本发明属于微藻制备油脂领域，具体涉及一种培养微藻的方法。
背景技术：
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微藻是一类系统发生各异、个体较小、通常为单细胞或多细胞群体、能进行光合作用的水生低等植物。许多门类的微藻能够积累大量的储藏性油脂，研究表明：微藻储藏性油脂在生物能源、化妆品、药品、功能性食品、饲料添加剂等领域具有广阔的应用前景。
微藻在营养充足、环境适宜的条件下，并不能积累过多的储藏性油脂，只有在胁迫条件下(环境胁迫、营养胁迫)，细胞才可以大量、快速的积累储藏性油脂。微藻的上述特性，限制了其不能通过全营养培养模式获取含油量高的微藻生物质。大量研究表明：利用全营养培养模式培养微藻，虽然可以获得较高的生物质产量，但生物质的油脂含量较低，难以满足油脂提取的需要。可以提高微藻油脂含量的胁迫条件主要包括：低氮胁迫、低磷胁迫、高盐胁迫、高温胁迫、pH胁迫、激素、氧化剂、高光强胁迫等，上述胁迫条件中，氮胁迫的研究最为广泛，被研究机构用在微藻机理研究、获得少量含油藻粉中，目前尚未见发现在规模化养殖中的实例。
低氮胁迫有两种实现方式：“初始低氮胁迫”与“氮充足-氮饥饿两步法”。初始低氮胁迫是培养初期添加低浓度的氮元素，整个培养过程中不补加氮元素，低氮胁迫可以显著提高微藻细胞的含油量，但却明显抑制微藻的生长，对油脂总产量提升幅度有限，同时由于缺氮的影响，微藻细胞整体代谢过程紊乱，不利于微藻的长期、连续培养。氮充足-氮饥饿两步法首先利用全营养培养基培养微藻使其快速增殖，随后通过离心或过滤等方式收集藻细胞，再将收集的藻细胞重新接种至无氮或低氮的培养基中，进行氮饥饿或氮限制培养诱导微藻油脂的积累，收集藻细胞重新接种的过程能耗巨大，规模化放大后难以实现。因此，低氮胁迫的油脂诱导方式至今无法应用在微藻的规模化生产中。
磷元素是微藻正常生长所不可缺少的元素之一，它是构成细胞遗传物质(DNA和RNA)、能量货币(ATP)、还原力(NADPH)、细胞膜和某些蛋白质的主要元素，对微藻的脂质积累也有显著影响，降低磷源可以促进碳水化合物分解并向油脂转化，可显著提高油脂含量，磷是细胞遗传物质(DNA、RNA)的主要元素，低磷抑制细胞分裂。由于低磷条件下，对蛋白、色素代谢影响较小，通过低磷条件下的流加，可以在保证细胞正常生长的同时，显著提高油脂含量和产量，同时对微藻的长期、连续培养的影响较小。目前未见有通过低磷流加提高微藻油脂积累的相关报道。
如何有效培养微藻获得较高的油脂产率，目前国内外已公布了若干相关技术发明，但这些技术并不能很好的进行推广和使用，现举例对已公开的代表性技术发明进行描述：
(1)用于小球藻异养培养的低磷培养基(CN200710047684.0)，该发明涉及一种用于小球藻异养培养的低磷培养基，培养基中KH2PO4浓度为10-1000mg/L，KH2PO4的用量仅为原Basal配方的1.6％-16％，但小球藻培养的接种量、比生长速率、生物量产量、生长趋势、培养时间达到原Basal培养的相当水平。该专利属于异养培养模式，异养培养与光自养培养在营养需求方面存在较大的差异。该专利与本发明专利在技术和保护范围上并不存在冲突。
(2)一种提高微藻产油量的培养方法(CN201410386845.9)，该发明公开了一种提高微藻产油量的培养方法。在微藻培养基中加入终浓度为0.35-12mM的过氧化氢(H2O2)，诱导微藻油脂迅速积累。该方法可缩短培养周期，降低生产成本、对环境友好、操作方便、效果明显，适用于微藻产油规模化培养。该专利所获得微藻粉的安全性有待进一步评估，且与本发明专利在技术和保护范围上并不存在冲突。
(3)用兼养和富氮-缺氮两阶段培养策略提高产油微藻生物量和油脂累积的方法(CN201110192159.4)，该发明向自养培养基中添加一定浓度的有机碳源葡萄糖,和作为自养碳源的CO2进行兼养培养。同时在富氮条件下，将微藻高密度培养到稳定期后，将藻液转接到缺氮培养基中继续培养。该方法难以进行规模化放大，且与本发明专利在技术和保护范围上并不存在冲突。
