、500和1000倍梯度稀释，取稀释后样品100μL均匀涂布在朱氏10号固体培养基上，置于30℃光照培养箱中培养；培养过程中观察有单藻落生长时挑取单一藻落接入装有朱氏10号液体培养基的试管中；待转绿后取藻液镜检，选取纯种藻株进行扩繁。

2.2.2取经稀释的粪污水样300mL，装于1L三角烧瓶中，121℃高压灭菌30min，接入藻液100mL，于30℃，180r/min，连续培养5d，每隔24h取样一次，测定叶绿素、总磷、总氮、氨氮、亚硝酸盐等指标。

2.3指标测定

测定纯种藻株培养物中的叶绿素、总磷、总氮、氨氮、亚硝酸盐和蛋白含量。

上述指标的测定方法如下：

(1)总磷：钼酸铵分光光度法；

(2)总氮：过硫酸钾氧化法；

(3)氨氮：纳氏试剂比色法；

(4)亚硝酸盐：α-萘胺比色法；

(5)蛋白含量：凯氏定氮法；

(6)叶绿素：热乙醇法。

2.4试验结果

2.4.1藻株的分离纯化

经过分离纯化，得到7株单种藻株，编号为1-1、2-1、3-1、4-1、5-1、6-1、7-1。在光学显微镜100倍下，7株藻的细胞均为球形、单生，且可以看到细胞内含有较为明显的色素体，具备绿藻门的形态特征，初步鉴定此7株藻为绿藻。

2.4.2藻株的筛选

(1)总氮含量及其降解率的测定

结果见表2。

表2总氮含量(mg/L)及降解率测定

从表2可以看出：除5-1、7-1外，各藻株总氮降解率可达75％以上。

(2)总磷含量及其降解率的测定

结果见表3。

表3总磷含量(mg/L)及降解率测定

从表3可以看出：除4-1外，各藻株总磷降解率可达78％以上。

(3)氨氮含量及其降解率的测定

结果见表4。

表4氨氮含量(mg/L)及降解率测定

从表4可以看出各藻株氨氮降解率均较高。

(4)亚硝酸盐含量测定

结果见表5。

表5亚硝酸盐含量测定(mg/L)

从表5可以看出各藻株对亚硝酸盐没有明显作用。

(5)叶绿素含量测定

结果见表6。

表6叶绿素含量测定(μg/L)

从表6可以看出各藻株叶绿素含量持续增高，说明各藻株生长良好。

(6)蛋白含量及生物量测定

结果见表7。

表7蛋白含量及生物量

从表7可以看出6-1藻株蛋白含量可达67.9％。

由上述结果可以看出，藻株6-1蛋白含量最高，且总氮、总磷、氨氮的降解率可达75％以上。从而得到一株高产蛋白，并且对废水处理效果好的藻株，命名为BL-ch1。

3藻株的鉴定

3.1形态观察

藻株6-1的主要生物学特性为：藻株为单细胞，球形，细胞壁薄，细胞直径3-6μm。细胞绿色，色素体杯状，占细胞大部分。具有一个蛋白核。藻株细胞形态的显微照片如图1所示。

3.2分子鉴定

3.2.1方法

3.2.1.1采用CTAB(Cetyltrimethylammonium bromide)方法提取藻类基因组，并参考《Molecular systematics》，具体方法如下：

取10mL藻液，8000rpm离心10min，加入100μL TE，振荡悬浮细胞，再加入800μL裂解液和0.8μL β-巯基乙醇，迅速充分振荡混匀，置于65℃温浴30min，其间来回颠倒数次，再加入700μL氯仿，充分混匀，12000rpm离心5min，离心后将上清转移到新的离心管中，加入700μL结合缓冲液，充分混合均匀，再加入到离心吸附柱中去，放置1min，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，再加入700μL洗涤缓冲液，12000rpm离心1min，重复洗涤3次，最后一次12000rpm离心2min，充分除去洗涤缓冲液，取出离心吸附柱，将其套入一个干净的1.5mL离心管，并加入50μL洗脱缓冲液，放置1min后，于12000rpm离心1min，取出离心吸附柱，取10μL电泳。

3.2.1.2序列扩增和测定

PCR扩增并测定核编码核糖体18S rDNA片段序列。

50μL PCR反应体系包括：10×PCR buffer，0.2mM dNTP，2.5mM Mg²⁺，1U Taq酶，模板DNA，正反向引物，ddH₂O。反应程序为：95℃变性5min，然后按95℃30s，55℃30s，72℃1min程序34个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物在1.5％的琼脂糖胶中电泳。PCR产物经纯化后直接由华大基因公司进行测序。

3.2.1.3数据分析

利用Blast功能，将所得到的样品18S rDNA片段序列与GenBank数据库进行比较。下载GenBank上相似藻类的序列，利用Clustal X对基因序列进行比对，辅以SEAVIEW手工校正，采用MEGA5构建形态发育树，分析样品的系统发育位置。