(4)一种提高微藻油脂产量的pH两阶段调节培养方法(CN201310492806.2)，该发明公开了一种提高微藻油脂产量的pH两阶段调节培养方法，第一阶段使培养基的pH固定在最适合藻类生长的值，来获得最大生物量的积累；第二阶段则使培养基的pH固定在最适合该藻体油脂积累的值，来获得最大油脂积累量,这样就可以在最大生物量的基础上争取最大的油脂积累量，即得到最大的总油脂含量，提高生物柴油产量。该技术可能存在藻种适应性问题，提高并固定pH控制成本高，难以进行推广，且与本发明专利在技术和保护范围上并不存在冲突。
(5)一种提高微藻油脂产率的方法(CN201410441942.3)，首先将微藻在存在植物激素的改良培养基中进行光自养培养，到稳定期后将离心获得的藻体作为种子在胁迫培养基中进行光胁迫、氮胁迫培养。这一技术获得藻泥的安全性有待进一步评估，同时存在离心收获藻体的高成本过程，难以进行放大推广，且与本发明专利在技术和保护范围上并不存在冲突。
(6)一种促进自养微藻中性脂累积的培养方法(CN201310331939.1)，将处于增殖后期,具有中性脂累积代谢能力的微藻处于400-550nm光波条件下进行中性脂累积培养，该技术难以进行户外规模化应用，且与本发明专利在技术和保护范围上并不存在冲突。
(7)一种高温胁迫微藻快速积累油脂的方法(CN201510657796.2),在反应器中培养微藻，直至所述微藻的生长进入对数生长期末期，将上述微藻在高温环境中胁迫培养1-2天，离心，即得高油脂含量微藻，该技术高温控制成本高，技术难度打，难以进行户外规模化应用，且与本发明专利在技术和保护范围上并不存在冲突。
(8)一种促进微藻藻体快速积累油脂的方法(CN201410649618.0)，通过加入激素使油脂含量增加，一种促进微藻油脂积累的培养方法(CN201510219454.2)添加N-环己基-2-氨基乙磺酸提高微藻油脂产量，这两种方法获得藻粉的安全性和环境的安全性需要进一步评估，且与本发明专利在技术和保护范围上并不存在冲突。
(9)养殖微藻的方法及生产油脂的方法(CN201310229352.X)，接种后的藻液采用超高氮源培养，以氮原子计的氮肥浓度大于30mmol/L，光自养培养＞10天收获，该专利可能存在藻种的适应性、成本过高和环境安全问题，且与本发明专利在技术和保护范围上并不存在冲突。
由此可见，现有技术的缺点如下
(1)油脂产量低。初始低氮胁迫虽然可以获得较高的生油脂含量，却无法获得高的生物质产量，微藻油脂产量等于生物质含油量与生物质产量的乘积，因此，初始低氮胁迫最终无法获得高的油脂产量。
(2)成本高，实现困难。“氮充足-氮饥饿两步法”虽然分步解决了微藻细胞高含油量与低油脂产量之间的矛盾，但在两步之间却需要能耗巨大的收集藻细胞的过程，这一方法在小规模研究中可行，但用于规模化养殖却难以实现。
(3)初始低磷胁迫也可以提高油脂含量，但磷缺乏也会严重影响微藻生长，低磷胁迫的技术局限性与低氮胁迫一致，难以解决微藻细胞含油量、生物量与油脂产率之间的矛盾，因此规模化应用存在困难。
技术实现要素：
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本发明的目的是提供一种能够保证微藻油脂含量快速增加的同时，获得较高的生物量产率的培养微藻的方法。
本发明的培养微藻的方法，其特征在于，将微藻接种到培养基中培养，在培养过程中流加或分批补加无机磷至培养结束。
所述的微藻为但不限于单细胞绿藻与真眼点藻。
培养基为培养微藻的海水培养基或淡水培养基。
微藻的培养模式可以为三角瓶、开放池或光生物反应器。优选，当为三角瓶或开放池模式培养时，所述培养基，以NaH2PO4·2H2O计算磷，初始含有磷浓度为0-4mg L-1，更优为0-2mg L-1，当为光生物反应器时，初始磷浓度为0-16mg L-1，较优浓度为0-8mg L-1；所述的将微藻接种到培养基中培养是将OD700在0.1-1.0之间的微藻液接种到培养基中培养；所述的在培养过程中流加或分批补加无机磷至培养结束，是自微藻接种到培养基中培养2-4天后再流加或分批补加无机磷。
所述的分批补加无机磷，其添加磷的量，以NaH2PO4·2H2O计算磷，其添加的量是每天每升培养基补入0.1-3mg L-1。
所述的无机磷优选为磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸等含无机磷化合物中的任意一种或几种的混合物。
所述的培养结束，其时间的确认是当微藻总脂含量与生物量不再继续增加时，停止补加无机磷，较优的三角瓶培养周期为6-10天，较优的光生物反应器的培养周期为10-16天，较优的开放池培养时间为10-20天。
优选，当所述的微藻为单细胞绿藻，培养基初始含有2mg L-1NaH2PO4·2H2O，从第2天起，每天补加1mg L-1NaH2PO4·2H2O至培养结束。
优选，当所述的微藻为真眼点藻，培养基初始含有8mg L-1NaH2PO4·2H2O，从第4天起，每天补加2mg L-1NaH2PO4·2H2O至培养结束。
培养结束后，通过采收与清洗过程，获得高含油量的藻泥。通过离心、过滤、絮凝沉降等方式收获藻细胞，并经过清洗，获得高含油量的藻泥，获得的藻泥可用在食品保健、饲料、生物能源和化妆品等领域。
本发明通过大量的研究，充分考虑微藻生长以及油脂积累特性，提出一种低磷流加培养微藻获得油脂的方法，能够保证微藻油脂含量快速增加的同时，获得较高的生物量产率，有效解决了微藻细胞含油量、生物量与油脂产率之间的矛盾，大幅提高微藻油脂的生产效率，可以应在微藻的规模化养殖过程中，获得的藻泥可用在食品保健、饲料、生物能源和化妆品等领域。
具体实施方式：
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1：低磷流加法培养单细胞绿藻提高细胞油脂产率
设置以下10个磷处理组，其中处理组1-4为一次性磷添加组，处理组5-10为低磷流加组，具体如下：
1组：培养初始一次性添加0.5mg L-1NaH2PO4·2H2O至培养基中；
2组：培养初始一次性添加1mg L-1NaH2PO4·2H2O至培养基中；
3组：培养初始一次性添加2mg L-1NaH2PO4·2H2O至培养基中；
4组：培养初始一次性添加50mg L-1NaH2PO4·2H2O至培养基中；
5组：初始的培养基中NaH2PO4·2H2O浓度为1mg L-1，从第2天起，每天补加1mg L-1NaH2PO4·2H2O至培养结束(具体是初始的培养基中含有1mg L-1NaH2PO4·2H2O，从第2天起，每天补加一次NaH2PO4·2H2O，使培养基中的NaH2PO4·2H2O浓度每天增加1mg L-1至培养结束)；
6组：初始的培养基中NaH2PO4·2H2O浓度为1mg L-1，从第2天起，每2天补加1mg L-1NaH2PO4·2H2O至培养结束(具体是初始的培养基中含有1mg L-1NaH2PO4·2H2O，从第2天起，每2天补加一次NaH2PO4·2H2O，使培养基中的NaH2PO4·2H2O浓度每2天增加1mg L-1至培养结束)；
7组：初始的培养基中NaH2PO4·2H2O浓度为1mg L-1，从第2天起，每3天补加1mg L-1NaH2PO4·2H2O至培养结束(具体是初始的培养基中含有1mg L-1NaH2PO4·2H2O，从第2天起，每3天补加一次NaH2PO4·2H2O，使培养基中的NaH2PO4·2H2O浓度每3天增加1mg L-1至培养结束)；
8组：初始的培养基中NaH2PO4·2H2O浓度为2mg L-1，从第2天起，每天补加1mg
L-1NaH2PO4·2H2O至培养结束(具体是初始的培养基中含有2mg L-1NaH2PO4·2H2O，从第2天起，每天补加一次NaH2PO4·2H2O，使培养基中的NaH2PO4·2H2O浓度每天增加1mg L-1至培养结束)；
9组：初始的培养基中NaH2PO4·2H2O浓度为2mg L-1，从第2天起，每2天补加1mg L-1NaH2PO4·2H2O至培养结束(具体是初始的培养基中含有2mg L-1NaH2PO4·2H2O，从第2天起，每2天补加一次NaH2PO4·2H2O，使培养基中的NaH2PO4·2H2O浓度每2天增加1mg L-1至培养结束)；