3.2.2结果分析

3.2.2.1同源性比对

经测序，待鉴定的样品18S rDNA片段序列如SEQ ID NO.1所示，片段大小为1693bp。将此序列与NCBI Genbank数据库中的数据进行序列同源性比对，发现该藻株与Chlorella sorokiniana亲缘关系最近，序列同源性可达到100％。

3.2.2.2系统发育分析

基于18S rDNA片段序列构建的系统发育树(图2)显示待测样品Contig 1(即6-1藻株)与Chlorella sorokiniana亲缘关系密切，位于同一进化分支上。

根据显微观察和分子序列测序结果综合分析，表明待测样品为一种小球藻Chlorella sorokiniana，隶属于绿藻门(Chlorophyta)、绿藻纲(Chlorophyceae)、绿球藻目(Chlorococcales)、小球藻科(Chlorellaceae)、小球藻属(Chlorella)。

基于菌株的生物学特性分析和18s rDNA的同源性比对结果，藻株6-1鉴定为小球藻，命名为小球藻(Chlorella sorokiniana)BL-ch1，已于2016年11月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：武汉市武昌珞珈山，其保藏编号为：CCTCC M 2016626。

实施例2：本发明的小球藻生产蛋白中的应用

1蛋白含量测定所需藻粉量的确定

1.1试验材料

藻株：本发明实施例1筛选分离得到的小球藻(Chlorella sorokiniana)BL-ch1；

培养基：朱氏10号，配方：硝酸钠0.1g，磷酸氢二钾0.01g，硫酸镁0.25g，碳酸钠0.02g，硅酸钠0.025g，氯化铁0.008g，水1L。

1.2试验方法

生物量检测---称量瓶法；

蛋白含量检测---凯氏定氮法。

1.3试验步骤

配制朱氏10号培养基，接种藻株BL-ch1至培养基中，33℃培养5天，将藻液5000r/min离心5min，浓缩所得藻泥，用纯净水洗三遍，然后将藻泥全部移至称量瓶中，70℃烘干得藻粉，称量算生物量，藻粉测蛋白含量。

1.4试验结果

结果见表8。

表8藻粉质量与蛋白含量

由表8可以看出，小球藻BL-ch1蛋白含量为67％左右，0.13g-0.24g藻粉测得小球藻BL-ch1蛋白含量无明显差异。

2生产蛋白所用培养基的优化

2.1试验方法

在朱氏10号培养基的基础上，进一步添加葡萄糖、磷酸氢二钾、尿素、硝酸钾和甘氨酸，通过正交设计，对培养基的组方进行优化，正交设计的配方组成如表9所示。

表9正交设计配方组成

2.2试验结果

将本发明实施例1筛选分离得到的小球藻(Chlorella sorokiniana)BL-ch1接种至不同编号的培养基上，33℃培养5天，将藻液5000r/min离心5min，浓缩所得藻泥，用纯净水洗三遍，然后将藻泥全部移至称量瓶中，70℃烘干得藻粉，称量算生物量，藻粉测蛋白含量，结果见表10。

表10培养基配方优化

由表10可以看出，培养基优选的配方为配方9，配方组成为：朱氏10号培养基+1‰葡萄糖+0.1‰磷酸氢二钾+0.1‰尿素+0.1‰甘氨酸。采用优化后的培养基配方进行藻株的培养，相对于朱氏10号培养基进行培养，其生物量可提高47.54％，蛋白含量提高2.98％。

3高产蛋白小球藻培养条件的优化

3.1试验材料

藻株：本发明实施例1筛选分离得到的小球藻(Chlorella sorokiniana)BL-ch1；

培养基：优化后培养基配方：硝酸钠0.1g，磷酸氢二钾0.11g，硫酸镁0.25g，碳酸钠0.02g，硅酸钠0.025g，氯化铁0.008g，1g葡萄糖，0.1g尿素，0.1g甘氨酸水1L。

3.2试验方法

叶绿素检测---乙醇提取法；

生物量检测---称量瓶法；

蛋白含量检测---凯氏定氮法。

分别考察不同接种量、装液量、初始pH、培养温度对小球藻蛋白产量的影响。

3.3试验结果

3.3.1不同接种量、装液量对叶绿素的影响(连续培养5d)

表11不同接种量、装液量对叶绿素(μg/L)的影响

由表11可以看出，藻株的接种量优选为5％-10％，装液量以600mL/L为宜。

3.3.2不同接种量、装液量对生物量、蛋白含量的影响(连续培养5d)

表12不同接种量、装液量对生物量、蛋白含量的影响

由表12可以看出，不同接种量及装液量对藻株生物量及蛋白含量无显著影响。

3.3.3不同初始pH值对生长过程中pH值的变化(连续培养6d)

表13不同初始pH值对生长过程中pH值的变化

由表13可以看出，培养过程中pH值均成不断上升趋势，小球藻BL-ch1在生长过程中其pH值可达9以上。

3.3.4不同初始pH值对藻株叶绿素的影响(连续培养6d)

表14不同初始pH值对藻株叶绿素(μg/L)的影响

由表14可以看出，小球藻BL-ch1叶绿素先升后降，最适初始pH值为6.00。

3.3.5不同初始pH值对生物量、蛋白含量的影响

表15不同初始pH值对生物量、蛋白含量的影响

由表15可以看出，不同初始pH值对小球藻BL-ch1蛋白含量影响不显著，以初始pH值为7时略优。

3.3.6不同温度及培养条件对叶绿素的影响(连续培养6d)

表16不同温度及培养条件对叶绿素(μg/L)的影响

由表16可以看出，小球藻BL-ch1均在33℃下生长趋势最佳。

3.3.7不同温度及培养条件对生物量、蛋白含量的影响

表17不同温度及培养条件对生物量、蛋白含量的影响

由表17可以看出，小球藻BL-ch1在光照28℃时生物量及蛋白含量最高。

由此确定，高产蛋白小球藻BL-ch1最优的培养条件为：接种量10％，装液量600mL/L，初始pH值7.0，温度28℃-33℃。

4高产蛋白小球藻生长趋势及蛋白含量的测定

表18小球藻BL-ch1生长趋势及蛋白含量

由表18可以看出，pH值先低后高，生物量一直递增，第八天达到1.5660g/L，叶绿素含量变化趋势与生物量相同，蛋白含量逐渐升高，五天后基本保持在70％左右，最高可达71％。

5高产蛋白小球藻氨基酸含量分析

5.1试验材料

本发明制备的小球藻BL-ch1藻粉(藻液经5000转/min，5min离心，蒸馏水洗涤三次，65摄氏度过夜烘干所得)

5.2测定方法

样品制备成功后邮寄至山东大学进行氨基酸含量测定，所用仪器为日立L-8900型高速氨基酸自动分析仪。

5.3氨基酸分析报告

表19小球藻BL-ch1藻粉中氨基酸含量

结果显示所得小球藻含有氨基酸种类达17种。

5.4小球藻BL-ch1藻粉与鱼粉中氨基酸含量对比

表20小球藻BL-ch1藻粉与鱼粉中氨基酸含量对比

由表20可以看出，与鱼粉比较，藻株BL-ch1的缬氨酸、亮氨酸高于鱼粉，苏氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸与鱼粉相似，蛋氨酸、组氨酸低于鱼粉。

综上，本发明筛选的小球藻BL-ch1可以进行异养培养，且经过配方优化后蛋白含量最高可达69％以上，且含有17种氨基酸，其中两种氨基酸高于鱼粉中氨基酸含量，三种氨基酸含量基本与鱼粉中氨基酸含量接近。因此，本发明筛选的小球藻粉可以作为水产动物开口饵料、以及部分替代鱼粉。

实施例3：本发明的小球藻在降解粪污水中的应用

1实验设计

实验设计如表21所示。

表21小球藻降解粪污水试验设计

藻液的培养方法：藻株为本发明实施例1筛选的藻株BL-ch1，接种量为10％(体积分数)，装液量600mL/L，初始pH值7.0，温度28℃-33℃。

本次试验考虑粪污气味和采样方便，采用了带盖整理箱，用3L三角瓶做光照度差异对比，如图3所示。

2实验结果

2.1对总氮的降解(总氮含量mg/L)

结果如表22所示。

表22对总氮的降解结果

从表22中可以看出：处理4、5、6，即藻污比为1：1、4：1、8：1对总氮的降解率可达80％以上。

2.2对总磷的降解(总磷含量含量mg/L)

结果如表23所示。

表23对总磷的降解结果

从表23中可以看出：处理4、5、6对总磷的降解可达40％以上，其中处理5对总磷转化可达90％。

2.3对氨氮的降解(氨氮含量含量mg/L)

结果如表24所示。

表24对氨氮的降解结果

从表24可以看出：处理4、5、6即藻污比为1：1、4：1、8：1对氨氮的降解率可达90％以上。

2.4叶绿素的测定(叶绿素含量μg/L)

结果如表25所示。

表25叶绿素的测定结果

从表25可以看出：处理4、5、6叶绿素测定上虽然略有波动但是能体现出增长的趋势，结合培养物颜色变化，说明藻株生长良好。

综合考虑以上结果，本发明的小球藻BL-ch1在解磷、降氮时，总氮初始值应在400mg/L左右较为合适。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东宝来利来生物工程股份有限公司

<120> 一株高产蛋白的小球藻及其培养方法和应用

<130> 2016

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1693

<212> DNA

<213> 藻株6-1

<400> 1

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cccacctaga gga 1693