10组：初始的培养基中NaH2PO4·2H2O浓度为2mg L-1，从第2天起，每3天补加2mg L-1NaH2PO4·2H2O至培养结束(具体是初始的培养基中含有2mg L-1NaH2PO4·2H2O，从第3天起，每3天补加一次NaH2PO4·2H2O，使培养基中的NaH2PO4·2H2O浓度每3天增加2mg L-1至培养结束)；
除磷元素(NaH2PO4·2H2O)外，培养基组成为：3g L-1NaHCO3；0.5g L-1NaNO3；0.02g L-1CaCl2；0.05g L-1MgSO4·7H2O；0.1g L-1KCl；1mL L-1A5solution；1mL L-1EDTA-Fe3+，水为溶剂，按各成分含量将上述成分混合均匀灭菌即可；A5solution：2.86g L-1H3BO3，1.80g L-1MnCl2·4H2O，0.22g L-1ZnSO4·7H2O，0.08g L-1CuSO4·5H2O，0.39g L-1Na2MoO4·2H2O，水为溶剂，按各成分含量将上述成分混合均匀灭菌即可。
OD700在0.5的微藻液接种到培养基中培养，培养温度为24±1℃，光照强度约为120μmol·m-2·s-1，24小时持续光照，三角瓶静置培养时间为9天(微藻总脂含量与生物量不再继续增加时)。
由表1可知，磷流加组(处理组5-10)的油脂产率明显高于磷一次性添加组(1-4)，初始2mg L-1NaH2PO4·2H2O，每天补加1mg L-1NaH2PO4·2H2O，油脂产量达到0.35g L-1，相对于初始批次添加组显著提高。
表1
实施例2低磷流加法培养真眼点藻提高细胞油脂产率
设置以下5个磷处理组，其中处理组1与处理组2为批次磷添加组，处理组3，4，5为低磷流加组，具体如下：
1组：培养初始一次性添加8mg L-1NaH2PO4·2H2O至培养基中；
2组：培养初始一次性添加40mg L-1NaH2PO4·2H2O至培养基中；
3组：初始的培养基中NaH2PO4·2H2O浓度为8mg L-1，从第4天起，每天补加1mg L-1NaH2PO4·2H2O至培养结束(具体是初始的培养基中含有8mg L-1NaH2PO4·2H2O，从第4天起，每天补加一次NaH2PO4·2H2O，使培养基中的NaH2PO4·2H2O浓度每天增加1mg L-1至培养结束)；
4组：初始的培养基中NaH2PO4·2H2O浓度为8mg L-1，从第4天起，每天补加2mg L-1NaH2PO4·2H2O至培养结束(具体是初始的培养基中含有8mg L-1NaH2PO4·2H2O，从第4天起，每天补加一次NaH2PO4·2H2O，使培养基中的NaH2PO4·2H2O浓度每天增加2mg L-1至培养结束)；
5组：初始的培养基中NaH2PO4·2H2O浓度为8mg L-1，从第4天起，每天补加3mg L-1NaH2PO4·2H2O至培养结束(具体是初始的培养基中含有8mg L-1NaH2PO4·2H2O，从第4天起，每天补加一次NaH2PO4·2H2O，使培养基中的NaH2PO4·2H2O浓度每天增加3mg L-1至培养结束)；
所述的培养基是改良的f/2培养基，培养于柱式光合生物反应器中，改良的f/2培养基采用南海海域上层海水配，除磷元素外，其于培养基组成为：0.5g L-1NaHCO3，0.1g L-1NaNO3，4.36mg L-1Na2EDTA，3.16mg L-1FeCl3.6H2O，0.01mg L-1CuSO4·5H2O，0.023mg L-1ZnSO4·7H2O，0.012mg L-1CoCl2·6H2O，0.18mg L-1MnCl·4H2O，0.07mg L-1Na2MoO4·2H2O，溶剂为南海海域上层海水，按上述成分和含量将上述成分混合均匀灭菌即可。
OD700在0.5的微藻液接种到培养基中培养，培养体系为300mL，24小时连续光照培养，培养周期为16d(微藻总脂含量与生物量不再继续增加时)，光照强度为300μmol·m-2·s-1。盐度控制25‰，温度控制24±1℃，通过连续补加1.0％CO2压缩气控制培养基的pH在7.5-8.0之间。
由表2可知，磷流加组(处理组3-5)的油脂产率明显高于磷一次性添加组(1，2)，在起始8mg L-1，从第4天开始，每天流加2mg L-1的NaH2PO4·2H2O可以使脂质产量高达2.03g L-1。
表2